延龄草苷对过氧化氢诱导的PC12细胞氧化损伤和炎症因子表达的影响

探讨延龄草苷对过氧化氢(H_2O_2)诱导的PC12细胞氧化损伤和炎症因子表达的影响。采用MTT法和LDH活性测定观察延龄草苷对PC12细胞模型的影响,采用相关试剂盒检测活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)含量,超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力,Western blot检测Sirt1、NF-κB和TNF-α的蛋白表达。延龄草苷(5~20μM)能够显著提高H_2O_2损伤的PC12细胞的活力,提高细胞抗氧化能力,并上调Sirt1的表达,下调NF-κB和TNF-α的表达,其保护作用可能与提高抗氧化能力,降低炎症因子损伤,调控Sirt1/NF-κB信号通路有关。

高效液相-质谱联用法(LC-MS/MS)测定延龄草苷血药浓度及其药物动力学研究

目的:进行延龄草苷在小鼠体内的药物动力学研究。方法:采用甲醇沉淀蛋白进行血浆样品预处理,选用人参皂苷 Rh2为内标,以 LC-MS/MS 法测定小鼠血浆中延龄草苷的含量。色谱柱为 MetaChem ODS-3(50mm×2.0mm,5μm),流动相为乙腈-水-甲酸(80:20:0.1),流速为0.2mL·min^(-1)。电喷雾离子化(ESI)方式,采用多反应监测,检测离子为正离子,分别选择 m/z 577.6→253.6amu 和 m/z 621.5→603.7amu 作为延龄草苷和内标物人参皂苷 Rh2的检测离子对。结果:延龄草苷在2.0μg·mL^(-1)～200μg·mL^(-1)范围内线性关系良好(r=0.9964)。方法的准确度范围为-3.0%～1.4%,日内精密度 RSD 范围为1.1%～3.3%,日间精密度 RSD 范围为3.2%～5.1%。小鼠尾静脉注射延龄草苷(7.6mg·kg^(-1))后,药-时数据符合二室模型,主要药物动力学参数:t_(1/2)为5.56h、K_e 为0.12h^(-1)、C_(max)为130.1μg·mL^(-1)、V_d 为4.6mL、Cl 为0.049mL·h·kg^(-1)。结论:建立的含量测定方法快速、准确,适用于延龄草苷在小鼠体内的药物动力学研究。

延龄草苷通过上调miR⁃1247⁃3p表达减轻高糖诱导的视网膜血管内皮细胞损伤

目的探讨延龄草苷对高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞(HRVEC)损伤的影响及作用机制。方法5、10、20μmol/L的延龄草苷作用于30 mmol/L葡萄糖诱导的HRVEC细胞,或30 mmol/L葡萄糖诱导转染miR⁃1247⁃3p模拟物的HRVEC细胞,或20μmol/L的延龄草苷作用于30 mmol/L葡萄糖诱导的转染miR⁃1247⁃3p抑制剂的HRVEC细胞,DCFH⁃DA法检测细胞中ROS水平,酶联免疫吸附法检测MDA和SOD水平,流式细胞仪检测细胞凋亡,Western blot法检测Bcl⁃2和Bax蛋白表达,RT⁃qPCR法检测miR⁃1247⁃3p表达。结果延龄草苷降低了高糖诱导的HRVEC中ROS和MDA水平、凋亡率及Bax蛋白表达(P<0.05),提高了SOD活性、Bcl⁃2蛋白表达及miR⁃1247⁃3p表达(P<0.05),且呈剂量依赖性。过表达miR⁃1247⁃3p降低了高糖诱导的HRVEC中ROS和MDA水平、凋亡率和Bax蛋白表达(P<0.05),提高了SOD活性和Bcl⁃2蛋白表达(P<0.05)。抑制miR⁃1247⁃3p逆转延龄草苷对高糖诱导的HRVEC细胞氧化应激和凋亡的影响(P<0.05)。结论延龄草苷可能通过上调miR⁃1247⁃3p表达抑制高糖诱导的HRVEC细胞氧化应激和凋亡,减轻细胞损伤。

延龄草苷的制备

延龄草苷是中药中的一个有效成分,采用提取分离的方法从中药材大量获得它是困难的.我们以易得的原料薯蓣皂素和葡萄糖为原料合成了它.首先从葡萄糖起始,通过酰化、溴代反应,采用一锅煮的方法合成中间体溴-D-四乙酰葡萄糖;再与薯蓣皂素通过催化剂Hg(Ac)催化立体选择性的生成β-苷键,水解反应制备得到延龄草苷,总产率38.2%。反应条件温和,适于大量制备。产物结构通过IR,1HNMR和MS确证。

黄姜皂苷水解烟曲霉的分离及其β-糖苷酶性质初探

为实现黄姜皂苷的清洁生产,从自来水中筛选能用于黄姜皂苷生物转化的微生物并研究其粗酶的性质。首先通过平板划线法分离自来水中能水解黄姜皂苷的微生物,利用TLC法和HPLC法分析微生物的转化效率。然后采用比色法测定粗酶β-糖苷酶活性的最佳反应条件并检验其热稳定性。最后以典型螺甾烷型皂苷延龄草苷为底物,探讨该粗酶用于黄姜皂苷生物转化的可能性。筛选所得最佳菌种为烟曲霉,其粗酶在65℃pH6.0条件下活力为4.1 U/mg,为筛选所得另外两种真菌的2.7倍和2.6倍;含有1.5 mol/L硫酸铵时,其粗酶活性在65℃放置48小时后还剩余77%;该酶对延龄草苷的水解反应在24小时达到平衡,皂素的得率达56%。首次报道了烟曲霉及其粗酶对黄姜皂苷的生物转化,其粗酶的热稳定性远高于其他耐热性β-糖苷酶,且对延龄草苷的转化率较高。

延龄草苷的合成方法研究

延龄草苷为薯蓣皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷,来源于中药延龄草,为甾体皂苷类化合物,具有广泛的生物活性。通过两种方法合成延龄草苷:Koenigs-Knorr法,以溴代糖为糖基供体,以碳酸银作为催化剂,将薯蓣皂苷元与溴代-α-D-四乙酰葡萄糖成苷合成延龄草苷;三氟化硼-乙醚催化法,全乙酰葡萄糖作为糖供体,将薯蓣皂苷元与α-D-五乙酰葡萄糖成苷合成延龄草苷。合成产物和中间体的结构经^(1)H-NMR和^(13)C-NMR法确认。比较两种合成方法:Koenigs-Knorr法路线较长,步骤略为繁琐,收率较高,为74.7%;三氟化硼-乙醚催化法路线较短,反应迅速,成本更低,但收率较低,为34.9%。采用的两种方法均具有操作简单、反应条件温和的优点,可为延龄草苷的广泛应用提供物质保证,并为甾体皂苷类化合物的化学合成提供技术支持。

延龄草苷对脊髓损伤大鼠核因子E2相关因子2/抗氧化反应元件信号通路的影响

目的探索延龄草苷对大鼠脊髓损伤后核因子E2相关因子2(Nrf2)/抗氧化反应元件(ARE)通路及氧化应激反应的影响。方法雄性Sprague-Dawley大鼠108只,随机分为假手术组、模型组和延龄草苷组,每组36只,每组再分为1 d、3d和7d三个亚组,每个亚组12只。模型组和延龄草苷组采用改良Allen重物打击法制备髓损伤模型,假手术组不损伤脊髓。延龄草苷组每天给予延龄草苷200mg/kg灌胃,假手术组和模型组每天给予等量生理盐水,每天2次。术后1d、3d、7d进行BBB评分;术后7d,取损伤部位脊髓组织进行尼氏染色,观察形态学变化;ELISA检测脊髓内氧化应激因子丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)的变化;术后1d、3 d、7 d,Western blotting分析检测脊髓组织内Nrf2、Kelch样ECH关联蛋白1(Keap1)、血红素加氧酶-1(HO-1)和NAD(P)H醌氧化还原酶-1(NQO1)的表达情况。结果与模型组相比,延龄草苷组BBB评分提高(P<0.05);脊髓结构较完整,神经元形态较正常,尼氏小体数量增多;脊髓组织内SOD活性提高(P<0.05),MDA含量降低(P<0.05);脊髓内抗氧化相关蛋白Nrf2、Keap1、HO-1和NQO1的表达均升高(P<0.05)。结论延龄草苷对大鼠脊髓损伤有保护作用,可能通过抑制组织内氧化应激反应改善运动功能。

延龄草苷对脂多糖刺激的小胶质细胞炎症抑制作用

目的探讨延龄草苷(trillin)对小胶质细胞(BV-2)的炎性激活的抑制作用。方法不同浓度的延龄草苷孵育0.5h,然后用脂多糖进行刺激,培养24 h后收集上清,Greiss法检测NO浓度;CCK-8检测延龄草苷对小胶质细胞活力的影响;Elisa检测肿瘤坏死因子(TNF-α)的浓度;实时定量PCR(RT-PCR)检测TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS、COX-1、COX-2基因的表达。结果在不影响细胞活力的前提下,延龄草苷能明显抑制NO的释放,同时能抑制激活诱导细胞死亡,能明显抑制TNF-α的产生,能明显抑制TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS、COX-2 mRNA的表达,但是不能抑制COX-1 mRNA的表达。结论延龄草苷可以抑制LPS诱导的小胶质细胞的炎性激活,抑制炎性基因的表达。

HPLC法测定穿山龙中伪原薯蓣皂苷、薯蓣皂苷和延龄草苷的含量

目的:建立反相高效液相色谱法同时测定穿山龙中伪原薯蓣皂苷、薯蓣皂苷和延龄草苷的含量。方法:采用Zorbax SB-C18(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱,流动相为乙腈(A)-水(B),梯度洗脱(0～18 min,25%A线性变为36%A;18～40min,36%A线性变为90%A;40～55 min,90%A保持不变),流速1.0 mL.min-1,检测波长210 nm,柱温30℃。结果:伪原薯蓣皂苷、薯蓣皂苷和延龄草苷的色谱峰面积与浓度呈良好的线性关系,线性范围分别为9.80～588.0μg.mL-1(r=0.9994),20.20～1212μg.mL-1(r=0.9995),5.330～319.8μg.mL-1(r=0.9999);平均回收率(n=9)分别为97.3%,99.4%,97.6%。结论:该方法简便、准确,为穿山龙药材的质量评价提供了方法。

延龄草苷可提高氟尿嘧啶的抗宫颈癌疗效

目的 :观察延龄草苷对氟尿嘧啶抗宫颈癌疗效的促进作用。方法 :宫颈癌He La细胞分别与延龄草苷(300μg/m L)、氟尿嘧啶(10μg/m L)以及氟尿嘧啶(10μg/m L)+延龄草苷(30、100和300μg/m L)孵育后,采用MTT法检测延龄草苷与氟尿嘧啶对体外培养的He La细胞增殖的抑制作用,应用FCM法检测He La细胞的凋亡情况。蛋白质印迹法检测延龄草苷联用氟尿嘧啶对He La细胞中丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶、丝/苏氨酸蛋白激酶Akt以及凋亡相关信号通路蛋白表达的影响。建立小鼠移植瘤模型,腹腔注射给药后检测延龄草苷(300 mg/kg)对裸鼠体内肿瘤形成的拮抗作用。结果 :延龄草苷与氟尿嘧啶在体外联合应用,可增强氟尿嘧啶对宫颈癌He La细胞增殖的抑制作用(P<0.05),促进细胞凋亡(P<0.05)。延龄草苷与氟尿嘧啶联用可抑制裸鼠体内的肿瘤生长,并且比单独应用氟尿嘧啶的效果显著(P<0.05)。延龄草苷与氟尿嘧啶联合作用可降低肿瘤细胞中磷酸化丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶和磷酸化Akt蛋白的表达,同时活化型caspase-3蛋白表达水平升高,Bcl-2表达下调,Bax表达上调(均P<0.05)。结论 :延龄草苷可提高氟尿嘧啶的抗宫颈癌疗效,推测其可作为一种有潜力的化疗药物增敏剂。

延龄草苷对肺炎链球菌感染的肺泡上皮细胞损伤的保护作用及其机制研究

目的探讨延龄草苷对肺炎链球菌(SP)感染的肺泡上皮细胞损伤的保护作用及其机制。方法取对数生长期细胞A549,用1×10^8 CFU·mL^-1的肺炎链球菌培养作为模型组,正常培养细胞作为正常组。细胞A549分别用5,10,20μmol·L^-1的延龄草苷处理,再用1×10^8 CFU·mL^-1的肺炎链球菌培养,分别作为第一实验组至第三实验组。转染后,将miR-NC、miR-340-5p、si-NC、si-NOX1转染至A549细胞中,再用1×10^8 CFU·mL^-1的肺炎链球菌培养,分别记为第五转染组至第八转染组。将anti-miR-NC、anti-miR-340-5p转染至A549细胞后,再用20μmol·L^-1的延龄草苷处理,再用1×10^8 CFU·mL^-1的肺炎链球菌培养,作为第九转染组至第十转染组,转染步骤按照LipofectamineTM 2000试剂盒进行操作。以流式细胞术检测细胞凋亡;以酶联免疫吸附法检测白细胞介素-10(IL-10)和白细胞介素-6(IL-6)的含量。以实时荧光定量-PCR法检测miR-340-5p和NOX1基因表达水平。结果正常组、模型组、第一实验组、第二实验组、第三实验组、第五转染组、第六转染组、第七转染组、第八转染组、第九转染组和第十转染组的细胞凋亡率分别为(7.54±0.75)%,(27.63±2.72)%,(20.11±2.05)%,(15.32±1.57)%,(10.45±1.05)%,(25.18±2.53)%,(12.47±1.28)%,(26.54±2.63)%,(13.48±1.39)%,(10.98±1.09)%和(23.41±2.25)%;这11组的IL-10含量分别为(24.98±2.41),(8.03±0.82),(12.95±1.31),(17.42±1.34),(21.03±1.87),(8.73±0.88),(18.41±0.72),(8.24±0.81),(16.48±1.63),(22.54±2.37)和(12.48±1.25)ng·L^-1;这11组的IL-6含量分别为(5.39±0.58),(19.64±1.82),(16.49±1.64),(11.43±1.18),(7.32±0.81),(19.32±1.88),(9.64±0.97),(20.04±2.03),(10.65±1.08),(6.84±0.69)和(15.54±1.57)ng·mL^-1。模型组、第三实验组、第九转染组和第十转染组的miR-340-5p基因表达水平分别为1.01±0.09,2.31±0.23,2.38±0.24,1.33±0.13;这4组的NOX1基因表达水平分别为0.86±0.08,0.46±0.04,0.43±0.04,0.73±0.06。上述指标:模型组与正常组相比,或第一实验组至第三实验组与模型组相比,或第六转染组与第五转染组相比,或第八转染组与第七转染组相比,或第十转染组与第九转染组相比,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论延龄草苷可保护肺炎链球菌感染的肺泡上皮细胞损伤,其机制可能与miR-340-5p/NOX1表达有关。

HPLC-ELSD同时测定白英中延龄草苷和去半乳糖替告皂苷的含量

目的:建立同时测定白英中延龄草苷(trillin)和去半乳糖替告皂苷(desgalactotigonin)含量的HPLC-ELSD法。方法:采用Diamonsil-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相乙腈-10 mmol.L-1醋酸铵溶液52∶48,柱温25℃,流速0.6mL.min-1,进样量20μL,检测器漂移管温度为95℃,氮气流速2.3 L.min-1。结果:延龄草苷和去半乳糖替告皂苷分别在20～200 mg.L-1(r=0.999 8)和10～100 mg.L-1(r=0.999 7)内线性关系良好。延龄草苷的平均回收率为99.4%,RSD为0.90%;去半乳糖替告皂苷的平均回收率为100.3%,RSD 1.1%。结论:该方法准确,重复性良好,适用于白英药材的质量控制。