Vasostatin基因重组腺病毒载体的构建及其对胰腺癌生长的抑制作用

目的 以复制缺陷型腺病毒为载体 ,构建vasostatin基因重组腺病毒 ,并观察其对胰腺癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用。方法 以人肌肉cDNA文库为模板应用PCR的方法扩增出vasostatin的DNA片断 ,定向插入腺病毒穿梭质粒 pshuttle CMV经酶切、测序鉴定正确后 ,电穿孔法将重组穿梭质粒转化E .coliBJ5 183 AdEasy 1感受态细菌 ,行细菌内同源重组。将抗性筛选和酶切鉴定正确的重组质粒 pAd CMV vasostatin转染 2 93细胞进行包装。病毒扩增纯化后 ,病毒感染人胰腺癌细胞 ,RT PCR和Western印迹法检测vasostatin的表达状况。复制人胰腺癌裸鼠移植瘤模型 ,瘤内注射 10 7pfupAd CMV vasostatin、10 8pfupAd CMV LacZ及PBS ,观察移植瘤的生长曲线及瘤重。 结果 PCR产物电泳后可见长度为 5 6 0bp左右的目的条带 ;酶切及测序鉴定表明穿梭质粒 pshuttle CMV中插入了vasostatin的DNA片断 ;卡那霉素抗性筛选及PacI酶切鉴定证实腺病毒重组质粒 pAd CMV vasostatin构建成功 ;转染 2 93细胞 7天后观察到细胞病理学效应出现。PCR鉴定表明重组腺病毒中含有vasostatin片断。RT PCR和Western印迹法证实vasostatinmRNA及蛋白的表达。治疗后 3周 pAd CMV vasostatin组移植瘤的体积及瘤重均显著小于 pAd CMV LacZ组及PBS组。

人嗜铬粒蛋白AN-端片段Vasostatin-1(CGA1-76)的原核表达

目的制备编码人Vasostatin-1基因片段,利用大肠杆菌表达重组Vasostatin-1蛋白。方法根据人Vasostatin-1基因序列,设计、合成3对PCR引物,利用PCR合成法制备编码Vasostatin-1的DNA。将Vasostatin-1基因定向插入原核表达载体pGEX-4T-1,行酶切和DNA测序鉴定,并将构建的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)。用IPTG诱导BL21(DE3)中导入的Vasostatin-1基因的表达,行SDS-PAGE分析。用GSTrap亲合柱纯化重组Vasostatin-1蛋白。结果用PCR合成法制备了228bp的Vasostatin-1基因片段,并成功构建了重组质粒pGEX-4T-Vasostatin-1,DNA测序显示Vasostatin-1DNA序列和插入位点正确。经IPTG诱导,特异表达出以包涵体形式存在36kDa的重组Vasostatin-1蛋白。结论制备、克隆了人Vasostatin-1基因片段,并在大肠杆菌中表达出重组Vasostatin-1蛋白。

腺病毒介导的Vasostatin基因对血管内皮细胞的作用

目的研究腺病毒介导的Vasostatin基因对体外培养的血管内皮细胞增殖及凋亡的作用。方法采用MTT法观察Vasostatin基因对人脐静脉血管内皮细胞ECV304的体外细胞增殖的影响。采用透射电镜、TUNEL与Hoechst33258双重荧光染色、流式细胞仪AnnexinV/PI双染法,检测腺病毒介导的Vasostatin基因作用后人脐静脉血管内皮细胞的凋亡。结果Ad-Vasostatin(MO I分别为25和50)作用72 h后,ECV304细胞数显著少于PBS组和Ad-lacZ组(P<0.05);透射电镜下及TUNEL/Hoechst33258双重荧光染色,ECV304细胞出现典型的凋亡形态学改变。以MO I为50的Ad-Vasostatin处理ECV304细胞72 h后,细胞凋亡率为(15.70±0.84)%,PBS组为(2.54±0.83)%,Ad-lacZ组为(2.34±0.79)%,三组比较均有显著性差异(P<0.01)。结论腺病毒介导的Vasostatin基因可显著抑制人脐静脉血管内皮细胞ECV304的体外细胞增殖,同时对人脐静脉血管内皮细胞的凋亡具有诱导作用。

真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Vasostatin的构建及其在293T细胞中的表达

目的构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Vasostatin并检测其在真核细胞内的表达水平。方法将带有信号肽的Vasostatin基因片段克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体上,经酶切鉴定及测序分析证明构建成功后,以脂质体介导法转染293T细胞,通过Westernblot法,检测其在293T细胞内的表达水平。结果所构建的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Va-sostatin转染293T细胞后,在其裂解的上清液中,检测到目的基因的表达。结论已成功构建了pcDNA3.1(+)-Vasostatin表达载体,并在真核细胞中表达了目的蛋白。

Vasostatin重组腺病毒的构建和体外表达的研究

目的 构建 vasostatin重组腺病毒表达载体 ,并进行体外表达研究。方法 根据 Gen Bank中提供的钙网蛋白序列 ,设计并合成引物 ,以人骨骼肌 c DNA文库为模板用 PCR扩增出人 vasostatin基因 ,将其克隆入 T载体。经酶切及测序鉴定后亚克隆至穿梭载体 ,与经过限制酶处理的骨架腺病毒载体 DNA- TPC复合物共转染 2 93细胞。用 Western blot检测体外表达。结果 PCR扩增出约 5 90 bp产物 ,测序结果与文献报道一致。用 PCR及Western blot证实重组腺病毒构建成功 ,能有效的表达出 vasostatin蛋白。结论 vasostatin重组腺病毒载体能有效的在体外表达出

SHR和WKY大鼠血浆vasostatin-2水平的比较研究

目的探讨自发性高血压(SHR)大鼠外周血vasostatin(VS)-2水平变化及阐明其意义。方法采用ELISA方法检测14只SHR大鼠组和14只京都Wistar(WKY)大鼠组空腹外周血血浆VS-2水平,并利用清醒自由大鼠血流动力学动态检测技术检测大鼠血压、心动周期及压力感受性反射敏感性。结果 1与WKY对照组相比,SHR组大鼠空腹血浆VS-2水平升高〔(0.43±0.05)pg/ml vs.(0.34±0.05)pg/ml,P<0.01〕;2Pearson相关分析显示,收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、平均动脉压(MAP)与VS-2水平呈正相关(r=0.781,P<0.05;r=0.822,P<0.05;r=0.918,P<0.01);HR与VS-2水平无关(r=0.350,P>0.05);BRS与VS-2水平呈负相关(r=-0.959,P<0.01);进一步使用多元线性逐步回归分析显示,MAP及BRS是VS-2水平的独立影响因子(P<0.05)。结论SHR大鼠空腹血浆VS-2水平高于WKY大鼠,表明VS-2可能在动脉血压的调节过程中发挥作用。

Vasostatin-2与心肌梗死患者慢性心力衰竭发生及预后的关系

目的探讨Vasostatin-2与心肌梗死患者慢性心力衰竭(CHF)发生及预后的关系。方法选取心肌梗死后发生CHF的患者450例(CHF组),收集其一般临床资料,包括年龄、性别、高血压史、糖尿病史、肾功能、血脂、空腹血糖、糖化血红蛋白(HbA1c)、氨基末端B型钠尿肽原(NT-proBNP),并检测所有患者血清Vasostatin-2、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和高敏C反应蛋白(hs-CRP)水平。以冠状动脉造影阴性者和健康体检者149名作为对照组。对CHF患者随访3年,记录主要不良心血管事件(MACE),根据是否发生MACE分为MACE组和无MACE组。采用Pearson相关分析或Spearman相关分析评估各项指标之间的相关性。采用Logistic逐步回归分析评估CHF患者发生MACE的危险因素。结果CHF组血清Vasostatin-2水平显著低于对照组(P<0.001),血清TNF-α、hs-CRP及NT-proBNP水平均明显高于对照组(P<0.001)。CHF组不同心力衰竭阶段之间血清Vasostatin-2水平差异均有统计学意义(P<0.001)。相关分析结果显示,Vasostatin-2水平与左心室射血分数(LVEF)呈正相关(r=0.377,P<0.05),与NT-proBNP、TNF-α、hs-CRP、心力衰竭阶段均呈负相关(r值分别为-0.294、-0.267、-0.312、-0.288,P<0.05)。与无MACE组比较,MACE组NT-proBNP、hs-CRP和TNF-α显著升高(P<0.001),Vasostatin-2显著降低(P<0.001)。Logistic逐步回归分析结果显示,Vasostatin-2、NT-proBNP、hs-CRP、TNF-α、高龄、高血压史、糖尿病史、肾功能、心力衰竭阶段(C、D)和LVEF均是CHF患者发生MACE的危险因素(P<0.05)。结论血清Vasostatin-2水平与心肌梗死患者CHF的发生及预后相关,或可作为CHF患者辅助诊断和预后判断的生物标志物。

Vasostatin-1对缺氧复氧肾小管上皮细胞炎性损伤的影响

目的探讨血管生成抑制因子vasostatin-1(VS-1)对缺氧复氧肾小管上皮细胞的炎性损伤作用及机制。方法采用缺氧复氧方式制造肾小管上皮细胞炎性损伤。构建慢病毒载体并以脂质体法将shVS-1转染NRK-52E细胞。ELISA法检测细胞中LDH和IL-1β含量;Western blot检测细胞中VS-1、pro-caspase-1和caspase-1蛋白表达。结果与对照组相比,缺氧复氧组细胞LDH和IL-1β含量显著升高,且VS-1蛋白表达显著升高。成功构建沉默VS-1的慢病毒载体,且转染缺氧复氧NRK-52E细胞,可降低细胞中LDH和IL-1β含量、降低caspase-1蛋白表达,过表达VS-1则具有相反的功能。结论沉默VS-1可保护缺氧复氧肾小管上皮细胞的炎性损伤,可能与下调caspase-1有关,可为急性肾损伤的临床治疗提供依据。

酵母双杂交技术筛查与vasostatin相互作用的蛋白质

目的:通过酵母双杂交技术筛查与血管生长抑制因子vasostatin相互作用的蛋白质,为进一步阐明其抑制血管生成作用的分子机制奠定基础。方法:应用第3代酵母双杂交系统,构建vasostatin诱饵质粒,经过表达和自激活验证后筛选预转化的人内皮细胞cDNA方库。将在四缺培养基中筛选得到的阳性克隆提取酵母质粒转化大肠杆菌,进行限制性酶切和测序,寻找可能与vastotatin具有相互作用的蛋白序列。结果:经过酵母双杂交共获得21个克隆,经过验证,有3个阳性克隆;经过NCBI的BIAST进行同源性分析,它们的核酸和蛋白序列与已知基因高度同源,它们分别为层黏连蛋白α5(7547～8112)和整合素αV(1257～1820、316～878)片段,均为重要的配体结合部位。Vasostatin蛋白通过与该区域结合,影响FAK、VEGF和bFGF等的信号通路,抑制血管生成。结论:酵母双杂交筛选获得的层黏连蛋白和整合素蛋白的3个蛋白片段,它们与肿瘤内血管内皮细胞增殖和迁移等密切相关。

真核表达质粒PcDNA3.1(+)-带有白蛋白信号肽的Vasostatin(120-180aa)的构建及其在体内外细胞中的表达

目的构建真核表达质粒PcDNA3.1(+)-带有白蛋白信号肽的Vasostatin(120-180aa)并了解其在体内外真核细胞中的表达。方法将带有白蛋白信号肽的Vasostatin(120-180aa)的逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)产物克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体上,经酶切鉴定及测序分析证明构建成功后,以脂质体介导法转染体外培养的真核293T细胞及注射入鼠骨骼肌细胞中,了解其在体内外真核细胞中的表达情况。结果我们获取了包含带有白蛋白信号肽的Vasostatin(120-180aa)成熟肽及HA抗原在内的一段cDNA片段,并成功地与真核表达载体PcDNA3.1(+)连接,经测序表明,其中含有的带有白蛋白信号肽的Vasostatin(120-180aa)成熟肽的序列与Genebank上报道的序列完全一致。即我们成功构建了真核表达质粒PcDNA3.1(+)-带有白蛋白信号肽的Vasostatin(120-180aa)。之后,在转染了该质粒的体外真核293T细胞的上清液中及骨骼肌注射了该质粒的鼠血液中,利用Western-blot法检测到了目的基因的蛋白质。结论带有白蛋白信号肽的真核表达质粒PcDNA3.1(+)-Vasostatin(120-180aa)增强了蛋白分泌表达能力,这为进一步应用该质粒治疗全身新生血管类病奠定了一定基础.

Vasostatin基因抑制裸鼠种植性肝癌血管生成的实验研究

目的:探讨人血管内皮抑制素Vasostatin基因对裸鼠种植性肝癌生长及肿瘤新生血管生成和细胞凋亡的影响。方法:建立裸鼠肝癌种植瘤模型,采用Vasostatin基因质粒(VAS组)及空壳质粒(对照组)进行瘤体内电转染,观察治疗后肿瘤生长情况,计算肿瘤体积及抑瘤率,应用免疫组织化学技术检测肿瘤微血管密度变化,TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡情况。结果:VAS组抑瘤率为31.73%。对照组、VAS组肿瘤质量分别为(1.23±0.82)g和(0.81±0.62)g;微血管密度分别为18.26±1.72和5.62±0.59;肿瘤细胞凋亡指数分别为6.25±1.32和16.48±0.96,2组间差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:人血管内皮抑制素Vasostatin基因对裸鼠种植性肝癌生长具有明显的抑制作用,可促进肿瘤细胞的凋亡,进而影响肿瘤生长。

Vasostatin-1上调脐静脉内皮细胞表达HO-1减轻软脂酸所致炎症反应

目的研究vasostatin-1(VS-1)对软脂酸诱导调脐静脉内皮细胞所致炎症反应和氧化应激的影响,并探讨其潜在的机制。方法体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),用100 nmol/L VS-1预孵育2 h,Western blot检测HUVECs中血红素氧合酶-1(HO-1)的表达,酶学法测定其活性的变化。随后检测VS-1处理前后Nrf2的核转位情况,并采用siRNA沉默其表达观察其对HO-1表达的影响。在研究VS-1对软脂酸所致的炎症反应时,首先以VS-1孵育细胞2 h,随后加入100μmol/L软脂酸作用12 h。ELISA测定IL-6和TNF-α的分泌;荧光探针测定胞内活性氧类(ROS)的产生;DNA结合实验测定NF-κB活性的变化。结果100 nmol/L VS-1孵育HUVECs细胞6 h即可诱导HO-1的表达并上调其酶活性,并持续至18 h。同时,VS-1也能上调细胞核内Nrf2的水平并增加其DNA结合活性;采用Nrf2 siRNA沉默其表达后,HO-1的表达水平和酶活性显著下降;软脂酸处理细胞后,细胞核内p65水平显著增高,细胞培养上清中IL-6和TNF-α含量以及胞内ROS含量明显增多,NF-κB的DNA结合活性也明显增强。而经100 nmol/L VS-1孵育后,NF-κB的活性有所降低,IL-6、TNF-α和ROS含量均有所减少;采用HO-1抑制剂SnPP共同孵育细胞后,VS-1对细胞因子以及ROS的抑制效应有所减弱。结论VS-1上调脐静脉内皮细胞表达HO-1,从而减轻软脂酸所致炎症反应。

人vasostatin的克隆、表达、纯化及活性检测

从成人肝脏cDNA文库中 ,PCR扩增得到人vasostatin基因编码区序列 ,将此序列插入原核表达载体pQE3 0进行表达 ,SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)测定表明产物以包涵体形式存在 ,表达量占菌体总蛋白量的 5 0 %以上 .包涵体洗涤后溶于 8mol/L尿素溶液 ,在变性条件下通过镍 氨三乙酸 (Ni NTA)金属螯合亲和层析柱进行纯化后 ,再经透析进行复性 .N端氨基酸序列、分子质量、等电点等理化指标的测定结果与理论值相符 .用内皮细胞增殖试验、内皮细胞迁移试验以及鸡胚尿囊膜血管生成试验等方法进行活性检测 ,证实复性的表达产物具有抑制内皮细胞增殖和迁移。

人血管抑制因子Vasostatin短片段(120-180 aa)的克隆、表达及功能研究

目的:利用基因工程技术,克隆并表达人血管抑制因子Vasostatin120-180aa功能区片段,探讨其对鸡胚绒毛尿囊膜新 生血管抑制的作用。方法:采用PCR技术扩增人血管抑制因子Vasostatin120-180aa功能区基因,并利用pQE30原核表达系统诱 导表达Vasostatin120-180aa,经镍金属螯合层析法纯化,通过鸡胚绒毛尿囊膜实验验证其抑制新生血管生成的作用。结果:PCR 扩增出了长度为180 bp的Vasostatin120-180aa功能区基因,后经pQE30原核表达系统表达并纯化出Vasostatin120-180aa,SDS-PAGE 显现一条约8 kD的阳性条带,Vasostatin120-180aa可显著抑制鸡胚绒毛尿囊膜新生血管的生成。结论:原核表达的Vasosta- tin120-180aa功能区片段具有生物学活性,可明显抑制鸡胚绒毛尿囊膜新生血管的生成,在一定范围内呈量效依赖性。

生物发光显像技术对血管生成抑制因子vasostatin在肿瘤细胞PC3中活性监测

目的应用非侵入性活体显像技术研究血管生成抑制因子vasostatin。方法采用融合表达方案,将治疗基因vasostatin和报告基因fluc偶联构建融合表达载体,使表达的融合蛋白中两个蛋白互相不干扰,并有天然的特性。结果将稳定表达FLuc阳性对照和V10FL融合蛋白的PC3细胞进行体外生物发光显像。用稳定表达Fluc的PC3细胞构建荷瘤模型,用生物发光显像能检测到肿瘤的发生。结论可应用非侵入性活体显像技术进行体内和体外基因表达的检测与监控。

真核表达质粒PcDNA3.1（＋）-带有Vasostatin自身信号肽的Calreticulin（120～180aa）的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的 构建真核表达质粒PcDNA3.1（＋）-带有Vasostatin自身信号肽的Calreticulin（120～180aa）并了解其在真核细胞内的表达。方法 将带有Vasoatatin自身信号肽的Calreticulin（120～180aa）的RT-PCR产物克隆至peDNA3.1（＋）真核表达载体上，经酶切鉴定及测序分析证明构建成功后，以脂质体介导法转染真核细胞COS-7，并行Western法检测。结果 成功构建了真核表达质粒PeDNA3.1（＋）-带有Vasostatin自身信号肽的Calreticulin（120～180aa），将之转染体外的真核COS-7细胞后，在其上清液中，检测到目的蛋白质。结论 该构建的质粒可在真核细胞中表达目的蛋白质，这为基因治疗视网膜新生血管类病奠定了一定基础。

重组人血管抑制因子Vasostatin抑制兔角膜新生血管的研究

目的探讨重组人血管抑制因子(Vasostatin)对于碱烧伤诱导的家兔角膜新生血管的抑制作用。方法采用1mol/LNaOH溶液烧伤家兔角膜,建立碱烧伤诱导的家兔角膜新生血管的动物模型;将家兔分为A、B、C、D4组,每组10只眼。伤后24h后分别给予1×PBS缓冲液,25、50、100μg/mLVasostatin球结膜下注射,2次/周,共4周。测量各时间点角膜新生血管的生长面积,并在伤后28d处死动物,取其角膜行Ⅷ因子相关抗原的免疫组织化学染色,观察血管的生长情况。结果各时间点角膜新生血管的面积,B组、C组及D组均低于A组(P<0.05),C组及D组均低于B组(P<0.05),C组与D组相比,差异无显著性(P>0.05)。结论重组人Vasostatin蛋白可有效抑制角膜新生血管的形成。

腺病毒介导vasostatin-1基因转染表达对大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

目的:构建并鉴定携带人嗜铬粒蛋白A的N端1～76片段(CGA1-76)即vasostatin-1(VS-1)基因的腺病毒表达载体,观察重组腺病毒在大鼠心肌细胞中的表达,探讨VS-1转基因治疗对心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用。方法:(1)利用CGA1-58cDNA模板,设计引物,利用PCR合成、扩增CGA1-76的cDNA并将其克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrack,经PmeⅠ酶切线性化后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在大肠埃希菌BJ5183中同源重组。将鉴定正确的同源重组质粒pAd-VS-1线性化后转染QBI-293A细胞进行包装、扩增得到重组腺病毒颗粒Ad-VS-1,将该病毒感染大鼠心肌细胞H9c2并通过蛋白质印迹法检测其表达。(2)建立心肌细胞缺氧/复氧(H/R)损伤模型,分为4组:空白组、H/R组、空载腺病毒转染+H/R组、Ad-VS-1转染+H/R组;测定各组心肌细胞活力,超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量。结果:(1)经PCR、基因测序、酶切鉴定证实重组质粒pAd-VS-1构建成功,将其导入QBI-293A细胞,通过蛋白质印迹法证实病毒颗粒Ad-VS-1感染心肌细胞后VS-1蛋白表达。(2)H/R组心肌细胞活力和SOD含量较空白组明显降低,MDA增加;而VS-1基因转染提高了心肌细胞H/R模型心肌细胞活力和SOD含量,并降低了MDA生成量。结论:成功构建Ad-VS-1,将其感染大鼠心肌细胞后能够表达VS-1并对心肌细胞H/R损伤具有保护作用,其机制和抗氧化作用有关。

重组人血管抑制因子Vasostatin对视网膜血管内皮细胞增殖的影响

目的 探讨重组人血管抑制因子Vasostatin对体外培养的恒河猴视网膜血管内皮细胞 (RF/6A)增殖的影响。方法 以bFGF刺激增殖 ,体外培养恒河猴视网膜血管内皮细胞 (RF/6A)至 4代 ,分别加入不同质量浓度的重组人Vasostatin蛋白 ,并采用MTT法、3 H TdR法检测 2、4、6d时其对血管内皮细胞增殖抑制的作用 ,同时利用流式细胞仪对重组人Vasostatin蛋白是否诱导细胞凋亡进行了探讨。结果 MTT法、3 H TdR两种方法均显示重组人Vasostatin蛋白以质量浓度依赖的方式抑制bFGF刺激的恒河猴视网膜血管内皮细胞 (RF/6A)的增殖。流式细胞仪检测显示加入重组人Vasostatin蛋白后 ,G0 /G1期无明显的亚二倍体核形峰出现 ,其不是通过诱导细胞凋亡的方式来抑制细胞增殖的。结论 重组人Vasostatin蛋白在体外具有抑制bFGF诱导的血管内皮细胞增殖的作用 ,其有可能成为一种有效的血管新生抑制剂。

血管新生抑制蛋白Vasostatin(120-180aa)防治兔角膜新生血管的研究

目的探讨重组人血管抑制因子Vasostatin(120-180aa)对于碱烧伤诱导的家兔角膜新生血管的抑制作用。方法采用1 mol/L NaOH溶液烧伤家兔角膜,建立碱烧伤诱导的家兔角膜新生血管的动物模型;将家兔分为A、B、C、D4组,每组10只眼。伤后24 h后分别给予1×PBS缓冲液,20、40、80μg/mL Vasostatin(120-180aa)球结膜下注射,2次/周,共4周。测量各时间点角膜新生血管的生长面积,观察血管的生长情况。结果各时间点角膜新生血管的面积,B组、C组及D组均低于A组(P<0.05),C组及D组均低于B组(P<0.05),C组与D组相比,差异无显著性(P>0.05)。结论重组人Vasostatin(120-180 aa)蛋白可有效抑制角膜新生血管的形成。