缺氧微环境对TSST-1诱导的抗CEA^+结肠癌LoVo细胞免疫治疗的调控

目的:研究缺氧微环境对靶向性表达的超抗原中毒性休克综合征毒素-1(toxic shock syndrome toxin-1,TSST-1)激活人外周血淋巴细胞(peripheral bloodlymphocyte,PBL)对CEA^+结肠癌LoVo细胞杀伤作用的调控。方法:包装、收集前期构建的缺氧反应元件(hypoxia-response elements,HRE)和癌胚抗原启动子CEAp联合调控的逆转录病毒载体pLEGFP-N1-5HRE-CEAp-TSST-1-1inker-CD80TM(简称pLEGFP-N1-5HCTC),感染CEA^+LoVo细胞及CEA^-宫颈癌HeLa细胞,获取稳定表达跨膜型超抗原TSST-1-linker-CD80TM蛋白(TC融合蛋白)的肿瘤细胞。用缺氧模拟试剂CoC1_2模拟缺氧微环境,RT-PCR和WesterRblotting分别检测缺氧调控下TSST-1的表达水平。将健康人PBL与pLEGFP-N1-SHCTC感染后的肿瘤细胞共培养,~3H-TdR掺入法检测缺氧调控下PBL的增殖能力,MTT法检测缺氧调控下PBL对肿瘤细胞的杀伤效应。结果:pLEGFP-N1-5HCTC病毒成功感染CEA^+LoVo细胞(5HCTC/LoVo),RT-PCR和Western blotting证实,缺氧可上调5HCTC/LoVo细胞中TSST-1mRNA和蛋白的表达,CEA^-HeLa细胞在常氧和缺氧条件下均无TSST-1的表达。缺氧可上调5HCTC/LoVo细胞诱导的人PBL的增殖(7.3×10~3 vs 3.1×10~3cpm,P<0.05),缺氧环境下PBL对5HCTC/LoVo细胞的杀伤率明显高于常氧环境(82.69%vs53.50%,P<0.01);CEA^-HeLa细胞不能刺激PBL增殖,PBL对其也无抑制作用。结论:缺氧微环境可显著上调靶向性表达的超抗原TSST-1诱导的对CEA^+LoVo细胞的杀伤作用。

应用聚合酶链反应检测临床分离的产TSST-1金黄色葡萄球菌

中毒休克综合征(TSS)是由产毒素金黄色葡萄球菌引起的累及多器官系统的严重临床综合征。中毒休克综合征毒素1(TSST-1)在TSS发病中起重要作用。本研究应用聚合酶链反应技术,对产毒素金黄色葡萄球菌染色体编码TSST-1的tst基因进行体外扩增,建立了快速、特异、灵敏的检测产TSST-1金葡菌的方法。本研究还对天津市1986～1995年10年间临床分离的金葡菌进行了tst基因检测,在112株受检菌中,tst基因阳性株占20.5％(23/112)。结果提示,为避免TSS发生,对金葡菌感染应给予彻底治疗,特别是对免疫功能低下者。

金黄色葡萄球菌GST-mTSST-1的免疫活性检测方法的研究

通过对影响琼脂扩散反应的多种条件进行优化,建立了检测金黄色葡萄球菌无毒诱变中毒性休克综合征毒素1融合蛋白GST-mTSST-1免疫活性的双向免疫琼脂扩散检测方法.检测的灵敏度可达到120ng/mL.此方法具有特异性强、灵敏度高、操作简单等特点,对具有免疫活性的抗原蛋白的定量检测有一定的参考价值.

葡萄球菌GST-mTSST-1融合蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立

以纯化的金黄色葡萄球菌无毒诱变超抗原GST-mTSST-1融合蛋白作为检测抗原,通过优化ELISA反应条件,初步建立了检测血清特异性GST-mTSST-1抗体的间接ELISA方法,监测了小鼠血清中特异性GST-mTSST-1抗体水平的动态变化规律。方阵试验确定的GST-mTSST-1抗原的最适包被浓度为5.0μg/mL,血清最佳稀释倍数为1∶100,ELISA阳性反应的临界值为D490 nm≥0.219,批内和批间重复试验的变异系数均小于10%。应用该方法对试验小鼠血清进行检测,结果表明,建立的间接ELISA方法具有较高的敏感性、特异性和较好的重复性,适用于检测特异性GST-mTSST-1血清抗体。

金黄色葡萄球菌中毒休克综合征毒素1基因的检测

目的检测编码金黄色葡萄球菌中毒休克综合征毒素l(TSST-1)的tst基因,了解该基因的携带情况。方法用PCR法对产毒素金黄色葡萄球菌染色体上编码TSST-1的tst基因进行体外扩增,并对临床分离的84株金黄色葡萄球菌进行tst基因检测及序列分析。结果对tst基因进行了检测及测序,84株受检的金黄色葡萄球菌中,tst基因阳性株占19.05%(16/84),测序结果与GenBank公布的金黄色葡萄球菌产TSST-1基因的同源性较高。结论用PCR法检测tst基因,具有良好的重复性、特异性和敏感性。tst基因阳性株在临床分离的金黄色葡萄球菌中占有较高的比例。

金黄色葡萄球菌毒性休克综合征毒素1核酸适配体的筛选和鉴定

目的:筛选能特异性识别毒性休克综合征毒素1(TSST-1)的DNA适配体,为金黄色葡萄球菌感染的治疗奠定实验基础。方法:体外合成含有25个随机序列全长为63个碱基的单链DNA(ss DNA)文库,以TSST-1为靶标,利用指数富集的配体系统进化技术(SELEX),从ss DNA文库中筛选TSST-1适配体,利用生物信息学方法对适配体进行序列分析和结构预测,荧光定量法分析适配体的亲和力及特异性。结果:经过8轮筛选,文库的亲和力不断升高,获得了能识别TSST-1的DNA适配体T-7,它可选择性地与TSST-1结合,并测定其Kd值为103.8 nmol/L。结论:新型适配体T-7能选择性识别TSST-1,在金黄色葡萄球菌感染的治疗和诊断方面具有应用前景。

试用ICAM-1相关小分子肽抑制角朊细胞介导的共刺激效应

目的：探讨ＩＣＡＭ１ 相关肽抑制角朊细胞将超抗原ＴＳＳＴ１ 递呈给Ｔ淋巴细胞。方法：应用鼠抗人ＣＤ５４ 单克隆抗体筛选噬菌体随机十五肽库，经４ 轮筛选后，挑取２０ 个克隆进行测序，利用含保守序列的阳性克隆噬菌体对角朊细胞递呈超抗原ＴＳＳＴ１ 给Ｔ细胞进行阻断试验。结果：得到保守序列为ＩＴＲＳＦＱＳＳＭＥＰＧＰＰＧ，所筛选的阳性噬菌体克隆与野生型噬菌体相比具有明显的阻断效应（ Ｐ＜ ００１） 。结论：ＩＣＡＭ１ 相关小分子肽可望降低超抗原介导的皮肤炎症反应。

携带TSST-1和PVL基因的金黄色葡萄球菌的耐药特点、分布特征及与致病性的关系

目的:探讨携带中毒休克综合征毒素-1(TSST-1)和杀白细胞毒素(PVL)基因的金黄色葡萄球菌的耐药特点、分布特征及其与致病性的关系。方法:收集金黄色葡萄球菌临床分离菌株93株,采用聚合酶链反应(PCR)检测TSST-1基因和PVL基因,采用琼脂扩散法检测金黄色葡萄球菌菌株对青霉素(PEN)、苯唑西林(OXA)、头孢噻吩(CEF)、氨苄西林(AMP)、头孢噻肟(CTX)、阿莫西林/克拉维酸(AMC)、亚胺培南(IPM)、克拉霉素(CLR)、万古霉素(VAN)、环丙沙星(CIP)、庆大霉素(GM)、左氧氟沙星(LVX)和利福平(RA)13种抗菌药物的耐药性。结果:耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)占总数的88.2%,甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)占总数的11.8%。TSST-1+菌株在MRSA、MSSA中分别占12.2%、0,差异无统计学意义(P>0.05);PVL+菌株在MRSA、MSSA中分别占40.2%、9.1%,差异有统计学意义(P<0.05)。MRSA存在明显的耐药性,且表现出多药耐药性,而携带TSST-1与PVL基因的MRSA耐药性更严重。结论:MRSA在金黄色葡萄球菌中的分离率高,耐药性严重,携带TSST-1与PVL基因的MRSA耐药性与致病力增加。

葡萄球菌GST-mTSST-1融合蛋白的纯化及其免疫活性鉴定

将DH5α/pGXmTSST基因工程菌用IPTG诱导表达,经超声波破碎、离心、收集上清再用谷胱甘肽琼脂糖凝胶柱(GS4B)亲和层析纯化金黄色葡萄球菌无毒诱变GST-mTSST-1融合蛋白.以SDS-PAGE分析该融合蛋白的表达量和纯度,经双向免疫琼脂扩散试验鉴定GST-mTSST-1融合蛋白的免疫活性.结果表明,GST-mTSST-1融合蛋白在重组菌中可溶性表达,通过GS4B胶亲和层析纯化,SDS-PAGE电泳分析得到纯度较高的目的蛋白,其相对分子质量约为47 000,与理论值一致.兔抗GST-mTSST-1抗血清可特异识别天然rTSST-1蛋白中与GST-mTSST-1融合蛋白相对应的抗原组份,证实GST-mTSST-1融合蛋白具有与野生型rTSST-1相同的表面抗原决定簇,具有较好的免疫原性.

皮肤软组织感染分离的甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌TSST-1基因及耐药性

目的探究皮肤软组织感染分离的甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌中毒休克综合征毒素-1(Toxic shock syndrome toxin-1,TSST-1)基因携带及耐药性分析。方法选取2018年3月-2019年3月120例皮肤软组织感染患者作为研究对象,共分离152株病原菌,其中金黄色葡萄球菌58株。采用聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)法检测携带TSST-1基因的甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌。采用纸片扩散法对甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌进行药敏试验,检测其对多种抗菌药物的耐药性。结果甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌52株,占89.66%,19株为TSST-1阳性,不同疾病类型患者TSST-1阳性率比较,差异具有统计学意义(P<0.05);TSST-1阳性甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌中,红霉素、青霉素、庆大霉素耐药率较高,TSST-1阳性对氨苄西林、多西环素、青霉素、红霉素、庆大霉素、环丙沙星的耐药率高于TSST-1阴性,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌皮肤软组织感染患者中分离率高,TSST-1阳性检出率较高,且对多数抗菌药物耐药。

表皮坏死松解样中毒性休克综合征一例

本文报道一例中毒性休克综合征(TSS),临床表现为广泛红斑基础上出现表皮糜烂表现,与Stevens-Johnson综合征(SJS)和中毒性表皮坏死松解症(TEN)皮损表现相似。该病例提示TSS皮损可模拟SJS/TEN表现,皮肤科医师应增强SJS/TEN与多种疾病的鉴别意识。

金黄色葡萄球菌耐药基因及致病毒素基因的相关性研究

目的研究携带TSST-1和PVL基因的金黄色葡萄球菌耐药特点、分布特征及与致病性的关系。方法临床收集74株金黄色葡萄球菌,采用PCR法检测TSST-1、PVL和mecA基因,纸片扩散法进行17种抗菌剂的耐药性检测。结果 74株金黄色葡萄球菌中mecA基因检出率为55.4%,其中22株检出PVL基因(30.3%),PVL阳性的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)为15株(36.6%),甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA)为7株(21.2%),两者间差异无统计学意义(P>0.05)。5株金黄色葡萄球菌中检出TSST-1基因(6.3%),均为MRSA。MRSA耐药性严重,并呈多重耐药性,携带基因PVL和TSST-1的MRSA除对万古霉素敏感外,对其他抗菌剂均耐药。结论携带基因TSST-1和PVL的金黄色葡萄球菌耐药性及致病力更强,增加了临床抗感染治疗的难度。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性,SCCmec分型及毒素基因的检测

目的调查北京大学第一医院致病性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌SCCmec分型情况、耐药状况、PVL、TSST-1基因携带率,初步了解临床耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药原因,为临床感染控制提供依据。方法收集2007年9月至2008年3月住院患者首次分离的53株有致病意义MRSA,用全自动微生物分析仪进行药敏试验,应用PCR方法检测MRSA的SCCmec基因型、PVLT、SST-1基因。结果53株MRSA呈多重耐药特点,SCCmec分型以ⅢA为主(47.2%),PVL基因均为阴性,12株(22%)MRSA TSST-1阳性。结论53株MRSA的多重耐药性与SCCmec结构密切相关,SCCmec分型技术是探索MRSA多重耐药性与耐药结构有效的分子生物学手段,TSST-1基因阳性株在临床分离的金黄色葡萄球菌中占有较高的比例。

金黄色葡萄球菌毒素基因的检测及临床应用

目的:了解医院获得性金黄色葡萄球菌(HA-SA)和社区获得性金黄色葡萄球菌(CA-SA)所携带肠毒素、表皮剥脱性毒素(ETs)、中毒性休克综合征毒素-1(TSST-1)及杀白细胞素基因(PVL)的特点。方法:应用PCR法检测肠毒素A、B、C、D、E基因,ETs A、B基因,TSST-1以及PVL。结果:116株金黄色葡萄球菌中,85株为HA-SA,检出肠毒素A基因6株,肠毒素C基因1株,肠毒素D基因1株,PVL2株;31株为社区获得性金黄色葡萄球菌,检出肠毒素A基因1株,肠毒素B基因1株,肠毒素D基因1株,PVL7株;所有菌株均未检测到肠毒素E、ETs A、B和TSST-1基因。CA-SA PVL检出率显著高于HA-SA,两者比较差异有统计学意义(P<0.005),而肠毒素、ETs和TSST-1基因检出率比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:金黄色葡萄球菌可分泌多种毒素,在分离金黄色葡萄球菌的同时,应注意其毒素检测。

皮肤软组织及创伤感染金黄色葡萄球菌分离株的毒素基因检测

目的了解皮肤软组织及创伤感染的金葡菌携带的杀白细胞素(Panton—Valentine Leukocidin,PVL)基因、表皮剥脱性毒素(ETs)基因、中毒性休克综合征毒素-1(TSST-1)的tst基因的特点。方法对连续收集的皮肤软组织感染中分离的90株金葡菌,采用多重PCR同时检测金葡菌特异性16SrRNA基因、mecA基因、PVL基因,采用PCR法检测TSST-1及EtsA、B基因。结果金葡菌mecA基因阳性47株(占金葡菌52.2%)为耐甲氧西林金葡菌(MRSA)。有1株MRSA的EtsB基因阳性,1株MRSA的TSST-1阳性,有7株金葡菌携带PVL基因,其中3株为mecA基因阳性株(MRSA)。结论金葡菌可分泌多种毒素,携带PVL毒素的金葡菌常可以引起严重的侵袭性感染,尤其对产毒的MRSA感染引起足够的重视,是防控的重点。

金黄色葡萄球菌致病毒素基因与耐药性的相关性研究

目的研究金黄色葡萄球菌的致病毒素基因与耐药性的关系。方法对临床收集的74株金黄色葡萄球菌,采用聚合酶链反应(PCR)检测耐药基因mecA和致病毒素基因中毒休克综合征毒素-1(TSST-1)、杀白细胞毒素(PVL),采用纸片扩散法进行药敏试验,对红霉素耐药和克林霉素敏感的菌株做D-试验。结果 74株金黄色葡萄球菌中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的检出率为55.4%。MRSA除对万古霉素、呋喃妥因敏感外,对其他抗菌药物均高度耐药,甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)对抗药物的耐药性较轻,两组间的耐药性差异有统计学意义(P<0.05)。PVL基因阳性的MRSA耐药性与PVL基因阴性的MRSA比较,两组间耐药性差异无统计学意义(P>0.05)。PVL基因阳性的MSSA耐药性比不携带PVL基因的MSSA强,两者间差异有统计学意义(P<0.05)。携带TSST-1基因的MRSA除对万古霉素、呋喃妥因无耐药菌株外,对其他16种抗菌药物100%耐药。D-试验阳性菌株占所检菌株的10.8%,占红霉素耐药、克林霉素敏感菌株的88.9%。只有1株PVL基因阳性的MRSA D-试验阳性。结论 MRSA的耐药性非常严重,表现为对多种抗菌药物同时耐药,并且具有较高的红霉素诱导克林霉素耐药率;PVL和TSST-1可增强金黄色葡萄球菌的致病力及MSSA的耐药性,增加了临床抗感染治疗的难度。

多重PCR法检测金黄色葡萄球菌耐药基因及致病毒素基因

目的:了解金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)耐药基因及所携带致病毒素基因PVL与TSST-1的特点。方法:应用多重PCR法检测mecA基因、TSST-1基因及PVL基因。结果:84株金葡球经多重PCR法对其mecA基因进行检测,检出率为58.3%(49/84)。PVL基因阳性菌株的分离率为23.8%(20/84),PVL阳性的MRSA为13株(13/49,26.5%),PVL阳性的MSSA为7株(7/35,20.0%),差异无统计学意义(P>0.05);未检出TSST-1基因。结论:金葡菌的耐药性呈上升趋势,且金葡菌可产生多种毒素,在分离金葡菌的同时,应加强其耐药基因及毒素基因的检测。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因及致病毒素基因的研究

目的研究金黄色葡萄球菌耐药基因及致病因子中毒休克综合征毒素-1（TSST-1）基因和杀白细胞毒素（PVL）基因的分布特征及致病性。方法收集临床分离的80株金黄色葡萄球菌，PCR法检测毒素基因TSST-1，PVL和mecA耐药基因。结果80株金黄色葡萄球菌经PCR法，mecA基因检出率为56．3％（45／80），其中2006年为65．8％（25／38），2007年为47．6％（20／42），2007年的mecA基因检出率低于2006年。PVL^＋菌株的分离率为30．3％，PVL阳性的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）为13株（13／45，28．9％），金黄色葡萄球菌（MSSA）为11株（11／35，31．4％），差异无统计学意义（P〉0．05）。TSST-1基因检出率为6．3％（5／80），MSSA中未检出TSST-1基因。结论产PVL和TSST-1的MRSA致病力更强，增加了临床治疗的难度，对MRSA引起的感染应加强控制，防止其在医院播散流行。

金黄色葡萄球菌肠毒素和中毒性休克毒素的分析

采用反向间接血凝法和双向免疫琼脂扩散试验,检测131株金葡菌的肠毒素和TSST-1并对其青霉素和甲氧西林耐药性作了测定。获得产毒株120株,产毒率为91.6%,Ⅰ型肠毒素为16.7%,Ⅱ型的为11.7%,Ⅲ型以上的占55%、TSST-1为16.7%。发现对青霉素的耐药株占92.3%,耐甲氧西林的占43.2%,产肠毒素的菌株耐青霉素为90.9%,耐甲氧西林43.3%。产TSST-1株耐青霉素为95.9%,耐甲氧西林为50%。对检测金葡菌肠毒素的临床意义进行了讨论。

金黄葡萄球菌中毒休克综合征毒素1的研究

目的应用PCR技术，检测金黄葡萄球菌的mecA基因和染色体上编码中毒休克综合征毒素1（TSST-1）的tst基因，了解tst基因的携带情况。方法用PCR法对我院2006年8月-2007年5月临床分离的84株金黄葡萄球菌mecA基因和tst基因进行体外扩增，建立快速、特异、灵敏的检测产TSST-1耐甲氧西林金黄葡萄球菌（MRSA）的方法。结果成功的对金黄葡萄球菌mecA基因和埘基因进行了检测，并进行基因测序。在我院84株受检金黄葡萄球菌中，41株金黄葡萄球菌的mecA基因扩增呈阳性，阳性株占48．81％。16株tst基因阳性，阳性株占19．05％。10株金黄葡萄球菌同时扩增出mecA基因和tst基因，阳性株占24．39％（10／41）。结论tst基因阳性株在临床分离的耐甲氧西林金黄葡萄球菌中占有较高的比例，应予以足够重视。