幽门螺杆菌vacA基因重组表达的包涵体复性及ELISA方法的建立

目的:通过对vacA重组工程菌表达产物包涵体的变性、复性,提高表达产物的生物学活性,建立ELISA方法,讨论VacA抗原规模生产的可行性.方法:利用已经构建的表达VacA抗原的工程菌,用IPTG诱导,表达的包涵体通过系列条件的变性、复性、透析,并经活性鉴定.所制抗原用以包被ELISA板,建立ELISA方法并确定抗原的生物学活性.结果:重组工程菌可表达Mr3300的目的蛋白,表达形式为包涵体,条件优化后的包涵体经SDS-PAGE显示纯度达95%以上,活性经ELISA法测定正常人126例和blot电泳测定结果符合率为97.1%.结论:包涵体变性复性后生物活性大幅度提高,并且具有良好的重复性和稳定性,可作为幽门螺杆菌疫苗制备的候选抗原及临床检测的诸多方法的抗原原料.

内蒙古包头地区幽门螺旋杆菌VacA基因分型相关研究

目的:通过分析研究内蒙古包头地区感染幽门螺旋杆菌(H.pylori)菌株的空泡毒素基因(vacuolating cytotoxin gene,VacA)亚型,探讨H.pylori在内蒙古地区的流行病学特点。方法:收集2018年6月至2019年6月在包头医学院第二附属医院就诊的308例不同胃、十二指肠相关疾病患者的H.pylori感染阳性患者活检标本,通过DNA分析,利用聚合酶链式反应技术扩增VacA基因亚型,从而对VacA基因型进行研究。结果:通过对308例H.pylori感染患者分析发现,VacA的总阳性率为57.14%,包头市区内VacA(+)52.31%,旗县区VacA(+)55.75%,市区与旗县区之间无统计学意义。VacA亚型阳性率sla为91.32%、slb为8.65%、s2为0.56%、ml为32.67%、m2a为89.54%、m2b为28.32%。vacA组合基因型(亚型嵌合体)以sla/m2a为主,占67.05%。sla、mlb型与相关疾病分布差异无统计学意义,而vacA的m2a型与疾病分布差异有统计学意义。结论:内蒙古包头地区幽门螺旋杆菌VacA基因分型以sla及m2a为主,其中m2a与疾病来源有关,这为内蒙古地区H.pylori感染的防控提供新的理论依据。

中国幽门螺杆菌vacA基因型标签序列与VacA活性关系的分子系统发育分析

目的探讨中国幽门螺杆菌vacA基因s、m和i区氨基酸序列分子系统发育关系及其对VacA活性的影响。方法从GenBank数据库中下载所有中国幽门螺杆菌VacA全长氨基酸序列,利用ClustalX 2.0和MEGA 5.05软件对vacA基因s、m和i区氨基酸序列及VacA全长氨基酸序列进行生物信息学分析,构建分子系统发育树。结果中国幽门螺杆菌无毒弱毒株vacA基因型全为s1/m2/i1型,而强毒株除Ch2菌株为m1-m2杂合型之外,全为s1/m1/i1型,s1型和i1型强相关。分子系统发育分析显示,中国幽门螺杆菌vacA基因s、m和i区氨基酸序列都呈现明显的地理特异性,其中m区分子系统发育树能够将VacA强毒株和无毒弱毒株分开,而s和i区分子系统发育树则不能将两者完全分开。结论 vacA基因m区氨基酸序列更适合作为中国幽门螺杆菌VacA的毒力标志。

幽门螺杆菌cagA、vacA抗体与胃十二指肠疾病的相关性研究

目的 :探讨幽门螺杆菌 (Hp)毒力基因cagA、vacA抗体与胃十二指肠疾病之间的关系。方法 :采用免疫印迹法检测 440例胃十二指肠疾病患者血清中的cagA、vacA抗体。结果 :cagA、vacA抗体在 440例患者中的检出率分别为 73 %、37.0 %。在慢性胃炎 (CG)、十二指肠球部溃疡 (DU)、胃癌 (GC)患者中 ,cagA、vacA抗体的阳性率分别为 62 .9% ,76 .1 %、96 .9%与 33 .0 %、31 .0 %、62 .5 % ;经u检验显示 :慢性胃炎组与十二指肠球部溃疡组比较 ,无明显差异。胃癌组与慢性胃炎组、十二指肠球部溃疡组比较 ,有显著性差异。结论 :本文通过患者血清中Hp抗体 (cagA和vacA)的检测 ,推知其cagA和vacA抗体的表达状况 ,可为胃十二指肠疾病的诊断提供依据 。

幽门螺杆菌VacA N端片段通过线粒体途径诱导GES-1细胞凋亡

目的:本研究初步探讨幽门螺杆菌(H.pylori)空泡毒素单一毒力决定簇对GES-1胃黏膜上皮细胞凋亡的影响,为进一步研究H.pylori的致病机制奠定基础。方法:将本课题组已构建的pDsRed-Monomer-C1/VacA N端真核表达载体转染至GES-1细胞中,Western blot鉴定VacA蛋白在细胞中的表达;电子显微镜和中性红摄取试验检测GES-1细胞的空泡样变;Hoechst33342染色、Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒以及电镜观察细胞凋亡情况,同时采用分光光度法检测细胞Caspase-9、Caspase-3的活化程度,Rho123检测细胞跨膜电位的变化,ELISA法检测细胞色素C的释放。结果:重组质粒pDsRed-Monomer-C1/VacA转染GES-1细胞24小时后,电镜下可明显观察到空泡样变及核固缩、染色质边聚等凋亡特征,重组质粒组部分细胞发生空泡样变;Hoechst 33342染色后镜下可见明显的核染色质浓缩,Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒检测发现重组质粒组细胞凋亡率明显高于对照组(P<0.05);Caspase-9和Caspase-3活化程度呈时间依赖性增加,分别在12小时和24小时达到峰值;Rho123染色发现线粒体跨膜电位明显降低;重组质粒转染组释放细胞色素C的浓度呈时间依赖性正相关,与空质粒组及对照组相比差异显著(P<0.05)。结论:VacA N端片段可诱导GES-1细胞凋亡及空泡样变,VacA蛋白可激活Caspase-9和Caspase-3,且可能主要通过线粒体途径诱导GES-1细胞凋亡。

幽门螺杆菌及其vacA基因亚型和cagA基因与胃上皮HLA-DR抗原表达的关系

【目的】探讨幽门螺杆菌及其空泡毒素基因 (vacA)亚型、细胞毒素相关基因 (cagA)与胃上皮HLA DR抗原表达间的关系。【方法】①自 39例幽门螺杆菌阳性患者中分离培养出 39株幽门螺杆菌菌株 ,采用PCR方法鉴定 39株菌株的ca gA及vacA亚型 ;②采用HLA DR小鼠抗人单克隆抗体 ,对上述已行cagA及vacA亚型鉴定的幽门螺杆菌阳性患者及 2 2例阴性患者的胃窦活检标本行免疫组化染色。【结果】①幽门螺杆菌阳性患者胃上皮HLA DR表达较阴性患者更显著 ;②幽门螺杆菌定植密度与胃上皮HLA DR抗原表达程度间存在正相关 ;③感染cagA+ 菌株患者较感染cagA-株者胃上皮HLA DR抗原表达更明显 ;④本研究中vacAs1a/m2亚型占 90 % ,故未对不同vacA亚型与胃上皮HLA DR表达间的关系进行统计分析。【结论】①幽门螺杆菌感染可诱导胃上皮HLA DR抗原异常表达 ;②cagA+ 菌株可能通过胃上皮HLA Ⅱ类分子介导而与宿主发生更为密切的相互作用 ,从而较cagA-菌株引起更为显著的胃上皮损伤。

浙江地区幽门螺杆菌临床菌株vacA优势基因型及其核苷酸序列分析

目的 :了解浙江地区消化性溃疡和慢性胃炎患者感染的幽门螺杆菌 (Hp) vac A优势基因型及其序列特点。方法 :分别从 2 9例消化性溃疡和 34例慢性胃炎患者的胃窦、胃体粘膜组织中分离出 12 6株 Hp。采用聚合酶链反应检测 vac A基因的信号区 (s)和中间区 (m)亚型 ,部分优势基因型的扩增产物 T- A克隆后进行核苷酸序列测定。结果 :所有菌株均扩增出 vac A s区和 m区基因片段 ,发现 s1a/ m1、s1a/ m2、s1a/ m1b、s1a/ m1b- m2 4种基因型 ,其比例分别为 7.1% (9/ 12 6)、61.9% (78/ 12 6)、2 9.4 % (37/ 12 6)、1.6% (2 / 12 6)。 17.5 %患者 (11/ 63)存在不同 vac A基因型Hp菌株混合感染 ,但在胃炎组和溃疡组中的分布差异无显著性 (P>0 .0 5 )。 6株 s1a型 Hp菌株的 s区扩增产物与报道的 s1a型 60 190株核苷酸序列同源性为 93.15～ 94 .86% ,4株 m2型 Hp菌株的 m区扩增产物与报道的 m2型 87-2 0 3株核苷酸序列之间同源性为 93.63～ 97.61%。结论 :s1a/ m2和 s1a/ m1b均是浙江地区消化性溃疡或慢性胃炎患者感染的 Hp菌株的 vac A优势基因型 ,部分优势 vac A基因型菌株的核苷酸序列与国外报道的参考菌株有较高的同源性 ;部分患者同时感染多株不同 vac A基因型 Hp。

幽门螺杆菌vacA基因多态性与慢性胃病

目前研究表明,幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)与慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌以及胃粘膜相关性淋巴样组织(MALT)淋巴瘤等疾病密切相关[1-4].尽管Hp是世界上流行较为广泛的慢性感染病原菌之一,但大多数Hp感染者无明显临床症状,只有少数出现慢性胃炎、消化性溃疡等临床表现,甚至发展为胃癌或胃MALT淋巴瘤,这可能与Hp的致病力有关[5-8].空泡毒素(VacA)是Hp产生的一种重要致病因子,能介导真核细胞空泡样变性[9-13].近年研究表明[3,14-20],Hp的vacA基因内存在不同的信号区(sh,s1b,s2)和中间区(m1,mla,m2),其多态性可能与致病力有关.我们采用PCR检测Hp的vacA基因多态性,分析vacA基因多态性特点及其与Hp相关性胃病的关系.

CagA^+及VacA^+幽门螺杆菌对克拉霉素的耐药性突变分析

目的分析CagA+及VacA+的幽门螺杆菌(Hp)对克拉霉素耐药与23S rRNA基因点突变的关系。方法采集右江民族医学院附属医院2006~2008年确诊为Hp感染患者的胃窦部黏膜样本进行Hp分离培养和鉴定,PCR扩增CagA+及VacA+基因,E-test进行药敏实验,PCR方法扩增23S rRNA基因,基因测序检测克拉霉素耐药菌株的点突变。结果对克拉霉素耐药的CagA+及VacA+Hp菌株均存在23S rRNA基因v功能区第2144位和第2143位A-G突变,而敏感菌株没有发现该位点突变。结论Hp对克拉霉素耐药的23S rRNA基因A2143G、A2144G点发生突变,与基因分型无关。

洛阳地区幽门螺杆菌VacA基因及亚型临床分布特征及其与胃肠疾病关系

目的探讨洛阳地区感染的幽门螺杆菌（H．pylori）菌株的空泡毒素基因（vacuolatingcytotoxingene，VacA）及其亚型的临床分布特征，找出该地区VacA优势基因型并探讨其与胃肠疾病的关系。方法收集“c尿素呼气试验检测阳性，胃镜及病理诊断为慢性胃炎、消化性溃疡、十二指肠球炎、胃癌、胃息肉、反流性食管炎、其他等546例患者（男294例，女252例，年龄10-79岁），采用酶联免疫吸附试验（ELISA法）检测VacA。再将VacA检测阳性者进一步检测VacA亚型：VacA—S1a、VacA—slb、VacA—s2、VacA—M1、VacA—M2，并进行统计学处理。结果洛阳地区546例H．pylori感染患者中，VacA的总阳性率为48．35％，市区内VacA的阳性率为40．00％，市区外县VacA的阳性率为50．70％，三者相比差异无统计学意义（P〉0．05）。VacA亚型S1a、S1b、S2、M1、M2的阳性率分别为76．52％、20．45％、0．76％、21．97％、72．24％，s2很少见。VacA基因亚型嵌合体S1a／M1、S1a／M2、S1b／M1、S1b／M2的阳性率分别为12．88％、47．73％、3．79％、12．88％，未发现s2嵌合体。s区未分型6例，M区未分型10例。VacA亚型及亚型嵌合体在不同胃肠疾病之间分布差异无统计学意义（P〉0．05）。结论洛阳地区感染npylori菌株的VacA的阳性率为48．35％；优势基因亚型为S1a／M2；VacA亚型及亚型嵌合体在不同胃肠疾病之间分布差异无统计学意义。

幽门螺杆菌vacA基因毒性相关片段的克隆及序列分析

目的 vac A 基因编码的蛋白是幽门螺杆菌的一个重要毒力因子,通过空泡化作用损伤上皮细胞.vacA 基因与 Hp 感染者的临床发病有着密切的关系,vacA 的基因型决定毒素蛋白体外表达水平的高低.我们从幽门螺杆菌88022菌株中扩增出vacA 基因毒性相关片段,进行序列测定和序列比较分析,为Hp 的临床检测奠定基础.方法以该菌株总 DNA 为模板,紧随 vacA 基因序列 s 区保守区域的引物(位于316bp～335bp 和1198bp～1218bp)扩增vacA 基因的一个903bp 片段,编码的氨基酸为34～334位,用13amHI 和 Pst Ⅰ双酶切后克隆入 pGEM-3Zf(-)质粒载体,以双脱氧法双向测定目的片段的序列,拼接出该片段的全序列,并与已知的 Hp vacA 基因序列作比较.结果所得序列与 Hp 国际标准株 CCUG17874(GeneBank gi619248)和 NCTCll638(GeneBank gi 495469)的 vacA 基因序列完全一致,氨基酸序列分析和所报道的结果一致.结论构建了 Hp vacA 基因毒性相关片段的重组克隆,为以后的进一步研究奠定了基础.

幽门螺杆菌vacA和cagA基因全长分子系统发育分析

文章从GenBank中下载所有含有vacA和cagA基因的H.pylori菌株的VacA和CagA全长氨基酸序列,利用ClastalX 2.0和MEGA 5.05软件构建VacA和CagA分子系统发育树,探讨两基因之间的分子系统发育关系和不同聚类群的临床感染结果与基因型特征。结果显示,VacA和CagA具有高度相似的分子系统发育树,并且所有H.pylori菌株在系统发育树中具有相同的分布特点,分别聚类为东亚株群1、2和西方株群3个聚类群。其中东亚株群1患萎缩性胃炎比例较高,vacA基因型以s1c/m1b和s1a/m1b为主,cagA基因型以EPIYA-ABD为主;东亚株群2患十二指肠溃疡的比例较高,vacA基因型以s1c/m2和s1a/m2为主,cagA基因型以EPIYA-AB'C为主;西方株群患十二指肠溃疡和胃炎的比例相当,萎缩性胃炎比例较低,vacA基因型以s1a/m1a和s1b/m1a为主,cagA基因型以EPIYA-AB/B'CC为主。这些结果说明,vacA和cagA基因可能具有共进化的遗传关系;东亚株群1、2和西方株群分别具有不同的vacA和cagA基因亚型,这可能与其临床感染结果密切相关,因此,在进行H.pylori相关性疾病分析时,有必要结合vacA和cagA基因型的亚型做深入分析。

球形幽门螺杆菌vacA基因表达质粒构建及表达

目的构建球形幽门螺杆菌vacA基因的重组表达质粒,初步观察其在E.coli中的表达。方法采用亚克隆技术,用BamHⅠ和SacⅠ从重组质粒pMD-18T-vacA上切下vacA基因,插入表达载体pET32a(+)质粒,转化大肠埃希菌BL21,在氨苄青霉素阳性的LB平板上筛选阳性重组子,并经双酶切及PCR扩增鉴定。重组质粒pET32a(+)-vacA转化大肠埃希菌,(IPTG)诱导表达后进行(SDS-PAGE)电泳和凝胶扫描定量分析。结果重组质粒酶切和PCR鉴定与预期结果相符,成功构建携带vacA基因的重组原核表达质粒pET32a(+)-vacA。核酸序列测定及同源性分析证实,表达质粒pET32a(+)-cagA中所含vacA基因与GenBank中的vacA序列同源性达到99.2%。vacA基因在大肠埃希菌中诱导表达后获得约156 kD蛋白,蛋白含量占全菌体蛋白含量15.5%。结论成功构建球形H.pylori vacA基因重组表达质粒,并获得高效表达,为研究该基因蛋白的生物学特性及DNA疫苗研制奠定了基础。

幽门螺杆菌毒力基因vacA多态性与胃肠道疾病的关系

目的研究幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)毒力基因vac A的分布,分析H.pylori主要毒力基因vac A的多态性与胃十二指肠疾病关系。方法将胃黏膜标本培养分离H.pylori菌株提取DNA,并运用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)对毒力基因vac A及其亚型进行检测分析,并对实验数据进行统计学处理,分析H.pylori的毒力基因型vac A与胃肠疾病之间是否存在相关性。结果分离H.pylori 69株,标本依据病理诊断结果分为3组:消化性溃疡组(peptic ulcer disease,PUD)29株、非溃疡性消化不良组(non-ulcer dyspepsia,NUD)29株和胃癌组(gastric cancer,GC)11株。vac A基因s1的检出率为78.3%,s2为21.7%,mixs1为14.5%。m区m1和m2检出率分别为46.4%和53.6%。i区i1和i2的检出率分别为71.0%和29.0%。vac A基因亚型组合以s1m1i1(40.6%)和s1m2i1(34.8%)为主。结论本地区分离的H.pylori vac A s1m1i1基因型引起的疾病比例较高,是胃肠疾病的优势基因型,且vac A基因亚型组合s1cm2i2在各组疾病中的差异有统计学意义。而未发现其他基因型或基因组合与胃肠道疾病的关系。

幽门螺杆菌vacA及cagA基因型与胃疾病的关系

目的探讨幽门螺杆菌(Hp)vacA、cagA基因型与胃疾病的关系。方法选取105例胃疾病病人,包括慢性浅表性胃炎(CSG)45例,慢性萎缩性胃炎(CAG)48例,胃癌(GC)12例。于胃窦处取3块胃黏膜,分别进行快速尿素酶反应、病理检查和聚合酶链反应(PCR)。提取胃黏膜基因组DNA,用6对引物检测Hp vacA、cagA基因的表达。结果快速尿素酶反应、病理检查均阳性的标本57例,Hp的阳性率为54.2%(57/105)。Hp vacA s1/m2、s1/m1、s2/m1、s2/m2的阳性率分别为53%(30/57)、18%(10/57)、8%(5/57)、21%(12/57);Hp cagA的阳性率为89%(51/57)。vacA、cagA基因型在CSG、CAG和GC之间差异无显著性(P>0.05)。结论Hp菌株的优势基因亚型为Hp cagA、vacA s1/m2;Hp vacA、cagA基因与特定胃疾病间无显著相关性,不能预示Hp感染的临床结果。

浙江省幽门螺杆菌cagA、vacA基因型的流行病学研究

目的调查浙江地区幽门螺杆菌(helicobacter pylori,Hp)基因型的分布及其与临床疾病的关系。方法采用特异引物聚合酶链反应(PCR)分析262株幽门螺杆菌的vacA基因多态性分布特点,并对其进行初步统计分析。结果浙江8个地区分离培养的Hp菌株262株,VacA m1b基因型占27.10%(71/262);VacA m2基因型占64.89%(170/262);VacA m1b-m2基因型占4.20%(11/262);不同地区间VacA s区基因型和VacA m区基因型分布差异无统计学意义(P>0.05)。慢性胃炎分离株中VacA m1b基因型占26.47%(27/102);VacA m2基因型占66.67%(68/102);VacA m1bm2基因型占2.94%(3/102)。消化性溃疡分离株中VacA m1b基因型占29.41%(40/136);VacA m2基因型占61.76%(84/136);VacA m1bm2基因型占3.68%(5/136)。胃癌分离株中VacA m1b基因型占16.67%(4/24);VacA m2基因型占75.00%(18/24);VacA m1bm2基因型占4.17%(1/24)。不同临床疾病间VacA m区基因型分布差异无统计学意义(P>0.05)。结论浙江8个地区Hp菌株的优势基因型为cagA+、va-cAs1/m2,vacA的s区和m区的分布与分布个体的临床类型无关。

连蒲饮治疗脾胃湿热型幽门螺杆菌感染的疗效观察及其对CagA、VacA蛋白的影响

目的观察中药连蒲饮治疗脾胃湿热型幽门螺杆菌感染的疗效观察及其CagA、VacA蛋白的影响。方法 29例符合HP感染脾胃湿热证患者,评价治疗前后中医症候疗效、HP根除率以及对CagA、VacA蛋白的影响。结果治疗后症状改善总有效率96.55%,并且治疗后CagA、VacA蛋白的滴度明显降低(P<0.05)。结论连蒲饮能有效的改善患者的临床症状,其可能的治疗机制与降低CagA、VacA蛋白滴度,减轻HP毒力有关。

幽门螺杆菌VacA、CagA及BabA蛋白的二级结构和免疫表位预测分析

目的:预测幽门螺杆菌的重要抗原组分VacA、CagA及BabA蛋白的二级结构和B细胞表位。方法:基于序列比对和进化树分析,选择幽门螺杆菌J99作为源菌株,进行相关蛋白质二级结构和免疫表位的预测。应用DNASTAR Protean软件,通过Chou-Fasman和Garnier-Robson方法,预测α螺旋、β折叠、转角以及卷曲结构;通过Jameson-Wolf、Emini、Kyte-Doolittle和Karplus-Schulz方法,分别预测抗原性指数、表面可能性、氨基酸亲水性和柔性区域。结果:VacA和BabA有较多的β折叠,CagA主要由大量α螺旋组成,三者转角或卷曲的构成比例则基本相似。VacA蛋白有5～11、28～31和1 235～1 243等18个优势B细胞表位区段,BabA的优势表位有19～25、41～55和692～702等16个区段;CagA有更多的B细胞表位,主要分布在5～12、40～57及1 154～1 167等30个区段。结论:基本明确了VacA、CagA及BabA蛋白的二级结构特征和B细胞表位区段,为进一步通过动物实验筛选出高效表位奠定了基础。

幽门螺杆菌VacA重组蛋白表达、纯化及鉴定

目的研究幽门螺杆菌空泡毒素(VacA)编码基因在大肠埃希菌中的表达及纯化重组蛋白的抗原性。方法将PET32 a-vacAE-.coliBL21(DE3)工程菌株常规培养,碱裂解法小量提取重组质粒DNA,琼脂糖凝胶电泳进行酶切鉴定,基因测序法进行插入基因序列分析。重组蛋白采用IPTG诱导表达,镍亲和层析原理提纯,ELISA法检测其抗原性。结果经酶切鉴定表明,插入的基因片段全长约2 240 bp,测序分析及与Genebank比较,可以肯定插入片段为vacA基因,ELISA法检测重组蛋白具有良好的抗原性。结论VacA重组蛋白在大肠埃希菌中成功表达,重组蛋白具有良好的抗原性。