聚碳酸乙烯撑酯与双端氨基聚乙二醇交联体系固定化酶载体的合成与表征

将聚碳酸乙烯撑酯 (PVCA)与α,ω-双端氨基聚乙二醇 (H2 N-PEG-NH2 )溶于 DMF,于液蜡中进行交联反应制得亲水性固定化酶载体 ,将其与胰蛋白酶进行偶联反应制备了固定化胰蛋白酶 .酶蛋白的比活力及其于载体上的结合量与反应条件有关 ,当 w(PVCA) / w(H2 N-PEG-NH2 )为 0 .5时 ,二者均处于最高值 .此固定化酶酶促反应的最适 p H值和 Km 值均较之溶液酶有显著提高 。

应用双固定化酶制备大豆肽的研究

采用固定化胰蛋白酶和固定化木瓜蛋白酶分步对大豆分离蛋白进行水解 ,水解后酶解液中大豆肽含量为 1.6 2 8～ 1.70 2mg/mL ,水解度为 5 4.4 %～ 5 7.8%。多肽分子量在 180以下水解度为 11.1%～ 13.5 % ,181～ 2 0 0 0为 11.5 %～ 14 .5 % ,2 0 0 0～ 5 70 0为 2 7.1%～ 2 7.2 % ,5 70 0～ 10 0 0 0为 4 4.7%～ 4 9.6 %。结果表明 :双固定化酶对大豆分离蛋白的水解作用效率高 ,并能有效地将大豆分离蛋白降解为分子量更小的大豆肽。

河川沙塘鳢胚胎、仔鱼发育过程中蛋白酶活性的变化

采用生物化学方法测定和分析了河川沙塘鳢(Odontobutis potam ophila)胚胎、仔鱼发育过程中胃蛋白酶、胰蛋白酶的活性及其变化。结果显示,在胚胎发育初期,其胃蛋白酶的活性一直很低,在孵化前期,其胃蛋白酶的活性增高,之后继续升高,在孵出后5 d的仔鱼,其胃蛋白酶的活性达到最高。在胚胎发育初期,其胰蛋白酶活性相对较高,在眼黑色素出现期时明显升高,而在孵化前期时再次升高,孵出后5 d的仔鱼,其胰蛋白酶的活性亦达到最高。这也说明在河川沙塘鳢的胚胎、仔鱼发育过程中,其蛋白酶的活性总体呈上升的趋势。

乌司他汀对大鼠急性胰腺炎的实验治疗研究

研究了国产乌司他汀对大鼠急性胰腺炎的治疗作用。以胰蛋白酶溶液直接注入大鼠胰导管制备急性胰腺炎模型。模型制备后60min静脉分别给予不同剂量的国产或进口对照品鸟司他汀，观察其对急性胰腺炎大鼠生存率、血清淀粉酶及胰腺病理组织学的影响。结果表明，国产乌司他汀与进口品均可明显提高胰蛋白酶致急性胰腺炎大鼠的生存率，生存率自20％提高至70％（10×104g／kg），显著抑制血清淀粉酶活性升高，改善胰腺病理组织学变化，给药组存活动物胰腺呈轻度急性胰腺炎病变，提示乌司他汀具有细胞保护作用。

两种酶水解明胶的条件筛选及评价

对中性蛋白酶和胰蛋白酶样品进行了以明胶为底物的酶解反应试验,并对两种酶的水解能力进行了比较,确定了两种酶的反应温度、pH值、底物浓度、加酶量以及酶解时间等条件.

应用固定化胰蛋白酶制备大豆肽的研究

采用固定化胰蛋白酶水解大豆分离蛋白制备大豆低肽 ,对固定化胰蛋白酶水解工艺参数等进行了系统研究。结果表明 :固定化胰蛋白酶的最适温度为 6 0℃ ,最适pH为 8.7,最佳底物浓度为 2 .0～ 3.0mg/mL ,大豆分离蛋白的最佳流速为 0 .3mL/min ,大豆分离蛋白的水解率达到 4 5 .6 %,酶解液中大豆肽含量为1.4 6 2mg/mL。酶解液多肽分子量大部分在 10 0 0 0以下。

外周血淋巴细胞染色体G显带技术的改良

目的探讨外周血淋巴细胞染色体吉姆萨(Giemsa)显带技术(G显带技术)的改良,提高G显带效果,并能节约时间,进一步提高染色体诊断效率。方法 250例疑似患者用常规方法进行外周血淋巴细胞培养及制片、烤片,用0.05%胰蛋白酶工作液消化20 s,Giemsa染液染色,并与0.025%胰蛋白酶工作液消化时间5～6 min的常规显带方法对比。结果改良方法的标本片带纹清晰,深浅带反差突出,合格率98%,最佳率72.8%,而常规方法合格率98%,最佳率44.8%,2种方法在得到最佳片数上差异有统计学意义(P<0.01)。结论应用改良技术可缩短染色体制片时间,又能达到最佳效果,同时为工作人员节约时间,及早出结果,可提高临床对染色体病诊断效率,因此本改良方法是值得推广的实验方法。

比较两种方法制备脱细胞小血管支架

目的:比较0.5%Triton X-100+0.05%NH4OH和酶法制备脱细胞小血管支架的效果。方法:分别用含0.5%Triton X-100+0.05%NH4OH处理3 d或1.0%Triton X-100+0.125%胰蛋白酶+DNase+RNase孵育48 h,脱去犬股静脉中的细胞成分,60Co辐照消毒,血清浸泡24 h,将平滑肌细胞和内皮细胞接种到脱细胞支架中;进行H-E染色、胶原纤维和弹力纤维染色,扫描电镜观察及力学检测。结果:0.5%Triton X-100+0.05%NH4OH法完全地脱去了血管细胞;细胞外基质较完整地保留下来,其形态结构与脱细胞前无明显改变;见种植细胞在支架内生长良好,连成片,支架具有良好的生物相容性;力学结果显示其弹性回复率和最大断裂强度好于酶组。结论:两种方法比较,0.5%Triton X-100+0.05%NH4OH法简便易行,成本低,脱细胞效果好,组织相容性佳,对力学性状影响小,是比较理想的制备脱细胞小血管支架的方法。

LaSota毒株胰蛋白酶作用试验

在３７℃条件下，用０．１％和１％胰蛋白酶分别消化新城疫病毒（ＮＤＶ）ＬａＳｏｔａ毒株１２和２４ｈ后，接种１５日龄ＮＤＶ非免疫雏鸡，接种１５ｄ内雏鸡健活，采取血清测定血凝抑制（ＨＩ）抗体效价与对照组无显著差异；用０．１％和１％胰蛋白酶分别作用ＬａＳｏｔａ毒株２、４、１２和２４ｈ后，接种１０日龄ＮＤＶ非免疫鸡胚，鸡胚平均致死时间及尿囊液中病毒血凝（ＨＡ）效价与对照差异不显著；ＬａＳｏｔａ、Ｃｌｏｎｅ－３０和Ｖ４毒株在鸡胚成纤维细胞单层上形成病变需胰蛋白酶协助，而Ｆ８Ｅ４８毒株无需胰蛋白酶协助就能形成细胞病变．本研究表明：ＮＤＶ弱毒经胰蛋白酶消化后在鸡体内、鸡胚中毒力和增殖力未发生变化。

胰蛋白酶和糜蛋白酶与抗生素联用的体外抗菌活性研究

[目的]本研究旨在提供蛋白酶治疗奶牛乳房炎的参考数据,了解胰蛋白酶和糜蛋白酶的体外微生物敏感性。[方法]通过测定细菌的A600绘制不同细菌的生长曲线,探讨了0.5C浓度胰糜蛋白复合酶(胰、糜蛋白酶各0.08 mg·m L-1)、1C浓度胰糜蛋白复合酶(胰、糜蛋白酶各0.16 mg·m L-1)、2C浓度胰糜蛋白复合酶(胰、糜蛋白酶各0.32 mg·m L-1)及其与头孢噻呋钠、磷酸替米考星和硫氰酸红霉素联用对5种常见奶牛乳房炎致病菌(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、巴氏杆菌、无乳链球菌、停乳链球菌)生长的影响。同时,采用电子显微镜扫描技术,观察胰糜蛋白复合酶与头孢噻呋钠协同对大肠杆菌超微结构的影响。[结果]经胰糜蛋白复合酶处理的细菌生长缓慢。1C浓度胰糜蛋白复合酶单独使用时对5种细菌的抑菌效果最佳;2C浓度胰糜蛋白复合酶与各种抗生素配合使用的协同抑菌效果最强。扫描电镜下,胰糜蛋白复合酶对细菌细胞壁结构有明显的损伤,表现为处理组细菌的细胞壁完整程度较差。0.08 mg·m L-1胰糜蛋白复合酶与0.312 5μg·m L-1头孢噻呋钠联用可显著破坏细菌细胞壁结构。[结论]胰糜蛋白复合酶对5种常见奶牛乳房炎致病菌有不同程度的抑菌效果,其与头孢噻呋钠联用后可通过破坏细菌表面结构而发挥协同抑菌作用。

东亚三角涡虫胰蛋白酶Djtry的表达和酶活分析

通过对东亚三角涡虫胰蛋白酶Djtry氨基酸序列比对分析,发现保守的催化三联体结构中第一位的His被Lys所取代。为了探究这种突变是否会对胰蛋白酶的活性有影响,文章构建了原核表达重组质粒pET-28a-Djtry,转化到E.coli BL21中,利用IPTG诱导表达,对表达的重组蛋白进行变性、复性、纯化以及Westernblotting鉴定,获得成分均一的活性蛋白。利用牛胰蛋白酶为标准品,胰蛋白酶特异性底物BAEE,检测Djtry酶活力与比活力。SDS-PAGE电泳表明诱导表达的融合蛋白为包涵体,分子量约为26 kDa,Western blotting结果显示为目的蛋白,对复性纯化的目的蛋白进行酶活检测发现,突变型胰蛋白酶Djtry仍然保持了胰蛋白酶催化性质,但是催化活性相对较弱。

中华眼镜蛇伤致局部组织损伤的临床研究

目的 探讨中华眼镜蛇咬伤致局部组织损伤的最佳治疗方法。 方法 对蛇伤患者分别采用蛇伤药酒外敷、胰蛋白酶或糜蛋白酶局部封闭、抗眼镜蛇毒血清局部封闭共 3种处理方法进行局部治疗 ,观察其疗效。 结果 3种治疗方法从优到劣依次是 :抗眼镜蛇毒血清局部封闭、胰蛋白酶或糜蛋白酶局部封闭、蛇伤药酒外敷。 结论 中华眼镜蛇咬伤致局部组织损伤的治疗方法应首选抗眼镜蛇毒血清局部封闭 ,其次是胰蛋白酶或糜蛋白酶局部封闭 ,最差的是采用蛇伤药酒外敷。

复合皮研究中去除真皮中上皮成分的方法和意义

为探讨用胰酶消化异体真皮来消除其再长出表皮的可能性。通过直接镜检、培养和移植后外观和组织学等方法观察真皮中的毛囊数,以及能否长出表皮。结果表明:用胰酶消化异体真皮80分钟,真皮仍较完整,毛囊数少,培养和移植后不能长出表皮。提示:①用胰酶消化异体真皮能减少带抗原性的上皮成分,消除其长出表皮的可能性。②胰酶消化异体真皮的时间,需要严格控制。

转双价抗虫基因Bt-CpTI提高四倍体菘蓝对小菜蛾抗性

目的将外源苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因CryIA(c)和豇豆胰蛋白酶抑制剂基因CpTI共同转入四倍体菘蓝以获得鳞翅目昆虫小菜蛾抗性。方法构建了以CaMV 35S为启动子,新霉素磷酸转移酶(Npt-Ⅱ)为选择标记,带有CryIA(c)基因和CpTI基因的植物表达载体pGBI121S4ABC并转入根癌农杆菌LBA4404。采用叶盘法遗传转化四倍体菘蓝。转基因再生植株经PCR和Southern杂交检测,并进行抗小菜蛾实验。结果T0代转化四倍体菘蓝的双基因阳性转化率达到16.67%。Southern杂交检测结果表明外源CryIA(c)基因和CpTI基因均已经随机整合到转基因菘蓝的基因组中。与野生对照相比,转基因四倍体菘蓝对小菜蛾显示出明显抗性。结论转双价抗虫基因Bt-CpTI是提高四倍体菘蓝对小菜蛾抗性的有效手段。

固定化胰蛋白酶制备大豆肽正交实验的研究

采用固定化胰蛋白酶水解大豆蛋白,对大豆蛋白的最佳预处理温度进行了探讨,并对制备大豆肽的工艺条件进行了正交实验。结果表明:大豆蛋白的最佳预处理温度为90℃;固定化胰蛋白酶的表观米氏常数为12.5mg/mL。影响酶水解反应显著性的顺序为:温度,pH值,底物浓度,流速;在底物浓度2.7 mg/mL、温度60℃、pH8.7、流速0.6mL/min的条件下,利用固定化胰蛋白酶制备大豆肽,酶解液中的可溶性蛋白含量最大为1.414mg/mL,水解度41.51%。

美洲钩虫蛋白酶抑制剂NaKuI1对蛋白酶的抑制作用的鉴定和特性研究

目的分离美洲钩虫(Necator americanus)Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂1(Na Ku I1)c DNA,并进行原核表达,研究其抑制蛋白酶的效果。方法根据Gen Bank上预测的不完整的Na Ku I基因序列(XM_013449790)设计引物,运用快速扩增c DNA末端技术(SMART-RACE)分别从美洲钩虫成虫c DNA中扩增Na Ku I1 c DNA的5′和3′末端序列,拼接获得全长Na Ku I1 c DNA。将Na Ku I1成熟肽编码基因连接入原核表达载体,构建重组质粒p ET32a-sumo/Na Ku I1,转化至大肠埃希菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导Na Ku I1融合蛋白表达。表达产物包涵体经变性、复性、Ni-NTA亲和层析纯化后,用SUMO蛋白酶切割融合蛋白标签后获得重组蛋白r Na Ku I1。用凝血时间法检测r Na Ku I1的抗凝活性,发色底物法检测其对人纤溶酶、胰蛋白酶、中性粒细胞弹性蛋白酶、组织蛋白酶G和蛋白酶3、猪胰蛋白酶和胰弹性蛋白酶及牛α-胰糜蛋白酶的抑制作用。结果获得Na Ku I1全长c DNA,其编码的多肽由84个氨基酸残基组成,其中含16个氨基酸残基组成的信号肽,68个氨基酸残基组成的成熟肽。成熟肽原核表达产物为不可溶的包涵体。经变性、复性后纯化的r Na Ku I1无抗凝血活性。在100倍摩尔浓度比下,r Na Ku I1对人纤溶酶(5 nmol/L)、人胰蛋白酶(1 nmol/L)和猪胰蛋白酶(5 nmol/L)活性的抑制率近100%,对牛α-胰糜蛋白酶(1 nmol/L)和人中性粒细胞弹性蛋白酶(5 nmol/L)活性的抑制率分别约31.45%和25.18%,对人组织蛋白酶G、蛋白酶3和猪胰弹性蛋白酶均无抑制作用。r Na Ku I1抑制人胰蛋白酶及纤溶酶的抑制常数(ki)分别为(21.17±7.22)和(21.72±3.95)nmol/L。结论成功分离获得Na Ku I1全长c DNA序列,其原核表达产物r Na Ku I1具有较强抑制胰蛋白酶和纤溶酶活性的特点。