改变部分TIR对EPO模拟肽8串联体表达的影响

目的 通过改变部分翻译起始区序列观察对 EPO模拟肽基因 8串联体表达的影响 .方法 设计和人工合成了部分翻译起始区域 (translation initiation region,TIR) DNA序列 ,将该序列插入 p BSEPOM8(含 EPO模拟肽基因 8串联体序列 )的 Eco RI和 X ba I位点 ,经 DNA测序确定正确重组质粒 ,再将 EPO模拟肽基因 8串联体 (含改建的翻译起始区域 )克隆到 p BV2 2 0载体的 Eco RI和 Bam HI位点 ,诱导表达 .结果 DNA测序证明 ,人工合成的 DNA序列已正确插入EPO模拟肽基因 8串联体的翻译起始区域 .该串联体基因插入 p BV2 2 0载体后 ,经 42℃诱导 ,在细菌裂解上清中出现一条相对分子质量为 2 2× 10 3(Mr)的新蛋白带 ,与 EPO模拟肽基因 8串联体的理论计算分子量相符合 .经薄层扫描证明该蛋白带约占细菌蛋白总量的 15 % .结论 通过改变部分翻译起始区域起动了 EPO模拟肽基因 8串联体的翻译 ,使原来不表达的 EPO模拟肽基因

Mx基因稀有密码子和mRNA结构及大肠杆菌表达优化

通过对稀有密码子和mRNA翻译起始区二级结构的分析,构建了4种重组表达菌株BL21(DE3)/pET-Mx,Rosseta(DE3)/pET-Mx,BL21(DE3)/pGEX-Mx和Rosseta(DE3)/pGEX-Mx,在大肠杆菌中进行Mx基因的表达,Rosseta(DE3)/pET-Mx和Rosseta(DE3)/pGEX-Mx重组表达菌中都获得了表达,Western blotting检测到了特异的75 kDa表达产物。实验结果证明稀有密码子和mRNA翻译起始区二级结构对Mx蛋白表达都有影响,选择适用于稀有密码子表达的菌株Rosetta(DE3)有利于Mx蛋白的表达,同时翻译起始区二级结构能值较低的表达载体pGEX-Mx获得的表达量明显增高。实验中首次获得了重组表达鸡全长Mx蛋白的大肠杆菌重组菌。

降低mRNA翻译起始区的稳定性原核非融合表达HAb18GEF

为在大肠杆菌中非融合表达肝癌相关抗原HAb18G胞外区片段 (HAb18GEF) ,将HAb18GEF基因的cDNA插入原核表达载体pET2 1a +。通过计算机辅助设计 ,对重组的HAb18GEF pET2 1a +的mRNA翻译起始区 (TIR)的二级结构和密码子偏性同时进行预测。结果发现其存在稳定的茎环结构和许多稀有密码子。通过优化二级结构和优化密码子偏性二种策略分别来降低HAb18GEF pET2 1a +的mRNA翻译起始区 (TIR)的稳定性。在不改变氨基酸序列的前提下 ,利用密码子的简并性 ,通过非连续定点突变实现这两种优化。将突变前后的重组子经酶切鉴定和测序验证后 ,转化感受态JM10 9 DE3宿主菌后 ,随机挑菌 3 7℃下用IPTG诱导表达。SDS PAGE、间接ELISA、Westernblot和细胞分级分离法分析这些重组子的诱导表达情况。RNAdotblot对比分析优化前后目的基因mRNA的量。结果证明 ,成功地构建了HAb18GEF pET2 1a +及其二种优化突变体。仅优化TIR区二级结构或仅优化TIR区密码子偏性均能实现HAb18GEF蛋白的非融合表达 ,而未优化的重组子不表达任何HAb18GEF。非融合表达产物在大肠杆菌中主要以包涵体形式存在 ,高达 2 9 3 %。由于过表达和细胞渗漏 ,培养基和周质腔中也可检测到少许的HAb18GEF。优化二级结构和优化密码子偏性二种策略的HAb18GEF的非融合?

稻瘟菌MgCYP51B基因稀有密码子和mRNA二级结构分析与表达优化

在大肠杆菌中异源表达稻瘟菌CYP51(P450-14DM,MgCYP51B)基因,通过对MgCYP51B进行跨膜区预测和同源模建分析,并截短稻瘟菌CYP51B基因,构建了9种不同的重组表达质粒以实现蛋白表达.结果表明:只有pET28-MgB-83在3种宿主菌中实现了表达,且在BL21(DE3)pLysS中表达量最大.通过对稀有密码子和mRNA翻译起始区二级结构进行分析,发现稀有密码子和mRNA翻译起始区二级结构稳定性对MgCYP51B蛋白的表达都有影响,适用于稀有密码子表达的Rossetta(DE3)并不适用于MgCYP51B基因的最优表达.同时只有翻译起始区二级结构自由能最低的pET28-MgB-83才能实现表达.本研究实现了稻瘟菌MgCYP51B基因在大肠杆菌中的异源表达,证实密码子的偏爱性和翻译起始区二级结构稳定性影响MgCYP51B蛋白表达.

m RNA5′端不同位置的二级结构对原核生物翻译起始的影响

一个 2 1 bp的序列插入 B50中的人 PCNA- Lac Z′融合蛋白 m RNA的 SD序列的上游 1 1 bpH ind 切点处 ,构成正、反向插入的两个重组质粒 B50 il、B50 i2 .通过计算机程序对 m RNA二级结构的模拟分析 ,B50 il的插入序列在翻译起始区 (TIR)前形成一个发夹结构 ,但不影响 TIR的二级结构 ;B50 i2的插入序列在 TIR 5′端形成一个二级结构 ;而另一克隆 D1 3与 B50因 SD前后的 6个和 7个碱基序列的不同 ;使翻译起始区 TIR的 SD到 AUG附近的二级结构不相同 .实验测定的四者的β-半乳糖苷酶活性与计算机计算的解开 m RNA TIR的二级结构所需能量ΔE进行比较 ,其结果说明 m RNA TIR前面的二级结构对翻译起始无影响 ,而位于 TIR的 5′端的二级结构对翻译起始效率是有影响的 .不过 ,它与 m RNA TIR的 SD到 AUG的附近的二级结构对翻译起始效率的影响相比 ,TIR5′端二级结构的影响比较小 .同时 ,PCNA- Lac Z和 PCNA- Lac Z′两种融合蛋白的β-半乳糖苷酶活性也进行了比较 ,酶活性有差别 ,但不同质粒酶活性的比值仍相同 .

人白细胞介素-3基因翻译起始区的改造提高其在大肠杆菌中的表达水平

为了提高人白细胞介素-3(hIL-3)在大肠杆菌中的表达,在计算机辅助下,设计合成了PCR突变引物,用于改造起始密码AUG上下游序列,并在不改变5＇端氨基酸编码的前提下,尽可能选用大肠杆菌高频使用的密码子。将经改造后的hIL-3cDNA和翻译起始区置于P_L启动子之下,转入大肠杆菌Tap106,经42℃热诱导后,获得表达产物,提高表达水平近一倍,表达量达到菌体总蛋白量的30％左右。表达产物经Western blot验证,经PVDF膜转移后进行N端顺序分析,证明前15个氨基酸正确,产物经包涵体纯化后,纯度提高至80％以上,初步复性后能明显促进hIL-3依赖细胞的生长。

牛GDF9和BMP15基因遗传变异与双胎性状的关系研究

以生长分化因子9（Growth differentiation factor 9,GDF9）基因和骨形态发生蛋白15（Bone morphogenetic protein 15,BMP15）基因作为牛双胎性状的候选基因,研究了它们在鲁西牛、秦川牛、南阳牛和中国荷斯坦牛4个品种中的遗传变异,并在鲁西牛群体中研究了其多态位点与双胎性状的关系.结果表明：在鲁西牛中GDF9基因的3＇UTR发现缺失突变,而其它3个品种中没有发现该突变.对鲁西牛群体中该多态位点与单、双胎性状之间进行卡方显著性检验表明,单胎牛群体与双胎牛群体基因型分布有极显著的差异（P=0.006）,双胎牛群体的B等位基因频率明显大于单胎牛群体.通过生物信息学分析表明,突变体mRNA的二级结构与野生型相比总自由能值差异不大,但突变体mRNA翻译起始位点的二级结构稳定性明显大于野生型.在鲁西牛、南阳牛和秦川牛的BMP15基因中发现编码区第759～762 位有GAAA 4个碱基存在缺失突变,但没有检测到突变纯合个体,中国荷斯坦牛中没有检测到该突变.卡方显著性检验表明单胎牛群体和双胎牛群体在该位点基因型组成差异不显著（P=0.947）.

籼稻品种93-11同义密码子的使用偏性

利用籼稻品种 93 11的全基因组序列及相应的EST数据 ,对影响同义密码子用法的若干因子进行了详细分析。指出 93 11基因的表达水平 (mRNA丰度 )与 3个同义密码子偏性指标CAI、CPP和ENC相关极显著 (r =0 2 2 7 ,0 14 5 和 - 0 14 7 ) ,表明高表达的基因其同义密码子非随机使用的程度越大 ;基因长度与CAI和CPP极显著负相关 (r=- 0 4 13 和 - 0 4 80 ) ,与ENC极显著正相关 (r=0 2 10 ) ,暗示较短的基因具有更高的转录活性 ;编码区G +C含量对其同义密码子偏性的贡献率远高于mRNA丰度和基因长度 ,G +C含量与CAI、CPP和ENC相关系数分别高达 0 877 ,0 832 和 - 0 74 0 ;起始编码区内A、T、C、G 4种碱基呈明显的 3周期振荡 ,尤以ATG下游第一个密码子所在的 3个位点 (+4、+5和 +6 )偏置最强烈 ,由此认为在这 3个特殊位点有较高的自然选择压存在 ;93 11中 2 5个最优密码子的首次确定将对水稻转基因具有指导意义。

优化mRNA翻译起始区提高人粒－巨噬细胞集落刺激因子在E．coli中的表达

人粒－巨噬细胞集落刺激因子（ｈＧＭ－ＣＳＦ）是一种重要的造血生长因子．利用基因重组技术构建两个ｈＧＭ－ＣＳＦ的Ｅ．ｃｏｌｉ表达菌株，一个为在不改变氨基酸顺序的前提下，对ｍＲＮＡ翻译起始区核苷酸顺序进行优化突变（ｈＧＭ－ＣＳＦ（Ｍ）），另一个为未突变的对照（ｈＧＭ－ＣＳＦ（Ｎ））．经酶切电泳、ＤＮＡ测序、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ等分析鉴定，证明两者均能表达特异性的１４．６ｋＤｈＧＭ－ＣＳＦ，但ｈＧＭ－ＣＳＦ（Ｍ）的表达水平较ｈＧＭ－ＣＳＦ（Ｎ）提高了１．２６倍，占菌体总蛋白的１６．９％．ｍＲＮＡ翻译起始区二级结构预测分析表明，优化突变后生成自由能ΔＧ从原来的－１０．２提高至－９．４Ｋｃａｌ，ＡＵＧ从部分配对状态变为非配对状态．

不同品系节旋藻cpcB基因上游序列的克隆与分析

采用体外克隆技术获得来自节旋藻6个品系的cpcB基因的257 bp的上游序列和217 bp的编码区序列,并和来自FACHB341的cpcB基因序列对应部分进行比较分析。结果表明,所获得的上游序列和编码区序列都有高度的保守性,而编码区所推导的氨基酸序列的保守性更高。启动子软件预测,在每一上游序列中都存在5条启动子序列,其中,FACHB439的启动子种类和结构与其他品系存在一定的差异。同时,FACHB439的翻译起始区mRNA二级结构与其他品系也有所不同。因此推测,在大多数品系节旋藻中藻蓝蛋白基因存在相同的表达调控机制,而品系FACHB439则可能存在一定程度的差异。

丙型肝炎病毒5’端非编码区的5’端序列对其翻译启动活性的影响

目的分析丙型肝炎病毒(HCV)5’端非编码区(5’NCR)的5’端序列对其翻译启动活性的影响。方法用PCR技术扩增获得全长和5’端17个碱基缺失的HCV5’NCR片段,定向克隆至表达质粒pSEAP2Control的SEAP基因上游,分别构建成全长和5’端截短的HCV5’NCR调控SEAP表达的重组质粒pNCRSEAP和pdNCRSEAP。用脂质体方法将重组质粒转染至肝细胞株QSG7701,并用化学发光法检测SEAP的表达。结果酶切和测序结果表明,重组质粒pNCRSEAP和pdNCRSEAP构建成功。表达的发光强度分别为390482±42856和635265±52285RLU,二者有差异显著性(P<0.01)。结论HCV5’NCR的5’端碱基缺失提高了它对SEAP基因的翻译启动活性,为进一步分析HCVIRES的结构提供了实验基础。

脑心肌炎病毒多聚蛋白编码区起始与终止区的密码子使用模式

文中利用特定区域密码子使用偏嗜性对数公式分析了脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)多聚蛋白编码基因的翻译起始区域与翻译终止区域的密码子使用模式。结果表明,EMCV多聚蛋白编码区内翻译起始序列区的同义密码子使用偏嗜性的正负偏差总体是平衡的,但几种在整体多聚蛋白质编码区域内使用为负偏嗜的稀有密码子却倾向于出现于编码起始区和终止区。这一有趣的现象,可利用"稀有密码子调控假说"来解释为EMCV开放阅读框两端的稀有密码子偏好性使用对整体阅读框的表达具有负调控作用。该研究说明"稀有密码子调控假说"不仅适用于细菌,而且也适用于一些RNA病毒基因组。

翻译起始区二级结构对荧光素酶基因在COS-7细胞中表达效率的影响

在荧光素酶基因起始密码子ATG下游插入4种串连重复的密码子(6×ATT ,3×ATT ,6×GCC与3×GCC) ,得到具有不同二级结构的翻译起始区(translationinitiationregion ,TIR) ,以研究TIR二级结构对该基因在COS 7细胞中表达的影响.Northern印迹结果显示,4种重组子mRNA的转录水平没有显著差异,而Western印迹与酶活性检测表明,与野生型结构相比,6×ATT与3×ATT能显著提高荧光素酶的表达量与活性,而6×GCC结构的表达量明显下降.使用计算机辅助分析软件,扫描上述TIR结构发现,TIR稳定性或二级结构复杂度是导致上述表达差异的主要原因.

人粒系集落刺激因子(hG-CSF)cDNA于P_RP_L启动子作用下在大肠杆菌中的表达

hG—CSF cDNA在天然状态下很难在大肠杆菌中表达。本文以作者克隆的高活性形式hG—CSF cDNA为模板,经PCR扩增出含hG—CSF信号肽中丙氨酸(Ala)及成熟型全部氨基酸编码序列的cDNA片段,于NcoⅠ、BamHⅠ位点克隆于原核表达载体PJLA602中,用高活性hG—CSF特异探针菌落原位杂交筛选出阳性克隆。此克隆hG—CSF cDNA在λ噬菌体 P_RP_L串联启动子和大肠杆菌atpE翻译起始区(TIR)共同作用下,阳性菌株热诱导表达后经小鼠骨髓细胞体外CFU-G测试表明,表达产物具明显的粒细胞集落刺激活性。

玉米黑粉菌CYP51稀有密码子和mRNA二级结构分析及与杀菌剂戊唑醇分子对接

通过截短玉米黑粉菌CYP51(P450-14DM,UmCYP51)基因(去除编码跨膜区部分)和选取不同的表达载体,构建了9种重组表达质粒,在大肠杆菌中进行UmCYP51基因的表达,发现只有BL21(DE3)/pET32-Um-35重组表达工程菌获得了表达.对稀有密码子和mRNA翻译起始区二级结构进行分析,结果表明稀有密码子和mRNA翻译起始区二级结构对UmCYP51蛋白的表达都有影响.适用于稀有密码子表达的菌株Rosetta(DE3)不利于UmCYP51蛋白的表达;同时只有翻译起始区二级结构自由能值最低的重组载体pET32-Um-35可以表达.为了设计以UmCYP51为靶标的新型抗真菌抑制剂,基于最新解析的真核生物人类的CYP51晶体结构,利用同源模建的方法构建了UmCYP51的三维结构并进行了分子动力学模拟优化.通过与商品化杀菌剂戊唑醇进行分子对接获得了此类抑制剂与UmCYP51的理论结合方式,阐述了戊唑醇分子的杀菌机理,为开发新型的抗真菌抑制剂奠定了基础.

人α-肿瘤坏死因子基因的高效表达

用人工合成的α-肿瘤坏死因子(TNF-α)基因构建了五个不同的表达质粒,它们不同之处是SD序列与起始密码子ATG间距离(D)各异。计算机模拟计算出翻译起始区域(TIR)中二级结构的最小生成自由能,以(D)为6个核苷酸时最小(绝对值)。它的表达效率也最高,产物TNF-α可达菌体总蛋白的60％。密码子的选用对表达效率有很大的影响,故人工合成TNF-α基因(选用大肠杆菌偏爱的密码子)的表达效率高于sc-DNA(对部分密码子改造的半合成cDNA)。

人白细胞介素18基因化学合成及其在大肠杆菌中高表达

目的设计并合成人白细胞介素18(hIL-18)基因,在大肠杆菌T7表达系统中高表达hIL 18。方法根据大肠杆菌的偏爱密码子和翻译起始区的二级结构,设计并人工合成了hIL-18的基因。将新合成基因克隆到载体pMFT7-5 ,经转化JM10 9(DE3) ,得到工程菌JTI。结果经IPTG诱导表达,SDS-PAGE结果表明目的蛋白质占总蛋白质的30 % ,具有免疫学活性。

颗粒裂解肽抗菌结构域在大肠杆菌中表达水平的分析

为实现颗粒裂解肽抗菌结构域的高效表达并避免其对宿主菌的毒性,研究设计了共表达阴离子配体重组生产阳离子抗菌肽的方法。结果证明该方法可有效提高阳离子抗菌肽的表达产量。同时研究分析了颗粒裂解肽不同抗菌结构域在同一原核表达载体pACYCDuet-1中表达水平的实验数据。通过计算机程序对mRNA二级结构的模拟分析,计算并比较出其二级结构生成自由能之间的差异,提出了预测颗粒裂解肽抗菌结构域在E.coli中表达水平的几点依据,参考这些依据可以对不同抗菌肽基因进行改造以获得高效表达。

丙型肝炎病毒5'端非编码区结构域Ⅰ、Ⅱ在其翻译启动活性中的作用具有细胞特异性

目的分析在不同宿主细胞的翻译体系下,缺失不同片段的HCV 5'UTR翻译启动活性的差异。方法以脂质体介导基因转染技术,将截短型HCV 5'UTR调控Fluc的真核表达质粒与Rluc真核表达质粒p RL-TK共转染至不同的细胞中,转染后36 h:6提取细胞RNA,半定量RT-PCR检测目的质粒的转录水平;6用双荧光素酶报告基因检测系统检测Fluc基因相对表达活性,分析HCV 5'UTR缺失不同结构域后在不同翻译体系中翻译启动活性的差异。结果 6缺失5'端44个碱基的HCV 5'UTR的翻译启动活性分别与缺失前相比:在He La细胞和C6细胞中无明显影响,在L-02细胞中活性下降为46%,而在293T细胞则为缺失前的146%;6缺失5'端118个碱基后,HCV 5'UTR的活性分别与缺失前相比:在He La细胞中,缺失后活性仅为缺失前的49%,而在L-02细胞、C6细胞和293T细胞中,活性分别为缺失前的140%、160%和235%。在本研究使用的四种细胞中,p CNl的翻译启动活性的差异无统计学意义,p CNl-d2在293T细胞中活性最高,在L-02细胞中活性最低。p CNl-d3在293T、C6和L-2细胞中活性相近,但在He La细胞中的活性明显比其他细胞低。结论 HCV 5'UTR的DomainⅠ和DomainⅡ对其翻译启动活性的影响与宿主细胞种类相关,具细胞特异性。

家蚕二分浓核病毒ns1基因序列的改造、表达和鉴定

探讨翻译起始区(TIR)部分密码子发生同义突变后,对家蚕二分浓核病毒(BmBDV)ns1基因表达的影响,以及对BmBDV NS1蛋白毒性进行鉴定,设计特异性上游引物,对BmBDV ns1基因中第3、4、9和10个密码子进行同义突变,利用原核表达系统对野生型和改造后的ns1序列进行表达,通过SDS-PAGE电泳对这两种序列的表达产量进行分析。利用Protein Iso^(TM)GST Resin从超声破碎的菌液上清中纯化融合有GST的NS1蛋白,进而对纯化的靶蛋白在细胞水平和家蚕体内进行毒性分析。结果表明:TIR突变后的BmBDV ns1序列,其与野生型序列的表达产量之间没有明显差异;BmBDV NS1蛋白具有抑制细胞增殖和诱导家蚕致死的生化活性。