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toxR基因作为荧光定量PCR靶基因设计TaqMan探针快速检测副溶血弧菌 被引量:28
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作者 覃倚莹 吴晖 +4 位作者 肖性龙 杨晓泉 张经纬 余以刚 李惠芳 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第10期1837-1842,共6页
以toxR基因为靶基因,通过优化反应条件建立了快速检测副溶血弧菌的TaqMan实时荧光PCR方法。特异性试验表明,该方法能选择性检测副溶血弧菌,而与金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单增李斯特杆菌等多种常见的食源性病原菌没有交叉反应;灵敏度... 以toxR基因为靶基因,通过优化反应条件建立了快速检测副溶血弧菌的TaqMan实时荧光PCR方法。特异性试验表明,该方法能选择性检测副溶血弧菌,而与金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单增李斯特杆菌等多种常见的食源性病原菌没有交叉反应;灵敏度试验表明,该方法最少可检测到25个拷贝的toxR基因重组质粒,对纯培养物和模拟食品样品直接检测的灵敏度分别为21 cfu/mL和210 cfu/g;重复性试验表明,同一样品于试验内及试验间的变异系数分别为0.9%和1.3%;所制作的标准曲线在2.5×101~2.5×106拷贝数之间有较好的线性关系,能对副溶血弧菌进行准确的定量分析。结果表明,本研究所建立的副溶血弧菌实时荧光PCR检测方法具有特异性好、灵敏度高、重复性好的特点,能进行定量检测,而且检测时间从核酸抽提到出实验结果仅需要3 h,是快速检测副溶血弧菌的有效手段。 展开更多
关键词 副溶血性弧菌 实时荧光定量PCR toxr基因 TAQMAN探针 检测
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基于toxR基因病原哈氏弧菌PCR检测方法的建立 被引量:8
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作者 姚东瑞 朱明 +3 位作者 陈丽 毕可然 史爱琴 张晓君 《水产科学》 CAS 北大核心 2011年第9期559-562,共4页
基于toxR基因序列设计检测哈氏弧菌的1对特异性引物,通过PCR反应条件优化、PCR反应特异性及敏感性检测,建立一种哈氏弧菌的特异性分子检测方法。试验结果表明,该引物可使哈氏弧菌扩增出大小为390 bp的toxR基因片段,3种水产动物病原弧菌... 基于toxR基因序列设计检测哈氏弧菌的1对特异性引物,通过PCR反应条件优化、PCR反应特异性及敏感性检测,建立一种哈氏弧菌的特异性分子检测方法。试验结果表明,该引物可使哈氏弧菌扩增出大小为390 bp的toxR基因片段,3种水产动物病原弧菌未扩增出任何条带,敏感性检测结果为该PCR反应最低能检测出0.375 ng/μl的哈氏弧菌基因组DNA。该试验建立的基于toxR基因的哈氏弧菌的PCR检测方法可用于哈氏弧菌引起的水产动物疾病的快速诊断及海产品安全检测。 展开更多
关键词 toxr基因 哈氏弧菌 PCR检测
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基于toxR基因的河流弧菌PCR快速检测方法的建立 被引量:7
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作者 文万侥 谢珍玉 +3 位作者 徐先栋 张新中 张世秀 周永灿 《水产科学》 CAS 北大核心 2009年第10期575-578,共4页
基于河流弧菌的toxR基因设计了6对引物,分别为F1、F2、F3、F4、F5、F6。以标准河流弧菌HL01、HL02、HL03、HL04做梯度PCR检测。试验结果表明,仅F2和F4能获得分子量分别为332 bp和358 bp的目的条带。利用其他27株非河流弧菌进行PCR特异... 基于河流弧菌的toxR基因设计了6对引物,分别为F1、F2、F3、F4、F5、F6。以标准河流弧菌HL01、HL02、HL03、HL04做梯度PCR检测。试验结果表明,仅F2和F4能获得分子量分别为332 bp和358 bp的目的条带。利用其他27株非河流弧菌进行PCR特异性检测,结果表明,引物F2和F4的特异性较强,但F2和F4这两对引物的灵敏度也有一定的差异,F2的灵敏为9.3×103cfu/ml,F4的灵敏度为9.3×102cfu/ml。 展开更多
关键词 河流弧菌 toxr基因 PCR
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基于lolB和toxR基因的水产品中霍乱弧菌双重PCR检测方法 被引量:4
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作者 秦国民 张晓君 +2 位作者 毕可然 阎斌伦 秦蕾 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2011年第22期273-275,共3页
选择lolB和toxR两种基因序列设计2对特异性引物,建立一种针对霍乱弧菌所有生物型菌株的双重PCR检测方法,扩增目的片段大小分别为519bp和779bp。结果表明:在同步扩增中,仅霍乱弧菌模板可同时扩增出2种基因片段,4株对照菌模板无任何扩增条... 选择lolB和toxR两种基因序列设计2对特异性引物,建立一种针对霍乱弧菌所有生物型菌株的双重PCR检测方法,扩增目的片段大小分别为519bp和779bp。结果表明:在同步扩增中,仅霍乱弧菌模板可同时扩增出2种基因片段,4株对照菌模板无任何扩增条带;敏感性检测结果显示,该双重PCR最低能检测3.42×103CFU/mL菌落数的霍乱弧菌。所建立的基于lolB和toxR两种基因的双重PCR检测方法特异性强、敏感性高、方法简单、用时短,可用于霍乱弧菌检测。 展开更多
关键词 霍乱弧菌 lolB基因 toxr基因 双重PCR
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食品中副溶血性弧菌toxR和tdh基因双色荧光PCR检测方法的建立 被引量:4
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作者 曹冬梅 袁慕云 +1 位作者 许龙岩 曹际娟 《食品安全质量检测学报》 CAS 2013年第5期1451-1457,共7页
目的建立对副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)特异性检测toxR(跨膜转录激活蛋白)基因和tdh(热稳定性直接溶血素)毒力基因的Taqman探针双色荧光PCR检测方法。方法根据副溶血性弧菌toxR基因和tdh基因,分别设计引物和探针,建立Taqman... 目的建立对副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)特异性检测toxR(跨膜转录激活蛋白)基因和tdh(热稳定性直接溶血素)毒力基因的Taqman探针双色荧光PCR检测方法。方法根据副溶血性弧菌toxR基因和tdh基因,分别设计引物和探针,建立Taqman探针双色荧光PCR扩增体系,进行特异性、灵敏度试验;对副溶血性弧菌分离菌株实施检测,了解其tdh基因和tdh基因分布情况。结果结果表明,副溶血性弧菌标准菌株和3株从食物中毒患者中分离获得的分离株均出现toxR基因和tdh扩增曲线,而溶藻弧菌、单增李斯特菌等31株弧菌属其他菌株和肠杆菌科的菌株未见扩增曲线。从食品中分离的37株副溶血性弧菌分离株均未携带tdh毒力基因。副溶血性弧菌检测灵敏度可达到3.6×102cfu/mL。结论该方法可用于同时检测食品中副溶血性弧菌的特异性和毒力基因。 展开更多
关键词 副溶血性弧菌 toxr基因 tdh基因 双色荧光PCR 检测
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拟态弧菌全长toxR基因的克隆和序列分析 被引量:2
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作者 王青柏 胡超群 +1 位作者 罗鹏 任春华 《热带海洋学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第3期50-54,共5页
对克隆的拟态弧菌Vibrio mi micus的全长toxR基因及进行相关的序列分析。根据已发表的其他几种弧菌toxR基因两翼核苷酸序列,设计和合成上下游简并引物,以拟态弧菌1.1969标准株的基因组DNA为模板进行PCR扩增,将获得的1.3kb扩增片断进行... 对克隆的拟态弧菌Vibrio mi micus的全长toxR基因及进行相关的序列分析。根据已发表的其他几种弧菌toxR基因两翼核苷酸序列,设计和合成上下游简并引物,以拟态弧菌1.1969标准株的基因组DNA为模板进行PCR扩增,将获得的1.3kb扩增片断进行克隆、鉴定和测序,并将该序列提交至GenBank(登录号为EF693743)。首次获得拟态弧菌840bptoxR基因全长核苷酸序列。与其它弧菌的相应序列分析比对显示,该序列与霍乱弧菌Vibrio cholerae的toxR基因有87%—88%的相似性,与鳗弧菌Vibrio anguillarum的toxR基因有75%的相似性,与副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus的toxR基因有45%的相似性。该基因编码1个含有279个氨基酸残基的蛋白质,其分子量为31.13kDa,等电点为5.35,并含有一个典型的转录激活区和一个跨膜区。系统发育树分析表明,几种常见致病性弧菌的toxR基因序列存在较大分歧,拟态弧菌能较容易与进化相近的霍乱弧菌鉴别区分开来。toxR基因全长核苷酸序列的获得将为拟态弧菌的菌种鉴定增添新的分子靶标,有助于其结构和功能的研究及通过突变分析鉴定出新的受toxR基因调控的致病基因。 展开更多
关键词 拟态弧菌 toxr基因 致病性弧菌
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霍乱弧菌毒力表达调控基因toxR的PCR扩增及克隆 被引量:1
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作者 陈建平 马莹 +1 位作者 杨双会 王雅静 《华西医科大学学报》 CAS CSCD 2000年第1期27-29,共3页
为了构建霍乱弧菌和杜氏利什曼原虫双价口服活疫苗候选株 ,作者采用 PCR对霍乱弧菌毒力表达调控基因 tox R进行扩增及克隆 ,并对霍乱弧菌 tox R基因进行限制性酶切分析。结果显示 :7株霍乱弧菌均扩增出 1 .3kb的 tox R基因片段 ,tox R... 为了构建霍乱弧菌和杜氏利什曼原虫双价口服活疫苗候选株 ,作者采用 PCR对霍乱弧菌毒力表达调控基因 tox R进行扩增及克隆 ,并对霍乱弧菌 tox R基因进行限制性酶切分析。结果显示 :7株霍乱弧菌均扩增出 1 .3kb的 tox R基因片段 ,tox R基因中部含有 Eco R 酶切位点 ,再将 tox R基因克隆在质粒 p AT1 5 3上 ,对所获的重组质粒 pt R4进行限制性酶切分析 ,证实质粒 pt R4插入的 1 .3kb的 DNA片段为 tox 展开更多
关键词 霍乱弧菌 毒力表达 调控基因 toxr基因
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ToxR Is Required for Biofilm Formation and Motility of Vibrio Parahaemolyticus 被引量:3
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作者 CHEN Long QIU Yue +6 位作者 TANG Hao HU Ling Fei YANG Wen Hui ZHU Xiao Jue HUANG Xin Xiang WANG Tang ZHANG Yi Quan 《Biomedical and Environmental Sciences》 SCIE CAS CSCD 2018年第11期848-850,共3页
Vibrio parahaemolyticus, the leading cause of seafood-borne gastroenteritis, has the ability to form biofilms on biotic and abiotic surfaces. Biofilm formation is a complicated process involving many specific structur... Vibrio parahaemolyticus, the leading cause of seafood-borne gastroenteritis, has the ability to form biofilms on biotic and abiotic surfaces. Biofilm formation is a complicated process involving many specific structures and regulatory processes. The most significant of the structures and processes include polar and lateral flagella, mannose-sensitive hemagglutinin typeⅣpili, chitin-regulated pili,capsular polysaccharide (CPS), exopolysaccharide 展开更多
关键词 WT FIGURE CPS toxr Is Required for Biofilm Formation and Motility of Vibrio Parahaemolyticus
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基于blaCARB-17和toxR基因的副溶血弧菌双重PCR检测方法的建立 被引量:1
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作者 胡元庆 林凯玲 +1 位作者 周赞虎 李凤霞 《食品工业科技》 CAS 北大核心 2020年第19期132-136,共5页
建立一种针对副溶血弧菌bla_(CARB-17)和toxR基因的双重PCR检测方法。按照副溶血弧菌的bla_(CARB-17)和toxR基因序列设计并合成引物,于同一反应体系中进行PCR扩增,优化退火温度、退火时间和引物比例,确定双重PCR的特异性和灵敏性,最后... 建立一种针对副溶血弧菌bla_(CARB-17)和toxR基因的双重PCR检测方法。按照副溶血弧菌的bla_(CARB-17)和toxR基因序列设计并合成引物,于同一反应体系中进行PCR扩增,优化退火温度、退火时间和引物比例,确定双重PCR的特异性和灵敏性,最后用实验室分离鉴定的副溶血弧菌分离株验证。结果表明:建立的双重PCR最佳退火条件是52℃30 s,引物比例1∶1,在同一体系中特异地扩增出副溶血弧菌的bla_(CARB-17)和toxR基因的303、350 bp片段,其它对照菌株均无扩增,表明该方法特异性良好。双重PCR的最低检测限达1×10~2 CFU/mL,对实验室鉴定的56个副溶血弧菌分离株验证均为阳性。建立的双重PCR方法操作简单、高效快速、特异性强,适用于副溶血弧菌的检测。 展开更多
关键词 副溶血弧菌 双重PCR bla_(CARB-17)基因 toxr基因 退火温度 退火时间 引物比例
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基于toxR基因的SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测病原副溶血弧菌方法的建立 被引量:8
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作者 张晓君 梁利国 +2 位作者 阎斌伦 毕可然 秦国民 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第4期543-547,共5页
基于副溶血弧菌toxR基因保守序列设计1对特异性引物,建立了SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测副溶血弧菌的方法。常规PCR检测,副溶血弧菌扩增出大小为368bp的目的片段,其他4种病原细菌均为阴性;SYBRGreenⅠ实时定量PCR扩增曲线反映了PCR的指... 基于副溶血弧菌toxR基因保守序列设计1对特异性引物,建立了SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测副溶血弧菌的方法。常规PCR检测,副溶血弧菌扩增出大小为368bp的目的片段,其他4种病原细菌均为阴性;SYBRGreenⅠ实时定量PCR扩增曲线反映了PCR的指数增长阶段和平台阶段;在Tm为85℃,扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体;所制作的标准曲线在2.7×108~2.7×102拷贝数之间有较好的线性关系,相关系数为0.998,能对副溶血弧菌进行准确的定量分析;该方法检测时间从核酸抽提到结果分析仅需4~5h,较传统方法敏感、操作简单,耗时短,是副溶血弧菌引起的水产动物疾病的快速诊断及食品中针对副溶血弧菌安全检测的有效手段。 展开更多
关键词 副溶血弧菌 toxr基因 SYBR GreenⅠ REAL-TIME PCR
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霍乱弧菌毒力表达调控基因toxR缺失株的构建及其功能的研究 被引量:4
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作者 陈建平 高守一 +2 位作者 刘延清 祁国明 何九芽 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2001年第1期1-5,共5页
目的 通过构建霍乱弧菌toxR基因缺失株来研究toxR基因对霍乱弧菌减毒菌株IEM10 1和高产毒株 5 6 9B毒力表达的调控作用。方法 采用自杀性质粒和接合转移技术 ,将 2个中间含有四环素基因的toxR基因分别与霍乱弧菌减毒株IEM10 1和高产毒... 目的 通过构建霍乱弧菌toxR基因缺失株来研究toxR基因对霍乱弧菌减毒菌株IEM10 1和高产毒株 5 6 9B毒力表达的调控作用。方法 采用自杀性质粒和接合转移技术 ,将 2个中间含有四环素基因的toxR基因分别与霍乱弧菌减毒株IEM10 1和高产毒株 5 6 9B染色体toxR基因重组 ,从而获得toxR基因缺失株IEM10 1 4和 5 6 9B 43 ,并对 2个toxR基因缺失株和其原出发菌株的霍乱肠毒素的产率和主要外膜蛋白图谱进行比较。结果 采用GM1 ELISA检测受测菌CT基因表达 ,toxR基因缺失株 5 6 9B 43的P/N值为 1 82 ,而其原出发菌株 5 6 9B的P/N为 4 5 2 ,而IEM10 1和其toxR基因缺失株的P/N值均低于 2。采用SDS PAGE对受试菌外膜蛋白进行分析 ,toxR基因缺失株 5 6 9B和IEM10 1的外膜蛋白图谱相比 ,均多出 2条相对分子质量 (Mr)为 40× 10 3 和 43× 10 3 外膜蛋白区带。结论 toxR蛋白是霍乱肠毒素基因ctx表达的正调控因子 ,是霍乱弧菌主要外膜蛋白 (Mr 为 40× 10 3 和43× 10 3)编码基因的负调控因子。 展开更多
关键词 霍乱弧菌 毒力 基因表达 toxr基因缺失株
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基于toxR和rtxA基因水生动物2种病原弧菌的同步检测方法的建立 被引量:1
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作者 白雪松 张晓君 +2 位作者 阎斌伦 毕可然 秦蕾 《海洋湖沼通报》 CSCD 北大核心 2013年第3期95-100,共6页
本研究选择副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的toxR和霍乱弧菌(Vibrio cholerae)的rtxA基因序列设计2对特异性引物,建立了在同一反应体系中同步检测2种病原菌的双重PCR检测方法,扩增目的片段大小分别为368bp和417bp。特异性试验结... 本研究选择副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的toxR和霍乱弧菌(Vibrio cholerae)的rtxA基因序列设计2对特异性引物,建立了在同一反应体系中同步检测2种病原菌的双重PCR检测方法,扩增目的片段大小分别为368bp和417bp。特异性试验结果表明,在同一反应体系下,副溶血弧菌和霍乱弧菌扩增出目的条带,其他4种对照病原细菌无任何扩增条带;单一及双重PCR敏感性试验结果表明,稀释浓度在(109~102)CFU/mL,单一PCR与双重PCR均可扩增出目的条带,且单一PCR与双重PCR表现出了相同的灵敏度(102 CFU/mL),表明本实验优化的双重PCR反应条件良好;人工染菌样品均可扩增出两条目的条带,表明该方法可直接用于针对病原副溶血弧菌和霍乱弧菌感染的水生动物疾病的检测以及水产品的安全检测,在水产品致病菌的风险评估和大规模样本的分析检测领域具有较高的潜在应用价值。 展开更多
关键词 副溶血弧菌 霍乱弧菌 toxr基因 rtxA基因 双重PCR
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基于tlh和toxR基因的副溶血弧菌双重PCR检测方法 被引量:2
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作者 白雪松 秦国民 +4 位作者 阎斌伦 毕可然 秦蕾 高雨 张晓君 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2012年第8期102-104,共3页
为了研究副溶血弧菌双重PCR检测方法,试验采用tlh和toxR基因序列设计2对特异性引物进行双重PCR检测,扩增出450 bp和368 bp目的片段。结果表明:在同一PCR反应体系中仅副溶血弧菌可同时扩增出2种基因片段,4株对照菌无任何扩增条带;该双重... 为了研究副溶血弧菌双重PCR检测方法,试验采用tlh和toxR基因序列设计2对特异性引物进行双重PCR检测,扩增出450 bp和368 bp目的片段。结果表明:在同一PCR反应体系中仅副溶血弧菌可同时扩增出2种基因片段,4株对照菌无任何扩增条带;该双重PCR检测方法最低能检测1.660 7×103cfu/mL菌体浓度的副溶血弧菌。说明试验所建立的双重PCR检测方法特异性强、敏感性高、方法简单、用时短,可用于副溶血弧菌引起的水产动物疾病的诊断与分子流行病学调查。 展开更多
关键词 副溶血弧菌 tlh基因 toxr基因 双重PCR
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基于toxR基因的PCR检测副溶血性弧菌的方法建立 被引量:7
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作者 黄晨阳 于龙 +3 位作者 兰智杰 任烁 李振宁 王晓东 《河南预防医学杂志》 2013年第5期327-330,共4页
目的建立基于toxR基因的PCR检测副溶血弧菌的方法,并通过实验条件摸索,优化反应体系条件,验证PCR方法检测副溶血弧菌的优势。方法应用基于toxR基因的环引物PCR法和已报道的PCR法对副溶血性弧菌和食品样品进行检测,并优化反应条件。对两... 目的建立基于toxR基因的PCR检测副溶血弧菌的方法,并通过实验条件摸索,优化反应体系条件,验证PCR方法检测副溶血弧菌的优势。方法应用基于toxR基因的环引物PCR法和已报道的PCR法对副溶血性弧菌和食品样品进行检测,并优化反应条件。对两种检测方法的灵敏度、特异度和检测时间进行比较。结果环引物PCR法可以使副溶血性弧菌扩增出大小180 bp的toxR基因片段,两种方法检测副溶血性弧菌的特异度均为100%,检出限分别为4×103CFU/mL和5×104CFU/mL,检测所需时间分别为2 h 50 min和3 h10 min。结论基于toxR基因的环引物PCR法检测副溶血性弧菌的特异性更强,检出限更低,检测所需时间更短,能够较好地满足卫生防疫机构快速检测副溶血性弧菌的需要。 展开更多
关键词 副溶血性弧菌 PCR toxr基因
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ToxR负调控副溶血弧菌中c-di-GMP的合成
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作者 张苗苗 薛星帆 +6 位作者 孙君芳 吴齐敏 李雪 周冬生 倪斌 陆仁飞 张义全 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第12期4719-4730,共12页
副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是世界范围内引起海产品相关食物中毒的主要致病菌,具有很强的生物膜形成能力。ToxR是一种膜结合调控蛋白,对副溶血弧菌生物膜形成具有一定的调控作用,但具体机制尚未见报道。c-di-GMP是一种普遍存... 副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是世界范围内引起海产品相关食物中毒的主要致病菌,具有很强的生物膜形成能力。ToxR是一种膜结合调控蛋白,对副溶血弧菌生物膜形成具有一定的调控作用,但具体机制尚未见报道。c-di-GMP是一种普遍存在于细菌中重要的第二信使,参与调控细菌的多种生物学行为包括生物膜的形成。本文探究ToxR对副溶血弧菌中c-di-GMP代谢的调控作用。利用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定副溶血弧菌野生株(wild-type,WT)和toxR突变株(ΔtoxR)中c-di-GMP水平的差异。挑选c-di-GMP代谢相关基因scrA、scrG和vpa0198为进一步研究的靶标,采用实时定量qPCR实验检测靶基因在WT和ΔtoxR中的转录水平差异;将靶基因调控区DNA序列克隆入pHRP309质粒中无启动子的β半乳糖苷酶基因上游,采用lacZ报告基因融合实验进一步研究ToxR对靶基因的转录调控关系;将重组质粒分别导入含有pBAD33或pBAD33-toxR的EC100λpir中,采用lacZ报告基因融合实验研究ToxR是否能在异体宿主中调控靶基因的表达;PCR扩增靶基因上游调控区DNA序列,并纯化His-ToxR蛋白,用凝胶阻滞实验(electrophoresis mobility shift assay,EMSA)研究His-ToxR与靶基因启动子区DNA序列是否具有结合作用。ELISA结果显示ΔtoxR中c-di-GMP含量显著性高于WT中的,说明ToxR抑制c-di-GMP的产生;实时定量qPCR结果表明WT中scrA、scrG和vpa0198的转录水平显著性高于ΔtoxR中的,表明ToxR抑制它们的转录;lacZ报告基因融合实验结果表明ToxR可抑制副溶血弧菌和EC100λpir中scrA、scrG和vpa0198的启动子区活性;EMSA实验显示His-ToxR能特异性地结合到scrA和scrG的上游调控区DNA序列上,而对vpa0198的上游调控区DNA序列无结合作用。综上所述,ToxR通过直接调控相关酶蛋白基因的转录来抑制副溶血弧菌内c-di-GMP的合成,从而有助于精确调控生物膜形成等细菌行为。 展开更多
关键词 副溶血弧菌 转录调控 toxr C-DI-GMP
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副溶血弧菌ToxR截短体蛋白的表达纯化及其DNA结合活性 被引量:2
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作者 胡小许 张义全 +5 位作者 黄倩 王丽 杨瑞馥 黎晓敏 周冬生 钟青萍 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第8期956-961,共6页
【目的】利用大肠杆菌BL21λDE3表达系统,表达出有活性的副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)ToxR截短体蛋白,为进一步研究ToxR的转录调控机制奠定基础。【方法】以VP基因组DNA为模板,PCR扩增ToxR蛋白DNA结合结构域(ToxR-N)的DNA片... 【目的】利用大肠杆菌BL21λDE3表达系统,表达出有活性的副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)ToxR截短体蛋白,为进一步研究ToxR的转录调控机制奠定基础。【方法】以VP基因组DNA为模板,PCR扩增ToxR蛋白DNA结合结构域(ToxR-N)的DNA片段,并将其直接克隆入pET28a中,获得重组质粒;将重组质粒导入大肠杆菌BL21λDE3中,所得菌株经IPTG诱导后能表达出His-ToxR-N蛋白。利用限制级凝血酶切除His-ToxR-N中的His-标签,进而以VP的calR和VP1687为靶基因,通过体外的凝胶阻滞实验(EMSA)验证ToxR-N蛋白的DNA结合活性。分别构建克隆有calR和VP1687上游启动子区的LacZ重组质粒,并将重组质粒转入野生株(WT)和toxR突变株(ΔtoxR)中,通过测定β-半乳糖苷酶活性来比较两株重组菌中靶基因启动子活性,以验证ToxR对calR和VP1687的调控关系。【结果】成功表达出有活性的ToxR-N蛋白,该蛋白对calR启动子区具有结合活性。LacZ结果显示ToxR对calR的转录具有激活作用,而对VP1687的转录具有抑制作用。【结论】所表达的ToxR-N可用于后续的转录调控机制研究;ToxR通过直接激活calR的转录表达,而间接抑制T3SS1相关基因的表达。 展开更多
关键词 副溶血弧菌 toxr DNA结合活性 转录调控
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以toxR-S为靶基因的副溶血弧菌PCR检测方法的建立 被引量:5
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作者 慕艳娟 许崛琼 +2 位作者 潘子豪 刘永杰 姚火春 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2015年第10期991-999,共9页
目前,副溶血弧菌PCR检测方法大多基于毒力基因或看家基因,存在假阳性和漏检的风险,建立敏感而特异的快速分子检测方法迫在眉睫。本研究在对toxRS基因序列进行系统发育树构建及同源性分析的基础上,发现toxR、toxS基因均有作为种特异性检... 目前,副溶血弧菌PCR检测方法大多基于毒力基因或看家基因,存在假阳性和漏检的风险,建立敏感而特异的快速分子检测方法迫在眉睫。本研究在对toxRS基因序列进行系统发育树构建及同源性分析的基础上,发现toxR、toxS基因均有作为种特异性检测靶基因的可能,故分别设计引物Primers-R、Primers-S及Primers-R-S,通过优化PCR反应条件建立了相应的PCR检测方法。通过对57株副溶血弧菌和19株亲缘相近菌及食源性致病菌的检测,toxR-SPCR显示出较好的稳定性和特异性,检测极限达2pg基因组DNA。对359份市场海产品样品的比对检测结果表明,toxR-S PCR与国标(GB4789.7-2013)规定的方法的符合率高达95.82%,敏感性100%,特异性92.39%。对两种方法检测时阳性不一致的15份样品,以其总细菌DNA为模板扩增副溶血弧菌看家基因;测序比对结果显示,这15份样品与副溶血弧菌同源性高达97%以上。上述结果表明,本研究建立的toxR-S PCR具有快速、特异、敏感等优点,可被广泛用于副溶血弧菌的快速检测。 展开更多
关键词 副溶血弧菌 toxr-S PCR 快速检测
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霍乱弧菌ToxS蛋白间的互作增强ToxR蛋白诱导毒力基因的表达 被引量:1
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作者 王相洪 张婷 +3 位作者 涂飞 史梦婷 王卉 杨梦华 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期832-840,共9页
【目的】阐明霍乱弧菌ToxR蛋白功能调控的分子机制。【方法】利用巯基捕获(thiol-trapping)的方法分析DsbA蛋白对ToxR周质空间结构域半胱氨酸残基的氧化作用;采用定点突变的方法构建ToxR半胱氨酸突变株(ToxR_(C236/293S));利用荧光素酶... 【目的】阐明霍乱弧菌ToxR蛋白功能调控的分子机制。【方法】利用巯基捕获(thiol-trapping)的方法分析DsbA蛋白对ToxR周质空间结构域半胱氨酸残基的氧化作用;采用定点突变的方法构建ToxR半胱氨酸突变株(ToxR_(C236/293S));利用荧光素酶基因作为报告基因分析ToxR野生型(ToxR_(wt))和半胱氨酸突变体(ToxR_(C236/293S))诱导下游基因表达的活性;通过细菌双杂交系统分析ToxR_(wt)和ToxR_(C236/293S)蛋白之间、ToxR与ToxS之间以及ToxS之间的相互作用。【结果】ToxR周质空间结构域半胱氨酸残基确实可以被DsbA蛋白氧化,且当ToxR与ToxS共表达时,ToxR诱导ctxAB转录表达的活性显著增强,且在dsbA基因缺失突变株中ToxR诱导ctxAB转录表达的活性更高;成功构建株霍乱弧菌ToxR半胱氨酸突变株(ToxR_(C236/293S)),在没有ToxS存在的条件下,ToxR_(C236/293S)诱导毒力基因表达的活性与ToxRwt相当;细菌双杂交系统分析发现当ToxR与ToxS共转录表达时,ToxS极大增强ToxR蛋白之间的互作;在dsbA基因缺失突变株中,ToxS之间的相互作用显著增强。【结论】ToxR蛋白本身的氧还状态对其诱导毒力基因表达的活性没有影响;ToxS通过增强ToxR形成二聚体的能力从而增强其诱导毒力基因的表达,而DsbA对ToxS蛋白之间的相互作用具有抑制作用,DsbA通过影响ToxS的蛋白互作从而影响ToxR蛋白的功能。本文为进一步阐明霍乱弧菌毒力基因表达调控的分子机制提供重要的理论依据。 展开更多
关键词 霍乱弧菌 表达调控 toxrS 氧还状态 蛋白互作
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牡蛎中副溶血弧菌荧光定量PCR检测方法的建立及其应用 被引量:21
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作者 林强 李宁求 +3 位作者 付小哲 刘礼辉 石存斌 吴淑勤 《中国水产科学》 CAS CSCD 北大核心 2011年第1期96-102,共7页
以副溶血弧菌毒素调控基因(toxin regulations,toxR)作为靶标基因,设计特异性引物及TaqMan探针,以含toxR基因的质粒为模板,建立质粒拷贝数与CT值的标准曲线,分别采用含toxR基因质粒、纯培养的副溶血弧菌和添加副溶血弧菌的牡蛎(Ostrea)... 以副溶血弧菌毒素调控基因(toxin regulations,toxR)作为靶标基因,设计特异性引物及TaqMan探针,以含toxR基因的质粒为模板,建立质粒拷贝数与CT值的标准曲线,分别采用含toxR基因质粒、纯培养的副溶血弧菌和添加副溶血弧菌的牡蛎(Ostrea)模拟样品进行灵敏度试验,结果表明,其灵敏度分别为15拷贝、18 CFU/mL和180 CFU/mL。同一个样品的30次重复性试验表明,试验内及试验间的变异系数分别为0.95%和1.5%。结果显示,本研究建立的副溶血弧菌荧光定量PCR检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于牡蛎等水产品中副溶血弧菌的定量检测。 展开更多
关键词 副溶血弧菌 荧光定量PCR toxr基因
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溶藻弧菌的PCR快速检测方法 被引量:18
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作者 韩一凡 莫照兰 +4 位作者 李杰 茅云翔 肖鹏 汪笑宇 杨官品 《中国海洋大学学报(自然科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2009年第6期1237-1240,共4页
为建立溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的PCR快速检测方法,本研究根据弧菌toxR基因的高变区序列设计1对扩增片段为161 bp的引物,进行了特异性和敏感性试验。结果表明该方法能特异地检测溶藻弧菌,每个PCR反应检测的敏感度为0.01 pg的DNA... 为建立溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的PCR快速检测方法,本研究根据弧菌toxR基因的高变区序列设计1对扩增片段为161 bp的引物,进行了特异性和敏感性试验。结果表明该方法能特异地检测溶藻弧菌,每个PCR反应检测的敏感度为0.01 pg的DNA和3.7CFU的细菌。用溶藻弧菌人工感染大菱鲆,以建立的PCR方法检测感染鱼的肝、脾、肾阳性检出率为100%。该方法可用于对感染溶藻弧菌的水生动物疾病进行诊断。 展开更多
关键词 溶藻弧菌 toxr基因 PCR检测
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