vWF基因A1381T多态性和ABO血型对血浆vWF水平的影响

本研究旨在探讨vWF基因A1381T多态性和ABO血型对血浆vWF水平的影响。采用酶联免疫吸附法测定120名(男女各60例)19-33岁健康志愿者血浆vWF:Ag水平,采用PCR限制性酶切片段长度分析vWF基因A1381T单核苷酸多态性,测序验证。实验数据根据志愿者性别、血型或/和基因型进行分组,采用t检验、方差分析等统计学处理。结果表明:志愿者O血型与非O血型相比,血浆vWF水平明显降低(p<0.001);vWF基因A1381T多态性AA基因型与AG、GG型相比,血浆vWF水平明显降低(p=0.003和0.019);而在男性、女性之间血浆vWF水平没有统计学意义(t=1.039,p=0.301);在O血型中,A1381T的AG基因型血浆vWF水平与AA、GG基因型有显著性差异(t=2.321,p=0.028);而在非O血型中,A1381T的AG基因型血浆vWF水平与AA基因型有显著性差异(p=0.032)。结论:血浆vWF的表达水平随ABO血型和vWF基因多态性不同而有明显的不同。O血型和vWF基因A1381T多态性的AA型血浆vWF水平明显低于其他血型或基因型,这些结果对了解出血性及血栓性疾病易感性具有明确的参考意义。

中国汉族群体vWF基因40内含子VNTR

本文将Ａｍｐ－ＦＬＰ与ＲＦＬＰ结合起来，检测ｖＷＦ基因４０内含子ＶＮＴＲ（ｖａｒｉａｂｌｅｎｕｍｂｅｒｏｆｔａｎｄｅｍｒｅｐｅａｔｓ）。调查长沙地区１５６名无亲缘关系汉族人，发现ｖＷＦ基因４０内含子ＶＮＴＲ基因１３６个。基因型１５３个，全部为杂合子，分布符合Ｈａｒｄｙ－Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡定律。此ＶＮＴＲ的杂合率为０．９８８４，ＰＩＣ为０．９８８３，是现已检出Ａｍｐ－ＦＬＰ中多态性最高的遗传标记。家系分析显示ＶＮＴＲ无遗传重组，依照常染色体共显性遗传。用高分辨聚丙烯酰胺凝胶电解质梯度电泳，分离扩增的杂合子个体ｖＷＦ基因４０内含子ＶＮＴＲ两条ＤＮＡ，回收后再次扩增，ＡｌｕＩ消化，电泳直接检测了ＶＮＴＲ基因型，解决了Ａｍｐ－ＦＬＰ－ＲＦＬＰ分析中无法判定基因型的难题。首次将ＳＳＣＰ应用于微卫星ＤＮＡ亚型的检测，检出一个ＶＮＴＲ亚型。

中国汉族人vWF基因内可变数目串联重复序列的研究

用聚合酶链反应(PCR)和聚丙烯酰胶凝胶电泳(PAGE)的方法,研究了71名中国汉族人142条染色体的vWF基因40号内含子的可变数目串联重复序列(VNTR)。中国人群vWF基因内存在ATCT的串联重复序列,其VNTR存在14,13,12,11,10,9,8和7等八种等位基因,总的理论杂合率为79.4％。该VNTR携带遗传信息量大,作为血管性血友病的遗传指标之一对vWD的遗传咨询和产前诊断具有应用价值。

中国汉族人vWF基因HhaⅠ和SmaⅠ限制性片段长度多态性研究

为了解中国汉族人vWF基因HhaⅠ和SmaⅠ限制性片段长度多态性特点,应用PCR技术结合HhaⅠ和SmaⅠ酶切分析研究了48个汉族人96条染色体等位基因的杂合情况。结果发现,96条染色体中HhaⅠ^+:HhaⅠ^-和SmaⅠ^+:SmaⅠ^-染色体的频率均分别为0.38:0.62(36:60),理论杂合率为0.47,且发现HhaⅠ和SmaⅠ呈完全连锁,未发现HhaⅠ^+/SmaⅠ^-或HhaⅠ^-/SmaⅠ^+染色体。提示在我国汉族人群中,在vWF基因的5’端均存在HhaⅠ和SmaⅠ的多态性位点。新的vWF基因分子遗传标记的建立和应用,对vWD的遗传咨询和产前诊断具有较高的实用价值。

vWF基因A1381T和-1793G/C多态性对中国裕固、藏及汉族人血浆vWF水平的影响

本研究旨在探讨vWF基因A1381T(rs216311)和-1793G/C(rs7966230)单核苷酸多态性(SNP)在中国裕固族、藏族、汉族之间的异同及其对血浆vWF浓度的影响,了解3个民族对vWF相关疾病的易感性。抽取322位裕固族、399位藏族及120位汉族正常人的外周静脉血,提取DNA,采用PCR-限制性酶切片段长度分析vWF基因A1381T、-1793G/C SNP,测序验证。用ELISA试剂盒测定血浆vWF水平。结果表明,vWF基因A1381T位点和-1793G/C位点的基因型分布在裕固族、藏族和汉族中均有差异(P<0.05),其中A1381T位点中的G G基因型在裕固族中占69.9%,远高于藏族和汉族中的56.6%及53.3%(P<0.01),A1381T AA型表达vWF水平较低。-1793G/C中CG型在裕固族中所占的比例远高于汉族,CC型基因型表达较高vWF水平。血浆vWF水平随民族和vWF基因多态性的不同而明显不同。结论:vWF基因A1381T和-1793G/C位点基因多态性分布在中国裕固族、藏族和汉族中有明显差异;基因多态性影响血浆vWF表达水平;裕固族和藏族血浆vWF水平比汉族高,这与环境和生活习惯因素也有关系。

儿童遗传性出凝血紊乱VWF FV GP1Bα基因研究

目的:了解广西地区不明原因出血及ITP疗效不好的患儿血管性血友病因子(von Will-ebrang factor,VWF)28外显子、五因子(Factor V,FV)10外显子、血小板膜糖蛋白Ⅰba(platelet glyco-protein Ib alpha,GPⅠba)基因变异情况。方法:对所收集的31例病人进行VWF基因第28外显子(VWF28)、FV基因第10外显子(FV10)、GPⅠba基因全长DNA进行聚合酶链式反应(PCR)、DNA测序等技术查找基因变异。结果:31例病人VWF28、FV10、GPⅠba基因外显子全部扩增成功,未发现异常突变;检出VWF28多态性位点V1229I1例、T1381A10例(32.25%)、D1472H8例(25.81%)、V1565L21例(67.74%);检出FV10多态性位点R513K22例(70.97%);检出GP1bα基因多态性位点T119S1例、A332D10例(32.26%)、L561I17例(54.84%)。结论:VWF28、FV10、GP1bα基因突变有可能不是广西地区不明原因出血及ITP疗效不好病人常见的发病因素。

广东人vWF基因40内含子VNTR检测及其在亲缘鉴定中的应用

用PCR直接扩增vWF基因40内含子串联重复片段VNTR区域,高分辨丙烯酰胺凝胶电泳,分离个体杂合子的两条DNA片段,从凝胶中回收DNA,第二次扩增,经A luⅠ消化,电泳直接检测VNTR基因型。54个无关个体等位基因全部为杂合子,共检出等位基因79个。频率为1/108的等位基因达36个;5个二代家系盲法检测得到确认;用于7个家系的亲缘鉴定排除了其中4个子女与其父母之间亲生关系。本实验结果证明,vWF基因40内含子NVTR基因在广东的汉族人群中仍然有高度的多态性。因此,我们认为该位点在广东人群中依然具有高遗传性多态标记,可应用于广东人群的亲缘关系的鉴定。

血管性血友病因子基因敲除可抑制高脂喂养小鼠附睾脂肪的含量和炎症反应

目的探讨血管性血友病因子(von Willebrand Factor,vWF)对高脂饮食诱导的肥胖及内脏脂肪含量、组织炎症的影响。方法 16只8周大雄性WT小鼠随机分为普通饮食组(WTNC)、高脂饮食组(WT HFD),16只8周大vWF基因敲除小鼠随机分为普通饮食组(vWFKONC)、高脂饮食组(vWFKOHFD),一共四组,每组8只,普通饮食组给予普通饲料喂养,高脂饮食组给予60%高脂饲料喂养。12周后对比各组小鼠体重、附睾脂肪含量及附睾脂肪的病理形态和炎症表达水平。结果相较于普通饮食,高脂饮食可显著增加WT、vWF基因敲除小鼠的体重及附睾脂肪含量;而对比高脂饮食vWF基因敲除和高脂饮食WT小鼠,发现前者的体重、附睾脂肪含量均明显小于后者[体重:(30.44±0.60) g vs (43.74±0.78) g,附睾脂肪含量:(1.14±0.11) g vs (3.01±0.04) g,P值均<0.05],进一步对上述2组附睾脂肪组织进行HE病理分析,发现前者附睾脂肪中"王冠样结构"[1]的数量少于后者,且附睾脂肪RT-PCR分析显示前者MCP-1、TNF-α、IL-β和IL-6的表达均低于后者(P值均<0.05)。结论 vWF基因敲除可抑制高脂饮食小鼠的体重增长和附睾脂肪含量,同时可降低脂肪组织炎症水平。

中国汉族人群vWF基因Msp Ⅰ和Rsa Ⅰ限制性片段长度多态性研究

目的：研究我国汉族人群ｖＷＦ基因的多态性特点。方法：应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术结合ＭｓｐⅠ和ＲｓａⅠ酶切分析研究了５２名汉族人１０４条染色体ｖＷＦ基因ＭｓｐⅠ限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ）和４８名汉族人９６条染色体的ＲｓａⅠＲＦＬＰ。结果：在我国汉族人中，等位基因ＭｓｐⅠ＋／ＭｓｐⅠ－的频率为０．２０∶０．８０，理论杂合频率为３６％；ＲｓａⅠ＋／ＲｓａⅠ－的频率为０．９３∶０．０７，理论杂合频率为１３％。结论：在我国汉族人中，在ｖＷＦ基因的５′端存在ＭｓｐⅠ和ＲｓａⅠ的多态性位点，可用于血管性血友病的遗传咨询和产前诊断。

2A型血管性血友病vWF基因Ala737→Glu的突变

目的阐明２Ａ型血管性血友病（ｖＷＤ）临床表现型与基因型的相关性。方法研究来自同一家系的２例患者，他们具有初期止血障碍的出血特点，ｖＷＦ∶Ａｇ和ＦⅧ∶ＣＡｇ减少，瑞斯托霉素诱导的血小板聚集明显降低，大、中多聚物分子消失，临床表型符合２Ａ型血管性血友病。用聚合酶链反应方法扩增患者的ｖＷＦ基因的２８号外显子，并用特异性内切酶的方法获得真基因，变性梯度凝胶电泳（ＤＧＧＥ）筛选突变基因，对电泳行为异常的片段进行测序。结果该２Ａ型ｖＷＤ家系ｖＷＦ基因的４３７０～４５９０区域ＤＧＧＥ有明显减慢的条带。ＤＮＡ序列测定，表明在ｖＷＦ基因４４９９位Ｃ→Ａ致ｖＷＦ蛋白Ａ２区域Ａｌａ７３７→Ｇｌｕ。结论该突变有助于研究ｖＷＦ蛋白功能域的精细功能及ｖＷＤ表型与基因型的相关性。

血小板糖蛋白GPⅠbα vWF结合域在酵母中的表达鉴定

目的 :实现重组糖蛋白GPⅠbαvWF结合域在巴氏毕赤酵母中的表达。方法 :PCR从重组质粒pcDNA3.1 GPⅠbα中扩增GPⅠbαvWF结合域基因 ,以pPIC9k为表达载体 ,构建包含该目的基因的酵母重组质粒 ,转染毕赤酵母GS115 ,以G4 18筛选抗性克隆 ,甲醇诱导表达 ,SDS PAGE与点印迹鉴定表达产物。结果 :获得编码正确的重组质粒pPIC9k GP30 2 ,电转化GS115 ,以G4 18筛选到阳性克隆 ,诱导表达培养上清进行点印迹 ,结果表明表达蛋白能够与抗GPⅠbα单克隆抗体结合。结论 :获得了表达重组蛋白质GPⅠbαvWF结合域的巴氏毕赤酵母菌株以及重组蛋白质GP30

vWF、Fg基因多态性与冠心病血瘀证的相关性研究

目的：探讨vWF19内含子MspI、FgBβ因启动区-148C/T多态性与冠心病血瘀证的关系。方法：将150例确诊为冠心病的患者分为血瘀证组100例、非血瘀证组50例,另抽取体检健康者50例作为健康对照组。采用聚合酶链-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）方法对vWFMspI、FgBβ因启动区-148C/T进行基因多态性分析。结果：与健康对照组相比,vWF内含子MspI基因型与等位基因分布频率在冠心病血瘀证组差异有统计学意义（P〈0.01）,而在非血瘀证组的分布差异则无统计学意义（P〉0.05）;在冠心病血瘀证与非血瘀证组间的分布差异亦无统计学意义（P〉0.05）。M-M-基因型患冠心病血瘀证的OR值为2.970（1.470-6.000,P〈0.01）,而患冠心病非血瘀证的OR值为2.077（0.934-4.615,P〉0.05）;M-等位基因患冠心病血瘀证的相对危险度为1.888（1.082-3.296,P〈0.05）。与健康对照组相比,FgBβ148C/TT基因型与等位基因分布频率在冠心病血瘀证组差异有统计学意义（P〈0.05）,而在非血瘀证组的分布差异则无统计学意义（P〉0.05）;在冠心病血瘀证组与非血瘀证组间的分布差异亦无统计学意义（P〉0.05）。TT基因型罹患冠心病血瘀证与冠心病非血瘀证的相对危险度分别为3.244、2.524,p值分别为0.033、0.137;而T等位基因罹患冠心病血瘀证组与非血瘀证的相对危险度分别为12.317、2.244,p值分别为0.000、0.015。结论：vWF基因MspI多态性中,M-M-基因型与M-等位基因与冠心病血瘀证发生相关,且可能为其独立危险因素;Fg基因-148多态性中,TT基因型与冠心病血瘀证发生相关,T等位基因可能与冠心病发生相关。

内皮细胞特异性启动子pvWF和pVE的克隆及表达

目的:克隆并验证内皮细胞(Endothelial Cells,ECs)特异性启动子,为转染人胚胎干细胞(h ESC)后实时监测ECs的定向分化情况以及利用干细胞实施血友病A的基因治疗研究提供基础。方法:通过酶消化法原代分离人脐静脉内皮细胞(HUVECs),结合RT-PCR和免疫荧光验证分离后的HUVECs表达内皮细胞特异性标志基因血管性血友病因子(v WF)和血管内皮钙粘素(VE-cadherin/CDH5)。抽提HUVECs的g DNA,通过PCR扩增内皮细胞特异性表达基因v WF和VE-cadherin转录起始位点上游不同大小的启动子片段,将其取代报告基因载体p EGFP-N1中的广谱启动子CMV,构建4个质粒,即pv WF-1、pv WF-2、p VE-1、p VE-2,分别转染HUVECs和h ESCs,48 h后观察并比较各启动子片段启动绿色荧光蛋白GFP表达情况,筛选最具特异性及转录活性的启动子片段。结果:通过酶消化法,本研究成功分离出具有典型上皮样细胞的HUVECs。RT-PCR和免疫荧光结果表明HUVECs特异性表达v WF和VE-cadherin。酶切及测序证实所构建的4个含ECs特异性启动子片段的质粒与理论序列相符,通过核转染至HUVECs及h ESCs后,48 h后观察到所克隆的VE-cadherin 2105bp启动子片段具有内皮细胞表达的特异性和较强的转录活性。结论:本研究成功筛选出具有内皮细胞表达特异性及较强转录活性的启动子片段。

云南省彝族、傣族人群vWF基因Hha Ⅰ和Sma Ⅰ限制性片段长度多态性研究

为研究我国云南省彝族、傣族人群ｖＷＦ基因ＨｈａⅠ和ＳｍａⅠ限制性片段长度多态性特点，应用多聚酶链式反应技术结合ＨｈａⅠ和ＳｍａⅠ酶切分析研究了４４个彝族人７８条染色体、３９个傣族人８８条染色体等位基因的杂合情况。结果在彝族人ＨｈａⅠ＋ＨｈａⅠ－和ＳｍａⅠ＋ＳｍａⅠ－为０．３６０．６４；在傣族人中ＨｈａⅠ＋ＨｈａⅠ－和ＳｍａⅠ＋ＳｍａⅠ－为０．４３０．５７，且发现ＨｈａⅠ和ＳｍａⅠ在两民族中呈完全连锁，未发现ＨｈａⅠ＋／ＳｍａⅠ－或ＨｈａⅠ＋／ＳｍａⅠ－染色体。提示在我国彝、傣两少数民族中，在ｖＷＦ基因的５端均存在ＨｈａⅠ和ＳｍａⅠ的多态性位点，且具有较高的理论杂合率，可用于ｖＷＤ的遗传咨询和产前诊断。

一例两种新的ADAMTS13基因突变导致的遗传性血栓性血小板减少性紫癜

目的对1例高度可疑的遗传性血栓性血小板减少性紫癜(TTP)患者的vWF裂解蛋白酶(ADAMTS13,vWF-cp)基因突变进行检测,以明确诊断并制定相应的治疗方案。方法用残余胶原结合实验(residual-collagen binding assay)动态检测1例TTP患者ADAMTS13的活性和抑制物水平。用PCR方法扩增ADAMTS13的29个外显子及外显子邻近处的内含子,并直接测序检测突变。对其亲属的基因组DNA在患者突变区域扩增并测序。结果患者ADAMTS13活性降低,未发现抑制物存在。测序显示患者的ADAMTS13的凝血酶敏感蛋白1(TSP1)基序重复区第21外显子碱基2708处和25号外显子碱基3283处出现C→T的错义突变(均为纯合子),分别导致该碱基参与编码的丝氨酸密码子(TCG)变为亮氨酸密码子(TTG)(S903L),精氨酸密码子(CGG)变为色氨酸密码子(TGG)(R1095W)。患者父母上述突变位置处的基因均呈杂合状态,其兄的该段碱基序列正常,并且在采集的25位家族成员中共发现11名上述突变位点的正常携带者。结论该患者是由于ADAMTS13基因纯合子错义突变导致翻译发生错误所致的遗传性TTP。

重度血瘀证与血浆遗传性假血友病因子水平及CYP2C19*2基因多态性的关系

目的探讨经皮冠状动脉介入术（PCI）后重度血瘀证与血浆遗传性假血友病因子（vWF）水平及CYP2C19＊2基因多态性的相关性。方法将371例PCI成功的冠心病患者根据术后1周血瘀证评分标准分为非血瘀组（77例）、轻度血瘀组（193例）和重度血瘀组（101例）3组,采用PCR-RFLP基因分析方法检测CYP2C19＊2基因多态性,同时采血检测血小板计数（PLT）、最大血小板聚集率（MPA）、vWF和纤维蛋白原（Fg）。结果重度血瘀组CYP2C19＊2基因突变型（GA＋AA）明显高于轻度血瘀组和非血瘀组（χ2=27.093,P〈0.001）。多因素Logistic回归分析显示,以非血瘀组为参照系,CYP2C19＊2基因突变型（GA＋AA）患重度血瘀证的相对危险度（OR）为3.371（95%CI：1.557~7.295,P=0.002）。重度血瘀组MPA及vWF高于轻度血瘀组,差异有统计学意义（P〈0.05）。血浆vWF的ROC曲线分析指出,vWF≥118.10%（敏感性为0.842,特异性为0.767,辨证准确率为78.6%,Youden指数0.609）,中医辨证为重度血瘀证的可能性较大。结论 PCI术后CYP2C19＊2基因突变患者可能易患重度血瘀证,血浆vWF测定可作为其重要的微观辨证指标。

一个3型血管性血友病家系的基因及产前诊断

目的对1例临床诊断为3型血管性血友病的患儿进行分子遗传学研究，明确致病突变，为再次妊娠的母亲进行产前诊断。方法提取基因组DNA，应用二代测序、Sanger测序对患儿VWF基因进行序列分析，对可疑致病突变位点，进行了家系成员及100份正常对照标本的验证。针对致病突变，羊膜腔穿刺采集羊水细胞，对胎儿进行产前基因诊断。结果序列分析检测到患儿VWF基因C．72874-1G〉A纯合突变，未见报道，经剪接位点预测软件分析，提示该剪接位点突变为致病突变，100份正常对照标本未见该突变；患儿父母及姐姐均为该突变携带者；产前诊断检测胎儿未遗传该突变，且VWF基因单体型与先证者不同。结论经过基因突变分析，发现了Ⅵ矿F基因的新突变，明确了患儿的致病突变及表型一基因型关系，确定了患儿及家系成员的基因型，成功为胎儿进行了产前诊断，积累了该类疾病的诊断经验。