慢性肾炎血瘀证血尿Col-Ⅳ LN的改变及丹参注射液的作用初探

目的:观察肾功能正常的慢性肾炎血瘀证患者的血、尿Ⅳ型胶原(Col-Ⅳ)及层粘蛋白(LN)含量的变化与中医本虚证、血瘀证症状积分的关系及临床应用价值;观察复方丹参注射液治疗前后的血、尿Col-Ⅳ及LN含量的变化,探讨复方丹参注射液治疗肾脏纤维化的疗效及可能机制。方法:采用双抗体夹心酶联免疫吸附(ELISA)法测定67例肾功能正常的慢性肾炎血瘀症患者和20例健康人的血、尿Col-Ⅳ与LN含量,观察以上指标与中医本虚证及血瘀证症状积分的关系;67例慢性肾炎患者随机分为35例复方丹参治疗组和32例对照组,对照组给以潘生丁、雷公藤多苷等常规处理,伴肾病综合征者加用激素,血压高者加用降压药,治疗组给予以上对照组治疗+复方丹参注射液50mL静脉滴注。比较治疗前后两组的血、尿Col-Ⅳ及LN含量的变化。结果:与健康人相比,慢性肾炎组患者血、尿Col-Ⅳ及LN水平均明显增高(P<0.05);各本虚证型血、尿Col-Ⅳ及尿LN较健康者均明显增高(P<0.01),气阴两虚与健康者相比,血LN明显增高(P<0.01),气阴两虚与肺肾气虚比较,血Col-Ⅳ及血、尿LN均明显增高(P<0.05),脾肾阳虚与肝肾阴虚比较,尿Col-Ⅳ明显下降(P<0.01);各血瘀证组与健康人组比较,血、尿Col-Ⅳ及LN均明显增高(P<0.05,P<0.01),而各血瘀证组间两两比较,各指标均无显著差异,Spearm an相关分析结果显示,血、尿Col-Ⅳ与LN水平与血瘀证积分均无线性相关关系;治疗组治疗前后血Col-Ⅳ、LN及尿Col-Ⅳ、LN均明显下降(P<0.05)。治疗组与对照组治疗前后血Col-Ⅳ、LN及尿Col-Ⅳ、LN差值比较有显著差异(P<0.05)。Spearm an相关分析:治疗前后血Col-Ⅳ与血LN二者水平的改变呈显著正相关(P<0.01)。结论:肾脏纤维化可能是慢性肾炎血瘀证的内在物质基础,肾脏纤维化是肾脏局部的血瘀状态,即所谓的微型癥积。外在的血瘀证症状积分难于体现肾脏局部的瘀血严重程度。复方丹参注射液对于减轻慢性肾炎的纤维化程度,延缓纤维化进展可能有一定的益处,其抗肾脏纤维化作用可能是通过多个途径而实现的。对延缓肾脏纤维化的治疗提供了又一药物选择。

慢性肾小球肾炎血、尿Ⅳ型胶原及尿黏蛋白的改变与肾脏病理关系初探

目的:观察肾功能正常的慢性肾炎患者的血、尿Ⅳ型胶原(Col-Ⅳ)及层黏蛋白(LN)含量的变化与肾脏病理改变的关系及临床应用价值。方法:(1)采用双抗体夹心酶联免疫吸附(ELISA)法测定67例肾功能正常的慢性肾炎患者和20例健康人的血、尿Col-Ⅳ与LN含量。(2)慢性肾炎患者均接受肾活检病理检查。观察以上指标与肾脏病理改变的关系。结果:(1)与健康人相比,慢性肾炎组患者血、尿Col-Ⅳ及LN水平均明显增高(P<0.05)。(2)系膜细胞增生Ⅲ级组、Ⅳ级组与健康人组比较,血、尿Col-Ⅳ及LN均明显增高(P<0.05)。系膜细胞增生程度与血Col-Ⅳ水平关系最密切(P<0.05)。(3)各系膜基质增生组与健康组比较,血、尿Col-Ⅳ及LN均显著增高(P<0.05)。系膜基质增生程度与尿Col-Ⅳ水平关系最为密切(P<0.05)。(4)肾小球球性硬化10%～25%组与健康人比较,血、尿Col-Ⅳ及LN均明显增高(P<0.05)。硬化率与血LN关系最密切(P<0.05)。(5)间质纤维化程度与尿Col-Ⅳ水平关系最密切(P<0.01)。(6)小管萎缩≤10%者较健康者,尿Col-Ⅳ、LN均显著增高(P<0.01)。小管萎缩>5%者较健康者,血Col-Ⅳ明显增高(P<0.01)。小管萎缩>10%者尿Col-Ⅳ则明显降低(P<0.05)。(7)血Col-Ⅳ水平与血LN水平正相关(P<0.01)。尿Col-Ⅳ水平与尿LN水平正相关(P<0.01)。但血、尿Col-Ⅳ水平之间及血、尿LN水平之间均无线性相关关系。结论:(1)肾功能正常的慢性肾炎患者血、尿Col-Ⅳ与LN水平显著高于健康人群。(2)血与尿Col-Ⅳ、LN水平的变化可在一定程度上反映肾脏病理的改变,与系膜细胞基质的增生程度、间质纤维化、肾小球球性硬化有一定的关系。但血Col-Ⅳ、LN水平主要反映了Col-Ⅳ、LN代谢的活跃,与系膜细胞增生关系更为密切;而尿Col-Ⅳ、LN水平则与基质增生、间质纤维化关系更为密切。它们之间均存在着相关关系。因此监测血与尿Col-Ⅳ、LN的动态变化,综合判断,对于监测肾脏纤维化倾向有一定价值。

降糖三黄片对早期糖尿病肾病大鼠肾组织TGF-β1/Smad1信号通路的影响

目的:观察降糖三黄片对早期糖尿病肾病大鼠肾组织中转化生长因子β1(TGF-β1)、Smad1、Co1-Ⅳ的影响,探讨其对肾脏的保护作用。方法:将80只SD大鼠随机分为正常组11只、造模组69只。腹腔内注射链脲佐菌素(STZ)复制糖尿病肾病大鼠模型。造模成功的大鼠随机进一步分为模型组、厄贝沙坦组(给药量0.027 g·kg-1·d-1)、降糖三黄片组(给药量0.675 g·kg-1·d-1),给药8周后处死。于治疗前、模后4周、8周各组大鼠测血糖、称体重;造模成功后、实验结束前收集24 h尿液测定尿微量白蛋白。实验结束后摘取肾脏,去包膜称重;分别用免疫组化染色法及荧光定量RT-PCR法检测smad1、Ⅳ型胶原(Col-Ⅳ);用双抗体夹心法(ELASA)检测肾组织TGF-β1。结果:造模后各组大鼠体重明显减轻,降糖三黄片、厄贝沙坦与模型组比较,肾重/体重指数下降(P<0.01)。降糖三黄片、厄贝沙坦与模型组比较尿微量白蛋白水平下降(P<0.05)。降糖三黄片与模型组、厄贝沙坦组相比,能较好地降低血糖(P<0.01);降糖三黄片、厄贝沙坦均能明显抑制糖尿病肾病大鼠肾组织中TGF-β1的表达(P<0.01)。免疫组化染色表明厄贝沙坦组和降糖三黄片组比模型组smad1、Col-Ⅳ阳性表达程度显著减弱。免疫组化图像染色指数及荧光定量RT-PCR法结果提示降糖三黄片能降低smad1、Col-Ⅳ水平(P<0.05),且与厄贝沙坦作用相近。结论:降糖三黄片可通过抑制肾组织TGF-β1/smad1通路的表达,降低Col-Ⅳ的沉积,使肾脏的异常结构得到改善,延缓肾小球硬化。

加味黄芪赤风颗粒治疗慢性肾脏病(1-2期)蛋白尿的疗效及机制研究

目的评价加味黄芪赤风颗粒治疗慢性肾脏病(chronic kidney disease, CKD)(1-2期)蛋白尿的疗效,并探讨其作用机制。方法将100例辨证属脾肾气虚兼血瘀证的CKD(1-2期)患者通过随机数字表分为试验组(50例)和对照组(50例)。在基础治疗之上,试验组给予加味黄芪赤风颗粒,对照组给予贝那普利片。治疗24周后,比较两组24h尿蛋白定量、中医证候积分、血清层粘连蛋白(laminin, LN)、IV型胶原蛋白(collagen typeⅣ,ColⅣ)的差异,并观察安全性指标。结果 (1)两组临床疗效比较,差异无统计学意义(P>0.05);试验组中医证候疗效总有效率高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)治疗前,两组24h尿蛋白定量、中医证候积分、LN和ColⅣ差异无统计学意义(P>0.05)。治疗后,两组24h尿蛋白定量、中医证候积分、LN和ColⅣ与同组治疗前比较均有减少,差异有统计学意义(P<0.05);试验组24h尿蛋白定量、LN和ColⅣ与对照组比较无明显差异(P>0.05),试验组中医证候积分较对照组下降,有统计学差异(P<0.05)(3)与治疗前比较,两组HGB、ALT、AST均治疗后组内比较无异常降低或升高,差异无统计学意义(P>0.05)。与治疗前比较,试验组Scr下降有统计学意义(P<0.05)。结论加味黄芪赤风颗粒治疗CKD(1-2期)蛋白尿有效且安全性较好,其作用机制可能与该方降低血清ColⅣ、LN水平,抑制肾脏纤维化相关。

内皮素-1对人腹膜间皮细胞合成细胞外基质及转化生长因子β_1的影响

目的:研究内皮素1(ET1)及非特异性内皮素受体拮抗剂即ETA/ETB拮抗剂PD142893对人腹膜间皮细胞(HPMC)分泌细胞外基质(ECM)及转化生长因子β1(TGFβ1)产生的影响。方法:以人腹膜间皮细胞株(HMrSV5)为研究对象,采用放免法、半定量逆转录多聚酶链反应(RTPCR)观察不同浓度的葡萄糖及PD142893对HPMCET1、Ⅳ型胶原(ColⅣ)、纤连蛋白(Fn)分泌和基因表达的影响,及TGFβ1蛋白水平(ELISA),基质金属蛋白酶2(MMP2)基因表达(RTPCR)。结果:①葡萄糖对ET1的影响:高浓度葡萄糖增加HPMCET1的分泌及基因表达,葡萄糖浓度为50、100、150mmol/LET1分泌分别为(2.57±0.18)、(2.82±0.89)、(4.12±0.83)pg/ml·105cell,呈剂量依赖。②ET1促进HPMC分泌ColⅣ,增强ColⅣ、MMP2mRNA的表达。PD142893可下调高糖诱导的ColⅣ、Fn和MMP2。③ET1刺激HPMC分泌TGFβ1呈剂量依赖,ET1浓度为0、10、50、100nmol/L时分泌TGFβ1分别为(2141.74±45.16)、(2181.6±95.13)、(4360.58±139.74)、(6966.88±444.93)pg/ml·105cell,PD142893可明显抑制高糖诱导TGFβ1的分泌。结论:ET1促进HPMC分泌ECM,高糖诱导间皮细胞ECM合成与ET1及TGFβ1途径有关。

转染Smad2基因的大鼠肾系膜细胞纤连蛋白和Ⅳ型胶原表达的改变（摘要）

目的通过对大鼠肾小球系膜细胞(MsC)转染Smad 2基因,观察转染的阳性细胞克隆纤连蛋白(FN)及Ⅳ型胶原(ColⅣ)表达的改变,以探讨转化生长因子β(TGF-β)/Smad信号转导通路引起细胞外基质积聚导致肾小球硬化发生的分子机制.方法经磷酸钙介导将含有Smad 2重组表达质粒转染大鼠MsC,用G418筛选及Western印迹分析法鉴定,又分别采用Western印迹分析法和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染阳性细胞克隆FN及ColⅣ表达的改变.结果成功建立高表达Smad 2蛋白的阳性MsC克隆(T-12、T-31、T-35、T-40),并证实其FN及ColⅣ的mRNA和蛋白的表达水平均明显上调.阳性MsC克隆FN蛋白为对照组2.4倍(P＜0.05),mRNA为对照组的2.7倍(P＜0.05);阳性MsC克隆ColⅣ蛋白为对照组的2.9倍(P＜0.01),mRNA为对照组的3.3倍(P＜0.01).结论TGF-β/Smad信号转异途径中Smad 2可能是促进FN及ColⅣ在肾小球中积聚,是导致肾小球硬化发生的重要信号转导分子.

益气活血方对慢性肾炎患者血、尿Ⅳ型胶原和层粘蛋白的影响

目的:观察中药益气活血方对慢性肾炎患者血、尿Ⅳ型胶原和层粘蛋白的影响。方法:将入选120例患者随机分为治疗组和对照组,每组各60例,健康人群组30例来自医院体检中心和医院职工。治疗组和对照组组均给予控制血脂、血压、尿蛋白以及抗凝等常规治疗,治疗组加用益气活血中药(黄芪、丹参、山药、茯苓、桃仁、蜈蚣、白术、川牛膝);观察2组治疗前后的血、尿Ⅳ型胶原和层粘蛋白变化。结果:健康组与治疗组、对照组治疗前比较有着显著差异(P<0.05),治疗组与对照组治疗前比较无差别(P>0.05),治疗组治疗前后比较检测的4项指标均有统计学意义,其中血IV胶原(P<0.05)、血层粘连蛋白(P<0.01)、尿IV胶原(P<0.05)、尿层粘连蛋白(P<0.05);对照组治疗前后比较检测的4项指标均有统计学意义,其中IV胶原(P<0.05)、血层粘连蛋白(P<0.05)、尿IV胶原(P<0.05)、尿层粘连蛋白(P<0.05),治疗组与对照组治疗后比较仅有尿层粘连蛋白统计学意义(P<0.05)。结论:中药益气活血在治疗慢性肾炎过程中发挥重要作用,中西结合治疗有着明显的优势。

抗纤灵冲剂调控基因与蛋白表达干预肾间质纤维化的机制研究

目的从MMP-9调节COL4α3基因及Ⅳ型胶原蛋白表达的角度,研究抗纤灵冲剂干预肾间质纤维化的机制。方法72只SD大鼠,成功制备单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction,UUO)模型后,再随机分为模型组、抗纤灵组、氯沙坦组。另24只大鼠,制备假手术模型。药物干预后处死,留取左侧肾组织。应用免疫组化法测定MMP-9、Ⅳ型胶原(Col-Ⅳ)蛋白在肾间质的阳性表达;采用PCR Array法,检测肾组织COL4α3基因的表达。结果UUO假手术组大鼠MMP-9表达极微;在模型组大鼠其阳性表达显著增加;与模型组比较,抗纤灵组4个时间点MMP-9的阳性表达均明显增加;氯沙坦组各时间点MMP-9阳性表达均较模型组增加,但无统计学差异。14d、28d时MMP-9阳性表达抗纤灵组显著高于氯沙坦组。各时间点模型组COL4α3基因水平分别较假手术组上调10.37倍、10.27倍及14.34倍。各时间点抗纤灵组COL4α3的基因表达水平,分别较模型组下调1.5倍、1.52倍和1.48倍。假手术组大鼠Col-Ⅳ只有极少量表达;模型组大鼠肾小球基底膜及肾间质表达显著增加,与假手术组相比有统计学意义;与模型组相比较,抗纤灵组及氯沙坦组各时间点阳性表达均显著减少;与氯沙坦组比较,7 d,14 d,28 d时间点Col-Ⅳ蛋白阳性表达,抗纤灵组均显著减低;21d阳性表达也明显低于氯沙坦组。结论抗纤灵冲剂干预肾间质纤维化的可能机制是通过MMP-9下调COL4α3基因及Col-Ⅳ蛋白在肾间质的表达。

转移相关肺腺癌转录本1(MALAT1)促进缺氧诱导的肾小管间皮细胞转分化

目的研究长链非编码RNA转移相关肺腺癌转录本1(MALAT1)参与缺氧诱导的肾小管上皮细胞上皮间质转分化(EMT)调控的机制。方法 HK-2肾小管上皮细胞缺氧处理0、12、24、48、72 h,实时定量PCR检测MALAT1 mRNA和miR-100-3p水平。HK-2细胞分别感染特异性lncRNA慢病毒和miRNA慢病毒下调MALAT1和miR-100-3p,采用实时定量PCR检测MALAT1 mRNA和miR-100-3p水平,免疫荧光细胞化学染色检测上皮钙黏素(ECD)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅳ型胶原蛋白α1链(COL4A1)的表达。构建单侧输尿管梗阻(UUO)动物模型,设置单侧输尿管未结扎组(对照组)、结扎7 d组(UUO7 d组)、结扎3周组(UUO 3周组)、腺相关病毒(AAV)组。在UUO动物模型中,采用AAV感染下调MALAT1水平后,采用HE和Masson染色检测各组肾组织病变情况,采用免疫组织化学染色检测肾组织ECD和α-SMA的表达。结果在缺氧诱导的HK-2细胞中,随缺氧刺激时间延长,MALAT1表达逐渐升高,而miR-100-3p表达逐渐减低;缺氧诱导HK-2细胞72 h后,慢病毒感染下调MALAT1水平,miR-100-3p水平升高,同时ECD表达增加、COL4A1和α-SMA表达降低;缺氧诱导HK-2细胞72 h后,转染下调miR-100-3p水平,MALAT1水平无显著变化,miR-100-3p水平降低,ECD表达降低,COL4A1和α-SMA表达增加;体内实验:与对照组相比,UUO动物模型组MALAT1表达显著升高,而miR-100-3p表达明显降低; AAV组与3周组比较,ECD表达显著升高,而α-SMA表达显著降低。结论 MALAT1可通过负向调控miR-100-3p,进而促进COL4A1表达,促进缺氧诱导的HK-2细胞EMT,并且可以促进UUO肾病小鼠肾脏纤维化。

基于PI3K/Akt/NF-κB信号通路探讨加味三仁汤对脂多糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞增殖的影响

目的:观察加味三仁汤对脂多糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞增殖、细胞外基质及磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/核转录因子-κB(NF-κB)信号通路的干预作用,探讨其改善免疫球蛋白A肾病(IgAN)大鼠炎症病变的相关机制。方法:采用血清药理学方法,将18只大鼠分为3组,正常组,加味三仁汤高、低剂量(20.70,10.35 g·kg^(-1)·d^(-1))组,每组6只,加味三仁汤高、低剂量组给予加味三仁汤相应溶液灌胃,正常组灌胃等体积蒸馏水。分别灌胃5 d后,采血制取含药血清。采用大鼠肾小球系膜细胞(HBZY-1),分为正常组,模型组,贝那普利组(50μmol·L^(-1)),加味三仁汤高、低剂量组。采用噻唑蓝(MTT)比色法检测各组细胞增殖情况,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测各组细胞培养上清液中Ⅳ型胶原(ColⅣ)的含量,蛋白免疫印迹法(Western blot)和实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)分别检测PI3K/Akt/NF-κB通路相关蛋白表达量和mRNA表达水平。结果:与正常组比较,模型组大鼠肾小球系膜细胞增殖显著(P<0.01),ColⅣ分泌显著增多(P<0.01),磷酸化(p)-Akt,p-p65蛋白表达显著增加(P<0.01);与模型组比较,加味三仁汤高剂量组显著抑制细胞增殖(P<0.01)和ColⅣ分泌(P<0.01),降低Akt磷酸化水平(P<0.01),降低NF-κB p65阳性表达(P<0.01)。结论:加味三仁汤能够抑制脂多糖诱导的HBZY-1细胞增殖,降低ColⅣ蛋白含量,可能与其抑制PI3K/Akt/NF-κB信号通路激活密切相关。