UT-B基因敲除小鼠睾丸间质细胞睾酮分泌水平变化及其对性成熟的影响

目的:利用尿素通道蛋白B(UT-B)基因敲除小鼠模型探讨UT-B基因对雄性小鼠睾丸间质Leydig细胞分泌睾酮能力的影响。方法:饲养、繁殖并鉴定UT-B基因敲除(UT-B-/-)小鼠;选取4周龄遗传背景相同的野生型(UT-B+/+)雄性小鼠和UT-B-/-雄性小鼠各5只,采用放射免疫法检测2种小鼠血清睾酮和黄体生成素(LH)水平;分离培养并鉴定Leydig细胞,测定培养液上清中睾酮的水平。结果:成功获得UT-B-/-雄性小鼠和UT-B+/+雄性小鼠;成功分离培养原代Leydig细胞并经3β-HSD染色方法鉴定纯度达80%以上;4周龄UTB-/-雄性小鼠血清睾酮水平[(7.29±1.27)×10-2μg.L-1]明显高于UT-B+/+雄性小鼠[(5.53±1.58)×10-2μg.L-1](P<0.05),2种小鼠血清LH水平比较差异无统计学意义(P>0.05);UTB-/-雄性小鼠Leydig细胞培养上清中睾酮水平[(17.300±1.179)nmol.L-1]明显高于UT-B+/+雄性小鼠[(12.300±0.916)nmol.L-1](P<0.01)。结论:4周龄UT-B-/-雄性小鼠Leydig细胞分泌睾酮的能力明显高于UT-B+/+小鼠,这可能是UT-B-/-雄性小鼠比UT-B+/+小鼠生殖育龄提前的原因之一。

2mol/L尿素溶血试验在UT-B基因敲除小鼠核型鉴定中的应用

目的探讨2 mol/L尿素溶血试验在UT-B基因敲除小鼠核型鉴定中的作用。方法(1)按SP级动物饲养标准进行饲养和繁殖;以UT-B基因敲除纯合子(UT-B-/-)成年雄鼠与C57/bl雌鼠合笼,繁殖出UT-B基因敲除杂合型小鼠(UT-B+/-,F1代),F1代UT-B+/-雄、雌鼠交配获F2代小鼠。(2)取F2代小鼠剪尾提取基因组DNA进行核型鉴定筛选纯合子小鼠(UT-B-/-)和野生型小鼠(UT-B+/+);(3)应用2 mol/L尿素溶血试验和肾脏RT-PCR进行UT-B-/-(JKnull)表型鉴定。结果(1)在SP级饲养和繁殖的条件下,已获得足够的UT-B-/-和UT-B+/+小鼠;(2)2 mol/L尿素溶血试验证明,UT-B+/+小鼠和UT-B+/-小鼠的红细胞加入到2 mol/L尿素中立刻溶血,UT-B-/-小鼠的红细胞10 min内不溶显示溶血抵抗。结论2 mol/L尿素溶血试验可准确地鉴定出UT-B-/-小鼠,与基因组DNA的PCR鉴定方法联合应用,可以使引进的UT-B-/-小鼠稳定繁殖、传代。

高碱环境下青海湖裸鲤氮废物排泄及相关基因的表达规律

采用个体生理学及定量PCR方法,研究了青海湖裸鲤(Gymnocypris przewalskii)在32 mmol/L(CA32)和64 mmol/L(CA64)碳酸盐碱度胁迫下氮废物排泄规律及鳃和肾组织中Rhesus type b glycoproteins(Rhbg)、Rhesus type c2 glycoproteins(Rhcg2)与urea transporter(Ut)基因的表达规律。结果显示,在32 mmol/L碱度胁迫整个过程中及64 mmol/L碱度胁迫初期裸鲤氨氮排泄率显著降低,但在64 mmol/L碱度胁迫8~20 h、24~72 h时氨氮排泄率基本恢复到胁迫前水平,在32 mmol/L碱度胁迫12~16 h、20~24 h及64 mmol/L碱度胁迫16~48 h时尿素氮排泄率显著升高。定量PCR结果显示,Rhbg、Rhcg2、Ut基因在胁迫过程中都有表达上调趋势,其中32 mmol/L碱性环境下鳃组织中Rhbg基因在胁迫12 h时表达明显上调;64 mmol/L碱性环境下鳃组织中Rhcg2基因在胁迫6 h、48 h、72 h表达明显上调,Ut基因在胁迫6 h表达明显上调,肾组织中Rhcg2基因在胁迫6 h表达明显上调。以上结果表明,裸鲤在高碱环境下虽然前期氮废物排泄受到抑制,但后期会通过启动Rh基因高表达恢复氨氮排泄,同时启动Ut高表达来增加尿素氮排泄来进行氮废物排泄。这一特殊氮废物排泄策略有助于裸鲤更好地适应高碱性环境。

大鼠尿素转运蛋白B基因克隆及真核表达载体的构建

目的克隆sD大鼠尿素转运蛋白B（ureatransporterB，UT-B）的CDS全长基因并构建其真核表达载体。方法从SD大鼠肾髓质中提取总RNA并经逆转录反应获取总cDNA，以cDNA为模板，PCR扩增UT-B基因的CDS区全长片段，PCR产物加＂A＂尾后克隆至pMD-18T克隆载体，双酶切后获取UT-B片段，T4DNA连接酶将UT-B片段与KpnI和BamHI双酶切后的真核表达载体pcDNA3-1（-）连接，构建大鼠UT-B真核表达载体pcDNA3．1（-）-UT-B。结果成功克隆了sD大鼠UT-B基因，构建的pcDNA3．1（-）-UT-B载体经PCR扩增、KpnI和BamHI双酶切鉴定及测序验证，表达载体包含UT-B基因，且UT-B碱基序列与GeneBank中收录的大鼠UT-B序列-致。结论成功克隆了该基因并构建了其真核表达载体pcDNA3．1（-）-UT-B，为进-步进行UT-B基因转染治疗尿毒症的研究奠定了基础。

尿素通道蛋白B基因敲除小鼠心脏电生理特性的改变

目的:研究尿素通道蛋白B(UT-B)基因敲除对小鼠心脏电生理特性的影响。方法:使用常规的心电图、心肌细胞动作电位记录方法和膜片钳实验技术。结果:①UT-B基因敲除小鼠30%发生了不同程度的心律失常,而对照组的野生C57小鼠无一例发生心律失常。②基因敲除小鼠心室肌细胞动作电位幅值(APA)及最大除极速度(Vmax)明显受到抑制(P<0.05),而心室肌细胞动作电位复极50%、90%时程(APD50、APD90)和正常对照组比明显延长(P<0.05)。③基因敲除小鼠心室肌细胞膜上钠离子通道电流幅值和对照组比明显降低(p<0.01)。结论:UT-B基因敲除可以导致小鼠心脏电生理特性发生改变。

瘤胃上皮转运尿素的研究进展

尿素循环进入瘤胃后,尤其是在低蛋白日粮下,可以为微生物蛋白的合成提供一定的氮素。对尿素经瘤胃壁进入瘤胃的转运过程及其影响因素等方面进行了综述。

尿素通道蛋白B基因敲除对小鼠心电图与心肌动作电位的影响

尿素通道蛋白B(UT-B)为介导尿素跨膜转运的通道蛋白,在肾脏和其他肾外组织,如红细胞、脑、心脏、膀胱和睾丸等组织、细胞中广泛表达.为探讨UT-B缺失对心脏表型的影响,应用RT-PCR,Westernblot检测UT-B mRNA,UT-B蛋白在野生型小鼠(UT-B+/+)和UT-B基因敲除纯合子小鼠(UT-B+/+)心脏组织的表达情况,对比观察6,16,52周UT-B基因敲除纯合子(UT-B+/+)与野生型小鼠肢体Ⅱ标准导联心电图,应用悬浮微电极法记录分离的16周小鼠心室肌细胞动作电位各参数变化.结果显示UT-B的mRNA和蛋白在UT-B+/+小鼠心脏有表达,而UT-B+/+小鼠无表达;UT-B+/+小鼠P-R间期((43.5±4.2),(45.5±6.9),(43.8±7.6)ms)明显长于UT-B+/+小鼠((38.6±2.9),(38.7±5.6),(38.2±7.3)ms,P<0.05),随增龄P-R间期无明显延长,但老龄组(52周)Ⅱ度和Ⅲ度房室传导阻滞发现率超过20%;动作电位记录结果显示UT-B+/+小鼠的动作电位幅值(APA),动作电位最大除极速度(Vmax)与UT-B+/+小鼠比较,前者明显受到抑制(P<0.05),其APD50,APD90明显延长(P<0.05).总之,本研究发现野生型小鼠心肌有UT-B表达,UT-B基因敲除导致小鼠进展型心脏传导阻滞,提示UT-B在介导心肌电生理特性方面有重要作用.

饲料中添加沸石对慢性肾衰犬结肠尿素转运蛋白B及氨转运体蛋白Rh表达的影响

本研究旨在探究沸石对慢性肾衰犬结肠尿素转运蛋白B及氨转运体蛋白Rh表达的影响。选取15条2岁左右的中华田园犬,采用肾动脉结扎制作慢性肾衰(CRF)模型,另取5只犬仅腹壁切开作为假手术对照组(SOG)。造模成功后,随机等分成3组:模型组(MD)、低剂量沸石组(LCD)和高剂量沸石组(HCD),SOG组与MD组饲喂基础饲料,LCD组为1%沸石饲料,HCD为5%沸石饲料,试验连续4周。用自动化血液生化仪检测血清尿素氮(BUN)和粪尿素氮(FUN),用谷氨酸脱氢酶法测定门静脉血氨,用尿素检测试剂盒测定尿尿素量(uUrea),qRT-PCR检测结肠黏膜尿素转运蛋白B(UT-B)、氨转运体蛋白b(Rhbg)与氨转运体蛋白c(Rhcg)mRNA表达,Western blot法检测UT-B、Rhbg与Rhcg的蛋白表达。结果显示,MD组的BUN、FUN及门静脉血氨均高于SOG组,uUrea降低(P<0.01),与MD组比较,HCD组的BUN、FUN、门静脉血氨均显著降低(P<0.05);MD组Rhbg、Rhcg的mRNA表达显著高于SOG组(P<0.05),与MD组比较,HCD组Rhbg、Rhcg及LCD组Rhcg的mRNA表达显著下调(P<0.05),各组间UT-B的mRNA表达无显著变化(P>0.05);MD组Rhbg、Rhcg的蛋白表达显著高于SOG组(P<0.05),与MD组比较,HCD组Rhbg、Rhcg的表达降低,MCD组Rhcg表达降低,差异显著(P<0.05),各组间UT-B表达无差异;Pearson相关性分析发现,慢性肾衰犬BUN水平与Rhcg呈强的正相关(r=0.855,P<0.05),与Rhbg呈中等正相关(r=0.769,P<0.05)。以上结果表明,沸石具有促进CRF犬BUN经肠排泄的作用,与结肠黏膜Rhbg、Rhcg的表达下调有关,以添加5%剂量最佳。