利用大肠杆菌tyrB-aspA基因串联表达制备L-苯丙氨酸

从大肠杆菌K12菌株中获得tyrB和aspA基因,将2个基因串联并克隆到pλPR质粒上,然后转化到E·coliP2392菌株进行表达。相应酶活力和氨基酸产量检测结果表明,单基因表达和双串联基因串联表达菌株的酶活性成倍提高,与原始菌株相比,AspA活力分别提高243%与239%,TyrB活力分别提高到247%和236%。以基因双串联表达菌株E·coliPBA的菌体悬浮液为酶原,以铵盐、反丁烯二酸和苯丙酮酸为酶转化底物,反应3h后,苯丙酮酸转化苯丙氨酸的效率为93%,苯丙氨酸产率达到0·6g/(g·h)(细胞),是对照菌株的4·7倍。

用PCR法从大肠杆菌K12菌株中克隆tyrB基因

用PCR法从大肠杆菌K12菌株中调出一个长约1.2 kb的DNA片段,该片段插入pKK233-2表达载体后转化tyrB^-菌JP4282,得到3株tyrB^+菌,从3株tyrB^+菌中提取的质粒可用限制性内切酶切出一个1.2 kb长的插入片段,证明该片段具有tyrB基因活性。

外源基因pheA、aroG和tyrB在苯丙氨酸合成途径中的共表达

利用基因工程技术提高了短杆菌的苯丙氨酸合成途径中关键酶活性 ,大幅度地增加了生物合成苯丙氨酸的产量。首先采用聚合酶链反应 (PCR)从大肠杆菌的氟代苯丙氨酸抗性变异菌株基因组中扩增到与苯丙氨酸合成相关的aroG ,pheA和tyrB 3个基因。其中aroG编码 3 脱氧 2 阿拉伯庚酮糖 7 磷酸合成酶 (DS) ,pheA编码双功能酶蛋白 分枝酸变位酶 (CM)和预苯酸脱水酶 (PD) ,tyrB编码转氨酶 (AT)。设计不同的酶切位点 ,利用质粒pUC118的多克隆位点 ,将 3个基因按不同的顺序组合串联 ,然后插入穿梭质粒pCZ 10 ,导入短杆菌中表达。结果表明 3个大肠杆菌基因在短杆菌中能够表达。其中以aroG pheA tyrB顺序串联而构建的黄色短杆菌工程菌株1311 GAB中的DS酶活力提高 4 5倍 ,CM提高 4 2倍 ,PD提高 2 7倍 ,AT提高 3 2倍 ;它的苯丙氨酸合成量提高2 35倍。

大肠杆菌pheA与tyrB基因的克隆与串联表达

为探讨用基因工程的手段改良苯丙氨酸的发酵菌株，采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）的方法，从大肠杆菌总ＤＮＡ中克隆得到了编码苯丙氨酸合成途中的两个关键酶基因－－即分枝酸变位酶（ＣＭ）／预苯酸脱水酶（ＰＤ）基因ｐｈｅＡ与苯丙氨酸转氨酶（ＰＡＴ）基因ｔｙｒＢ，在大肠杆菌中进行了这两个基因的单个和串联表达。ｐｈｅＡ和ｔｙｒＢ基因分别都能在λ噬菌体的Ｐ。启动子之后得到较大量的表达，在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上出现清晰的条带，使表达菌体的蛋白抽提物中ＣＭ／ＰＤ和ＰＡＴ的比活分别提高了１４．１倍／７．９倍和３．５倍．当ｐｈｅＡ和ｔｙｒＢ以ｔｙｒＢ－ｐｈｅＡ的形式进行串联表达时，酶的比活分别提高了４．２倍／２．４倍和２．５倍；而以ｐｈｅＡ－ｔｙｒＢ的形式串联表达时，三种酶的比活分别提高了１７．５倍／８．７倍和３．３倍．结果表明，后一种串联方式的表达效果较好．

利用tyrB与aspA基因在大肠杆菌中的偶联表达制备L-苯丙氨酸(英文)

报道了利用tyrB与aspA串联表达来合成苯丙氨酸.首先将tyrB与aspA串联在质粒pBV221上,构成串联表达质粒pBV-tyrB-aspA;然后将该重组质粒转化到E.coliK36菌株中表达.对基因编码的相关酶活性以及工程菌利用FA和PPA生成Phe进行研究,结果表明:利用AspA和TyrB的偶联反应可以有效的提高E.coliK36合成L-苯丙氨酸的能力.

用于生产L－苯丙氨酸的基因工程菌的构建

本文报道用含ｔｙｒＢ基因（在大肠杆菌中编码芳香族氨基酸转氨酶）的质粒ｐＫＢ７转化不同的突主菌，筛选出ＣＴＢ２菌（ｐＫＢ７转化ＪＭ１０７得到）表达的芳香族氨基酸转氨酶活力最高。进一步研究证明ＣＴＢ２菌在菌浓度为２０ｍｇ／ｍｌ，温度３０℃，反就６０分钟．能催化苯丙酮酸加氨生成大量的Ｌ－苯内氮酸，而没有付产物酪氨酸生戊。以从ＣＴＢ２菌中提取纯化出的质粒为模板，经ＰＣＲ扩增反应可以得到约长１．２ｋｂ的ｔｙｒＢ基因片段，ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳实验表明ＣＴＢ２菌可溶性蛋白在分子量约４００００，有一条明显加深的蛋白区带，这与理论估算的芳香族氨基酸转氨酶的分子量４３０００基本一致。而ＪＭ１０７和含ｐＫＫ２３３－２空质粒的ＪＭ１０７在该位点的区带则没有加深，该加深区带的蛋白含量占到总溶性蛋白的２０％左右。

茶树内生草螺菌ZXN111生长素合成及其对云抗-10号植物的促生功能

【目的】以紫娟茶树分离的内生菌水生草螺菌ZXN111为研究对象,通过分子遗传学方法证实该菌株植物生长素吲哚3-乙酸(IAA)合成的主要分子途径。【方法】参考草螺菌基因组信息中IAA合成基因簇,选取与IAA合成密切相关的候选基因,即芳香族氨基酸转氨酶基因(tyrb),通过基因插入突变与基因互补方法,结合茶树组培苗体内促生能力分析,初步验证水生草螺菌生长素合成的主要机制。【结果】植物生长素IAA合成候选基因tyrb突变后,突变株tyrb::pK19mobΩ2HMB 48 h的IAA合成量显著低于野生型菌株ZXN111,且tyrb基因互补后,互补株tyrb::pK19mobΩ2HMB(+)的IAA合成能力得到了显著恢复。茶树促生实验发现,突变株tyrb::pK19mobΩ2HMB接种组的茶树组培苗根长、根重及植株鲜重指标上均显著低于野生菌处理组。【结论】水生草螺菌ZXN111有多条IAA合成途径,其中的吲哚-3-丙酮酸(IPA)是最主要途径,其生长素合成对寄主茶树具有显著的促生功能。