Construction and Identification of Mammary Gland-specific Expression Vector of Bovine Tracheal Antimicrobial Peptide (TAP)

[ Objective] This study aimed to construct nmnmm_ry gland-specific expression vector of bovine tracheal antimicrobial peptide （TAP） gene. [ Method] TAP gene of dairy cattle was amplified from the mammary gland tissue by RT-PCR using a pair of primers which were designed according to bovine TAP cDNA se- quence （NM_174776） in GenBank, and then cloned into pMD19-T Simple vector for sequencing. The recombinant plasmid was digested using EcoRI and KpnI, the target gene fragment was recovered and inserted into general mammary gland-specific expression vector pBLG-EGFP harboring enhanced green fluorescent protein （ EGFP）, and transfected into bovine mammary epithelial cells （bMEC）, COS-7 cells and lactating rabbit mmmnary gland tissue by lipofectin transfection. The ex- pression of green fluorescent protein in transfected cells was detected under fluorescence microscopy, and the expression of TAP mRNA in rabbit mammary gland tis- sue was detected by semi-quantity RT-PCR. [ Result] The constructed mammary gland-specific expression vector pBLG-EGFP-TAP specifically expressed EGFP in transfected bMECs. In addition, semi-quantitative RT-PCR result showed that the expression level of TAP mRNA in rabbit mammary gland tissue was significantly enhanced after transfeeted with pBLG-EGFP-TAP. [ Conclusion] The mammary gland-specific expression vector pBLG-EGFP-TAP was successfully constructed, which provided important materials for further investigation of expression characteristics of TAP gene and prevention of bovine mastitis by using genetic engineering technology.

奶牛乳房炎抗性基因TAP cDNA克隆及序列分析

采用RT-PCR方法从奶牛乳腺组织中扩增气管抗菌肽(TAP)基因,重组到pMD19-T Simple载体中,并进行序列分析。序列分析结果显示,克隆的TAP基因包含完整的开放阅读框(ORF)195 bp,与牛TAP基因同源性达93.8%;该ORF编码的64个氨基酸,含有β-防御素特征性结构即6个在特定位置上的保守半胱氨酸残基。TAP基因cDNA完整开放阅读框的克隆,为进一步开发应用重组牛β-防御素奠定了基础。

奶牛气管抗菌肽(TAP)基因乳腺特异性表达载体的构建与鉴定

【目的】构建奶牛气管抗菌肽(TAP)基因乳腺特异性表达载体。【方法】根据GenBank中牛TAP基因cDNA序列(GenBank号:NM_174776)设计引物,从奶牛乳腺组织中RT-PCR扩增TAP基因编码序列,将其克隆到pMD19-T(simple)载体中测序。重组质粒pMD-TAP经EcoRⅠ+KpnⅠ双酶切回收目的基因片段,亚克隆到携带增强型绿色荧光蛋白的通用型乳腺特异性表达载体pBLG-EGFP中,采用脂质体法转染奶牛乳腺上皮细胞(bMEC)、COS-7细胞,并注射泌乳家兔乳腺组织,荧光显微镜检测转染细胞中绿色荧光蛋白的表达,半定量RT-PCR检测家兔乳腺组织中TAP mRNA的表达。【结果】成功构建了乳腺特异性表达载体pBLG-EGFP-TAP,该载体可在bMEC中特异性地表达绿色荧光蛋白;半定量RT-PCR检测发现,转染pBLG-EGFP-TAP可显著提高家兔乳腺组织中TAPmRNA的表达水平。【结论】成功构建了乳腺特异性表达载体pBLG-EGFP-TAP,为进一步研究奶牛TAP基因的表达特性及利用基因工程技术防治奶牛乳房炎提供了重要材料。

牛气管抗菌肽的原核表达、体外抗菌活性及其组织分布分析

本文旨在对牛气管抗菌肽(tracheal antimicrobial peptide,TAP)基因进行原核表达,以及研究重组蛋白的抗菌活性,并分析TAP在各组织的表达分布情况,为开展转TAP基因抗乳腺炎奶牛研究提供技术资料。作者采用RT-PCR从荷斯坦奶牛气管扩增TAP基因,分析其序列后根据大肠杆菌表达系统对密码子的偏好性,人工合成牛TAP基因,构建pET32a(+)-TAP重组质粒;然后转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达并纯化。对表达蛋白进行SDS-PAGE、Western Blot鉴定;在线软件分析目的蛋白表达量。采用滤纸片法测定重组牛TAP的体外抗菌活性,并用RT-PCR法分析牛各组织中TAP表达情况。测序结果表明,扩增到114bp目的基因片段,可编码含38个氨基酸残基的成熟蛋白。SDS-PAGE分析表达的融合蛋白相对分子质量为24ku,重组蛋白以可溶性方式存在,表达量占菌体总蛋白的52.1%。Western Blot检测只出现单一条带。抗菌效价分析表明0.115μg·μL-1重组蛋白对牛源金黄色葡萄球菌有一定的抗菌活性。TAP基因在奶牛咽喉、肺、气管、小肠、肝、心脏及口腔黏膜中均有表达,在鼻黏膜和舌黏膜中微量表达,在皮肤中几乎不表达。作者成功表达了牛TAP基因,重组牛TAP蛋白在大肠杆菌中实现高效表达,并具有一定的抗奶牛乳腺炎致病菌的活性,为未来培育抗乳腺炎转基因奶牛及相关基因工程产品的开发奠定了基础。

高表达牛气管防御素的真核重组载体的构建及其鉴定

根据GeneBank中牛TAP的序列设计了1对特异性引物,采用RT-PCR方法从牛气管组织扩增牛TAP基因,并克隆到pEASY-T3载体。测序结果表明,扩增的片段含有144 bp核苷酸,编码48个氨基酸,与已报道的bTAP有1个氨基酸不同。该基因与真核表达载体FG9重组,经过PCR,酶切和测序鉴定,筛选牛TAP基因重组真核表达载体。使用脂质体法将FG9-TAP重组质粒转染293T细胞,斑点ELISA检测结果表明,成功构建了高表达牛TAP基因的真核表达载体,为抗金黄色葡萄球菌转牛TAP基因奶牛培育研究奠定基础。

牛气管抗菌肽cDNA的克隆与表达

目的:开发一种有效抑制动物细菌感染的重组抗菌肽。方法:根据已发表的牛气管抗菌肽(bTAP) mRNA序列设计引物,用RT-PCR从奶牛气管上皮细胞总RNA中扩增出214bp的bTAP cDNA,将其克隆入pUCm-T载体进行序列测定,将此cDNA分别克隆入真核表达载体pcDNA3和原核表达载体pGEX-6p-1进行表达研究。结果:测序结果与已发表的bTAP序列有3个碱基差异,其中2个导致氨基酸替换;经微球菌溶解试验证明,注射在小鼠皮下的重组质粒pcDNA-tap能表达有活性的bTAP;抗体测定结果显示重组质粒pcDNA-tap经5次免疫后家兔产生的抗hTAP抗体效价达1:800;经IPTG诱导后,含重组质粒pGEX-tap大肠杆菌能表达预计大小的GST-bTAP融合蛋白,且能被兔抗bTAP识别。结论:本研究克隆的bTAP cDNA可用于表达研究及相关基因工程产品的开发。

牛气管黏膜抗菌肽成熟肽基因的克隆及序列分析

目的:获得牛气管黏膜抗菌肽(bTAP)成熟肽的基因序列,为后续的研究工作奠定基础。方法:从新屠宰的黄牛气管黏膜中提取总RNA,反转录获得cDNA,以此cDNA为模板进行PCR扩增目的片段,并将其克隆至pMD18-T载体中,经鉴定随机挑选1个阳性重组子进行测序,将测序结果与已报道的序列进行比较,并做NCBIBlast比对。结果:PCR扩增出bTAP成熟肽基因,核苷酸序列测定验证了其正确性;NCBIBlast比对表明,与bTAP成熟肽基因同源性较高的分别是牛β-防御素11、牛β-防御素12、牛β-防御素402、牛β-防御素403、绵羊β-防御素1、绵羊β-防御素2、山羊β-防御素1及山羊β-防御素2,核苷酸序列同源性分别为78.07%、78.95%、80.70%、83.33%、83.33%、80.70%、81.58%和81.58%,氨基酸序列同源性分别为68.42%、65.79%、68.42%、76.32%、71.05%、63.16%、63.16%和68.42%。结论:成功克隆了bTAP成熟肽的基因序列,NCBIBlas比对表明bTAP与防御素可能来自一个共同的祖系基因。

外源性防御肽(佰润)对胸腔镜术后气道黏膜修复的影响

目的观察外源性防御肽(佰润)对胸腔镜插管球囊扩张后导致的气道术后并发症的作用。方法选取2015年1月至2018年1月山西医学科学院山西大医院胸外科收治的236例胸腔镜手术患者,依据术后治疗方法分为佰润组和对照组,每组分别分为吸烟组和非吸烟组。佰润组术后给予佰润雾化,对照组术后常规处理。以酶联免疫法分别测定术中、术后3d内源性防御肽LL-37、肿瘤坏死因子α、黏蛋白MUC-5ac的表达水平,观察术后气道黏膜损伤情况和咳痰情况。结果与术中比较,佰润组吸烟/非吸烟患者术后3d痰液中LL-37水平升高(P<0.05或P<0.01)。2组吸烟/非吸烟患者术后3d与术中比较,痰液中肿瘤坏死因子α水平差异无统计学意义。对照组非吸烟患者和佰润组吸烟患者术后3d与术中比较,痰液中MUC-5ac水平差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。术后3d,佰润组吸烟/非吸烟患者痰液中MUC-5ac水平低于对照组吸烟/非吸烟患者(P值均<0.05)。佰润组和对照组吸烟/非吸烟患者术后3d与手术结束时比较黏膜损伤情况差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);术后3d,佰润组吸烟/非吸烟患者与对照组吸烟/非吸烟患者比较黏膜损伤情况差异有统计学意义(P值均<0.01)。佰润组吸烟/非吸烟患者与对照组吸烟/非吸烟患者比较咳痰情况差异有统计学意义(P值均<0.01)。结论外源性防御肽可通过适当提高具有修复功能防御肽LL-37的表达水平,促进气道损伤修复,减少出血。通过调节黏蛋白预防术后应激性咳嗽咳痰,全面改善胸腔镜术后愈合。佰润在预防胸腔镜术后咳痰和修复气道黏膜损伤方面,较常规治疗有显著性优势。