大肠杆菌trpBA和serA基因的串联表达

大肠杆菌trpBA基因编码的色氨酸合成酶（tryptophan synthetase，TSase）是色氨酸合成的关键酶；serA基因编码的磷酸甘油酸脱氢酶（D-3-phosphoglycerate-dehydrogenase，PGDH）为L-丝氨酸合成（色氨酸合成的底物）的关键酶。为了通过基因工程手段来增加色氨酸的产量，在利用高效的原核表达载体pET22b（＋）分别对trpBA和serA基因克隆表达的基础上，采用PCR方法扩增了抗反馈抑制的serA和trpBA基因，将两基因串联于pET22b（＋）载体上，共构建了4种方式的串联质粒，实现了2种蛋白酶在大肠杆菌中的共表达。聚丙烯酰胺电泳分析显示，ABA—I重组菌株在37kD（PGDH）、29kD（色氨酸合成酶的α,亚基）、44kD（β亚基）处均有明显的蛋白表达带。4种串联表达质粒重组菌的TSase酶活性，分别比含空载体菌相应酶的活性提高2～4倍，PGDH酶活性分别提高约2．1～3．6倍。经摇瓶发酵实验表明酶活性较高的ABA—I菌株色氨酸合成量亦最高，约为对照菌株的20．2倍。

大肠杆菌trpBA基因的克隆表达

目的:提高大肠杆菌中色氨酸合成酶的表达量和表达活性。方法:利用PCR方法从大肠杆菌K-12的基因组中直接克隆出紧密连锁trpB和trpA基因(简称trpBA),并将其连接到原核表达载体pet22b(+)中,得到重组质粒pet22b(+)-trp-BA,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导重组蛋白表达,表达产物经SDS-PAGE分析并用比色法测定其活性。结果:凝胶电泳可见PCR扩增产物大小约为2kb,SDS-PAGE鉴定目的蛋白的Mr分别约为29000和44000,色氨酸合成酶α、β亚基分别得到了高效表达,色氨酸合成酶活性提高到对照菌的3.7倍。结论:成功构建了重组质粒pet22b(+)-trpBA,色氨酸合成酶的表达量和表达活性在大肠杆菌中得到了提高,为高产色氨酸基因工程菌的构建奠定基础。

大肠杆菌aroG基因的定点突变及与trpBA基因的串联表达

为了提高大肠杆菌生产色氨酸的产量,以大肠杆菌中aroG基因编码的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶(DAHPS)与trpBA基因编码的色氨酸合成酶(TSase)两个关键酶为研究对象,利用SOE-PCR方法对aroG基因进行632位碱基定点突变,获得抗反馈抑制的定点突变aroGf br基因,并与扩增获得trpBA基因串联于pEtac表达载体上共表达,获得重组菌Escherichia coli JM109/pEtac-aroGfbr-tac-trpBA,同时构建对照菌株E.coli JM109/pEtac-aroG-tac-trpBA.两种串联表达质粒重组菌的DAHPS酶活性,分别比含空载体出发菌株相应酶的活性提高4.3倍和3.8倍,突变DAHPS酶活提高1.13倍.摇瓶发酵表明,所构建的两菌株与出发菌株色氨酸产量相比较,分别提高8.23倍和11.47倍,带突变aroGf br基因的菌株比对照菌株色氨酸产量提高1.4倍,色氨酸产量明显提高,说明突变菌株能有效解除苯丙氨酸的反馈抑制作用.