蚯蚓中平喘蛋白组分的提取分离及其作用机制的初探

目的初步研究蚯蚓平喘蛋白组分(Eisenia foetidaprotein,EP2)及其平喘活性。方法以新鲜赤子爱胜蚓为原料,通过蛋白质的硫酸铵沉淀和离子交换色谱法,分离得到一组平喘活性蛋白成分(EP2)。采用经典的肺阻力(RL)和动态肺顺应性(Cdyn)指标评价EP2对致敏豚鼠抗原攻击前后的肺功能变化;采用体外试验观察EP2拮抗白三烯D4引起豚鼠离体气管平滑肌的收缩反应;同时应用双向凝胶电泳-质谱技术对蛋白组分EP2进行了初步分析鉴定。结果在整体试验中,EP216.8mg.kg-1口含吞服预处理能明显抑制致敏豚鼠抗原攻击后引起的RL增加和Cdyn下降,作用稍弱于阳性对照药孟鲁司特;在离体试验中,EP2能明显拮抗白三烯D4收缩气管平滑肌的作用,作用强度与孟鲁司特接近;双向凝胶电泳-质谱技术分析证明蛋白组分EP2中含有蚯蚓种属中的蛋白F-I-0、F-I-1以及纤溶酶组分A,均为丝氨酸蛋白酶类胰蛋白酶家族成员。结论EP2具有平喘作用,作用靶点可能通过拮抗白三烯受体,提示EP2的有效成分可能是白三烯拮抗剂。

叶用莴苣叶片蛋白质双向电泳技术体系的建立

为建立适用于生菜的(Lactuca sative L)蛋白质组研究的双向电泳技术(2-DE),以叶用莴苣S24为材料,采用TCA/丙酮沉淀法提取叶片蛋白,比较了2种标准曲线对蛋白浓度测定的影响,同时探讨了蛋白裂解、等电聚焦(IEF)条件以及其他一些关键技术,结果显示:与传统标准曲线相比,采用改良后标准曲线测定的蛋白浓度更准确,得到了背景清晰、重复性好、蛋白点分辨率较高的双向电泳图谱。初步建立了叶用莴苣叶片蛋白质的双向电泳技术(2-DE)体系。

重症肌无力增生型胸腺组织11KD差异蛋白带双向电泳图谱的建立

目的建立分辨率高和重复性好的重症肌无力(MG)增生型胸腺组织11KD差异(异常)蛋白带的二维凝胶电泳图谱。方法首先采用SDS-PAGE电泳筛选出含有11KD差异(异常)蛋白条带的MG增生型胸腺组织,然后富集11KD蛋白条带。以17cm pH3-10固相pH梯度胶条(immobilized pH gradient,IPG)做第一向等电聚焦(IEF),12%SDS聚丙烯酰胺凝胶为第二向进行双向电泳(2-DE),PD Quest 7.1软件分析电泳图谱。结果11KD差异(异常)蛋白条带的出现率为72.2%;通过双向电泳,建立分辨率高和重复性好的重症肌无力(MG)增生型胸腺组织11KD差异蛋白带的双向凝胶电泳图谱,进一步分离11KD差异(异常)蛋白带,共得到(30±6)个蛋白点。结论通过蛋白质组技术快速建立重症肌无力11KD差异(异常)蛋白表达图谱,为进一步研究差异表达蛋白的功能提供实验基础。

斯氏狸殖吸虫成虫可溶性抗原蛋白质分析

目的分析和检测斯氏狸殖吸虫成虫可溶性抗原的特异抗原组分,为建立特异、敏感的免疫学诊断方法、研制抗斯氏狸殖吸虫药物和疫苗提供理论基础. 方法用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、双向电泳(Two-dimensional gel electrophoresis,2-DE) 和免疫印迹(Western blot)等方法,对斯氏狸殖吸虫成虫可溶性抗原进行分析. 结果 SDS-PAGE分离出22条蛋白带, 其中主带8条,分子质量单位为13～64 ku,未见65 ku以上条带.Western blot显示20条显色带, 主带6条,分子质量单位分别为 13、18、22、28、35 和 64 ku.2-DE电泳分离出斯氏狸殖吸虫成虫可溶性抗原48个多肽斑点, 分子质量单位为14～70 ku,绝大部分分布于pI 3.10～7.14,少数分布于pI 8.78～9.85,在 pI 7.14～8.78之间几乎未见多肽斑点.Western blot分析出其中的10个主要多肽斑点能被斯氏狸殖吸虫病患者血清识别,大部分为集中在酸性区域的小分子多肽. 结论斯氏狸殖吸虫成虫可溶性抗原经SDS-PAGE电泳分离出的22条蛋白带中,有6条蛋白含量较高,能被斯氏狸殖吸虫病患者血清识别.2-DE电泳分离出的48个多肽斑点中,有10个含量较高,能被斯氏狸殖吸虫病患者血清识别,大部分为偏酸性的小分子多肽.

刺参(Apostichopus japonicus)腐皮综合症发生相关蛋白的分离与鉴定

采用比较蛋白质组学的方法,对2011年10月20日取自辽宁省普兰店室内养殖厂腐皮综合症刺参和健康个体肠组织中差异表达蛋白进行了研究。结果表明,在优化的电泳条件(80μg脱盐蛋白、pH4—7[NL,13cm]的IPG预制胶条)下,共检测到约700个蛋白质点;表达量差异两倍以上的蛋白点51个,最大表达差异比率为4.32;对其中重复性一致的30个差异点进行质谱鉴定,成功鉴定了23个差异蛋白,包括铁蛋白,过氧化氢酶,泛素相关修饰子3,细胞色素氧化酶和肌动蛋白等;进一步扫描实验室完成的刺参转录组数据,筛选了过氧化氢酶和泛素相关修饰子3的EST序列。本研究是蛋白层面上刺参腐皮综合症发生机制的有效尝试,研究结果为进一步认识该疾病的发生机制提供了参考。

广泛耐药结核分枝杆菌与标准菌株H37Rv菌体差异蛋白的比较

目的比较广泛耐药结核分枝杆菌临床分离株与标准菌株H37Rv菌体蛋白表达的差异,对差异蛋白质分类,以了解结核分枝杆菌广泛耐药可能的机制。方法通过双向凝胶电泳分离XDR菌株和H37Rv菌株菌体总蛋白,将蛋白表达图谱比较分析,差异蛋白点进行质谱鉴定。所获肽序列与生物信息数据库匹配,在NCBI及PIR数据库中查找蛋白质信息,并归纳分析。结果XDR菌株菌体蛋白表达图谱与H37Rv菌株存在差异,XDR菌株中有较多缺失及下调蛋白点,其中氧化还原酶类所占比例较大。切取77个差异点,获得53个蛋白点的肽质量指纹图谱和肽序列,鉴定出可作为潜在临床药物作用靶点的3个蛋白质:ATP依赖性假定蛋白Rv2623、半胱氨酸合酶和蛋白酶体。结论广泛耐药结核分枝杆菌临床分离株与标准株H37Rv在蛋白表达水平上存在差异。初步鉴定3个潜在临床药物作用靶点的蛋白质在进一步功能研究中,为抗广泛耐药结核分枝杆菌新药的研发提供依据。