幽门螺杆菌ureC和23SrDNA数字PCR检测体系的建立

为了建立幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)ureC和23S rDNA基因的数字PCR检测体系,为Hp检测提供一个可靠的参考方法,根据Hp ureC和23S rDNA基因序列,设计了特异性引物和探针,采用质控菌评估了检测特异性;通过设定引物浓度和退火温度的梯度,对检测参数进行了优化;通过梯度法稀释DNA模板,评估了检测灵敏度;使用不同浓度模板开展了重复性检测,以评估检测精密度。经过评估,该检测方法能够特异性地用于ureC和23S rDNA基因的检测,并且不受大肠杆菌等细菌干扰。ureC和23S rDNA的最佳反应温度均为55.8℃,而最佳引物浓度分别为550和650 nmol·L^(-1),通过线性分析,两种基因的拟合度R^(2)值分别高达0.9991和0.9997,显示了良好的线性关系。此外,不同浓度样品的变异系数(CV)均小于10%,说明该检测方法具有高度的重复性。研究成功建立了Hp ureC和23S rDNA基因数字PCR检测体系,具备高度的特异性、灵敏度和重复性,为幽门螺杆菌的检测、诊断和科学研究提供了一个可靠的检测方法和技术支持。

在真核细胞中表达的幽门螺杆菌UreC,OipA抗原性的检测及其对细胞的作用

目的:研究幽门螺杆菌(Hp)UreC、OipA基因重组子转染胃上皮细胞后表达产物的抗原性及其对胃上皮细胞的作用,为两种毒力因子DNA疫苗的研制提供可行性依据及安全性指标。方法:用RTPCR方法从国际标准株NCTC11637中获取UreC、OipA全长基因,克隆入pGEMTEasy载体并测序,以重组T载体为模板,将两种基因的开放读码框架分别定向克隆入pcDNA3.1载体;获得的重组子转染SGC7901细胞,筛选耐潮霉素的细胞克隆,用RTPCR及Immunoblot方法检测细胞内UreC、OipA蛋白的表达和抗原性;用荧光染色技术、MTT、流式细胞术分别检测UreC、OipA对细胞表型、增殖及凋亡的影响。结果:SoipA、SureC细胞(分别转染OipA、UreC重组子)表达相应的产物且具有抗原性。荧光显微镜下观察SoipA、SureC细胞未见明显形态学改变;用MTT法检测细胞增殖:SoipA、SureC细胞与SpcDNA3.1细胞(转染pcDNA3.1)比较,生长增殖无显著性差异(P>0.05),流式细胞技术检测细胞凋亡结果:SoipA和SureC的凋亡率与SpcDNA3.1比较无显著性差异(P>0.05)。结论:OipA、UreC在培养细胞内的表达产物具有抗原性且对细胞的功能无影响,可考虑用于制备DNA疫苗。

沿海地区副溶血弧菌的表型及其主要毒力基因分布特征

为了调查浙江沿海地区副溶血弧菌的分布及其携带毒力基因的特征,在舟山、象山、温州三地实地采样385份,包括海水、泥土和水产品等,共分离到副溶血弧菌菌株278份,其中27株为tdh基因阳性,阳性率为9.7%,trh与ureC基因的阳性率分别为22.3%与11.8%,提示浙江沿海地区广泛存在着致病性副溶血弧菌污染。将不同来源副溶血弧菌的tdh和trh基因进行序列测定,进化树分析发现,环境分离株中tdh基因与临床分离株中tdh基因区分为2簇,而环境分离株与临床分离株中trh基因之间却没有明显的差异。研究结果可为浙江沿海地区副溶血弧菌的风险评估提供参考。

幽门螺杆菌16SrDNA指纹图和PCR-RFLP基因分型研究

目的 探讨我国幽门螺杆菌 (Helicobacterpylori,Hp)的基因多态性及其与相关疾病之间的关系。 方法 应用PCR掺入法制备 16SrRNA基因探针 ,建立 16SrDNA指纹图技术和尿素酶C(ureC)基因的PCR -RFLP法 ,并结合统计学软件进行聚类分析 ,对临床分离的 14株Hp进行基因分型。结果 14株Hp的 16SrDNA指纹图谱显示 10个HaeⅢ杂交带型和 12个HindⅢ杂交带型 ;ureC基因的变异度较小 ,14株Hp中有 12株PCR -RFLP图谱完全一致。通过杂交结果示意图和SPSS10 0软件进行聚类分析 ,HaeⅢ、HindⅢ及两种酶杂交结果的综合 ,均将 14株Hp分为两型。两种方法结果综合进行聚类分析 ,14株Hp在基因水平上分为三型。结论 差异显著的DNA指纹图谱说明了不同Hp菌株间基因组结构的高度变异性。 16SrDNA指纹图谱较ureC基因的PCR -RFLP谱型更敏感地表达Hp各菌株的变异 ,可准确有效地对Hp作出基因分型。

幽门螺杆菌尿素酶C基因的克隆表达及其免疫原性的鉴定

目的 利用 PCR方法扩增 Hp ure C基因 ,将其克隆入表达载体 p BV2 2 0中以表达 Hp ure C重组蛋白 ,并验证其抗原性和免疫原性 .方法 用 PCR方法从 Hp临床株中扩增Hp ure C基因 ,经 Eco R 和 Bam H 双酶切后克隆入 p GEM-3Zf(- )中 ,用全自动测序仪进行双向测序 .然后将目的片段克隆入表达载体 p BV2 2 0中 ,温度诱导表达 Hp ure C重组蛋白 .用 Western Blot实验验证表达蛋白的抗原性 ,用免疫动物实验验证其免疫原性 .结果 用 PCR方法从 Hp临床株中扩增得到了一段 1173bp的 Hp ure C基因片段 ,对其进行测序 ,经BL AST分析证明所得 DNA序列与 Hp标准菌株 M6 0 398的同源性为 95 % .通过温度诱导 ,获得了 Mr为 4 4× 10 3的 Hpure C重组蛋白质 .经 Western Blot实验和免疫动物实验证实表达的蛋白质有较强的抗原性和免疫原性 .结论 成功地在E.coli中表达了 Hp ure C重组蛋白并证明其有较强的抗原性和免疫原性 .

Carcinogenic Helicobacter pylori in gastric pre-cancer and cancer lesions: Association with tobacco-chewing

AIM: To investigate the low gastric cancer incidence rate relative to the highly prevalent Helicobacter pylori (H. pylori) infection; data relevant to H. pylori infection during gastric carcinogenesis in Indian patients is currently lacking.

微波固态准光功率合成技术

近年来，越来越迫切需要大功率微波毫米波固态源。单个器件产生的功率非常有限，需将多个器件的功率加以合成。随着频率的提高，传统的封闭式谐振腔由于其固有的缺陷妨碍了微波、毫米波技术的发展，于是空间功率合成的概念应运而生。在过去十几年所尝试的各种方法中，准光学功率合成是最为成功的技术。本文综述了近２０ 年来准光学功率合成技术所取得的成就，并提出急待解决的问题。

美国尤雷考茨公司发现了“未来的塑料”

尤雷考茨(Urecoats)工业公司,最近受到特别 的关注,许多投资人和经纪公司人员都飞往佛罗里达州Pompano的Urecoats工厂访问。人们相信:Urecoats的一种新产品--Urecoats100橡胶密封剂膜片是“未来的塑料”。

宏基因组学方法分析奶牛瘤胃尿素分解菌的多样性

利用脲酶保守序列ureC引物和细菌16S rDNA通用引物PCR扩增并测序,揭示奶牛瘤胃尿素分解菌的多样性。提取本研究室前期鉴定的16个脲酶克隆的质粒,利用脲酶保守序列ureC引物和细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增,将PCR产物连接到pMD19-T载体,转化E.coliJM109,挑取阳性克隆测序。利用Blast程序将序列与GenBank和RDP数据库进行比对,并使用Mega 4.0软件构建系统发育树。4个脲酶克隆含有脲酶保守序列ureC,系统发育树分析表明,U1、U5、U13和U15分别属于Firmicutes、ε-Proteobacteria、β-Proteobacteria和Actinobacteria;7个脲酶克隆含有16S rDNA,经过建树分析,U1、U3、U7、U10、U11、U12和U14分别属于Staphylococcus、Shigella、Bacillus、Acinetobacter、Achromobacter、未培养微生物和Bacillales。实验结果显示,奶牛瘤胃微生物脲酶基因和尿素分解菌具有多样性的特点。

用蛋白芯片技术检测幽门螺杆菌抗体在临床上的应用

目的:通过检测幽门螺杆菌(HP)患者血清中细胞毒素相关蛋白(CagA)、尿素酶(UreC)、热休克蛋白(HSP60)的抗体谱,探讨HP感染的消化道疾病患者在不同年龄组的分布及种类的差异。方法:采用蛋白芯片方法对457例临床患者HP血清进行检测。结果:检测出HP阳性率为89.72%,高于广州地区(63.1%),其中老年组检测率最高为91.59%。老年组UreC抗体阳性率为74.30%,高于儿童组和青年组,差异有统计学意义。CagA、UreC感染的毒力株以青年组为主,高于儿童组和老年组。结论:提示HP感染的青年组以UreC、Ca-gA为主,老年组以UreC和UreC、HSP60为主。通过筛查不同的抗体类型,可为临床诊断治疗消化道疾病提供重要的指导意义。