奶牛生物钟基因CLOCK的真核表达载体构建、生物信息学分析及其组织表达谱

旨在克隆奶牛昼夜运动输出周期(circadian locomotor output cycles kaput,CLOCK)基因的蛋白编码区序列(coding sequence,CDS),构建该基因的真核表达载体,检测CLOCK基因在奶牛不同组织的相对表达丰度,并预测分析奶牛CLOCK蛋白的高级结构、理化性质及其功能特征。以奶牛肝脏组织cDNA为模板,通过PCR扩增奶牛CLOCK基因CDS区片段,利用同源重组法将其连接至pcDNA3.1-Puro-N-3HA载体;经酶切与测序鉴定后,将鉴定正确的质粒命名为pcDNA3.1-Puro-N-3HA-bCLOCK;将pcDNA3.1-Puro-N-3HA空质粒和pcDNA3.1-Puro-N-3HA-bCLOCK重组质粒分别转染至HEK293T细胞,通过蛋白质免疫印迹(Western blot)检测CLOCK蛋白的过表达效率;提取奶牛的心、肝、脾、肺等10个组织的总RNA并反转录为cDNA,以此为模板通过实时定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)检测CLOCK基因在奶牛不同组织的表达变化;同时,利用生物信息学软件对奶牛CLOCK基因及其编码蛋白进行功能预测分析。琼脂糖凝胶电泳结果显示,成功克隆了奶牛CLOCK基因全长CDS区片段。酶切与测序结果显示,pcDNA3.1-Puro-N-3HA-bCLOCK真核表达载体构建成功。Western blot结果表明,该真核表达载体在HEK293T细胞中成功表达HA-CLOCK融合蛋白。qPCR结果表明,CLOCK基因在心、肝、脾、肺等10个组织中均有表达,其中在心脏表达最高,在小肠表达最低。生物信息学分析结果表明,奶牛CLOCK基因的CDS区与绵羊、山羊、骆驼的相似性较高;奶牛CLOCK蛋白由845个氨基酸组成,分子质量为95.12 kDa,无跨膜结构域与信号肽,为亲水性蛋白,二级结构中富含α-螺旋;奶牛CLOCK蛋白的三级结构与绵羊、人和小鼠的差异极小。结论:本研究成功克隆了奶牛CLOCK基因全长CDS区片段并构建了其真核表达载体,qPCR检测CLOCK基因在奶牛不同组织的表达谱,通过生物信息学预测分析CLOCK蛋白的结构与功能特性,为进一步探究奶牛CLOCK基因的生物学功能提供理论依据。

山羊生物钟基因CLOCK真核表达载体的构建和生物信息学分析

试验旨在构建山羊昼夜运动输出周期蛋白(circadian locomotor output cycles kaput,CLOCK)基因真核表达载体,系统分析山羊CLOCK蛋白的生物学特性。从山羊卵巢组织中提取总RNA,反转录成cDNA后经PCR扩增山羊CLOCK基因CDS区序列,并以同源重组的方式将其连接至pcDNA3.1-Puro-N-3HA载体;经PCR、酶切和测序鉴定后,将阳性质粒命名为pcDNA3.1-3HA-gCLOCK;将pcDNA3.1-Puro-N-3HA和pcDNA3.1-3HA-gCLOCK质粒分别转染至HEK293T细胞中,通过实时荧光定量PCR和Western blotting检测山羊CLOCK基因的表达效果,并对山羊CLOCK基因进行系统的生物信息学分析。结果显示,山羊CLOCK基因CDS区片段长2538 bp,将其与线性化的pcDNA3.1-Puro-N-3HA载体重组连接并通过酶切和测序鉴定后,成功构建了pcDNA3.1-3HA-gCLOCK真核表达载体;实时荧光定量PCR和Western blotting检测结果显示,pcDNA3.1-3HA-gCLOCK转染组CLOCK基因在mRNA和蛋白水平的表达量均极显著高于pcDNA3.1-Puro-N-3HA对照组(P<0.01)。生物信息学分析结果表明,山羊CLOCK基因CDS区序列与绵羊、牛和马的相似性分别为99.4%、98.7%和95.6%。山羊CLOCK蛋白是一种不稳定蛋白,具有一定的亲水性,无跨膜区和信号肽。二级结构由α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲组成;三级结构与小鼠和人的CLOCK蛋白相比具有极高的相似性。本研究成功构建了山羊生物钟基因CLOCK真核表达载体,并进行了生物信息学分析,为进一步研究山羊CLOCK基因的生物学功能及山羊生物钟的转录调控机制提供了材料。

小鼠 Usp2基因序列分析、真核表达载体构建和启动子功能鉴定

为了分析小鼠泛素特异性蛋白酶2(USP2)2种主要转录本(Usp 2-45和Usp 2-69)及其编码蛋白的理化特性,构建Usp 2-45真核表达载体和Usp 2启动子荧光素酶报告质粒,探究生物钟系统对Usp 2不同转录本启动子的调控作用,本试验利用在线软件对小鼠Usp 2-45和Usp 2-69基因进行生物信息学分析;克隆Usp 2-45基因的蛋白编码序列(CDS)并构建pcDNA3.1-Usp2-45-Flag重组载体,转染至小鼠NIH3T3胚胎成纤维细胞后,利用实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹技术检测Usp2-45在mRNA和蛋白水平的表达;扩增Usp 2-45和Usp 2-69的启动子片段,并构建其荧光素酶报告质粒,通过双荧光素酶报告试验检测Usp 2启动子对生物钟核心转录因子脑肌类芳香烃受体核转位蛋白1(BMAL1)和昼夜运动输出周期蛋白(CLOCK)的应答活性;通过构建不同长度的Usp 2-45启动子荧光素酶报告质粒鉴定其生物钟转录调控功能区。结果显示,小鼠USP2-45和USP2-69蛋白均为不稳定蛋白,亲水性强,无跨膜区域和信号肽,且基因的CDS区高度保守;pcDNA3.1-Usp2-45-Flag重组质粒的酶切和测序结果与预期一致,转染重组质粒组的Usp2-45在mRNA和蛋白水平的表达均显著高于对照组(P<0.01)。双荧光素酶报告试验结果显示,Usp 2-69启动子对BMAL1/CLOCK无应答活性,而不同长度的Usp 2-45启动子对BMAL1/CLOCK均具有显著应答活性,活性由强到弱依次为1368、2004和998 bp。结果表明,本试验系统分析了小鼠USP2的理化性质和结构特性,成功构建了pcDNA3.1-Usp2-45-Flag真核表达载体,初步鉴定了生物钟系统选择性调控Usp 2-45节律性转录的启动子功能区。

分布式目录同步的冲突处理与副本管理研究

随着用户拥有电脑数目的增多,为了维护多机之间数据的一致性,目录同步正成为十分普遍的应用.然而在分布式环境下进行目录同步,因客户机频繁接入网络,造成数据传输延时不可知,并发操作识别需要重新界定,修改冲突也无法采用传统加锁机制处理.为了解决上述问题,提出了MSVerion算法,该算法融合了SVN的冲突发现和Vector Clock的副本管理,能在合并变化文件时快速地发现冲突,减少分布式环境下文件副本管理中需要保存的数据量.同时遵循最终一致性理论,给出了目录同步中3种冲突操作的解决策略.

基于向量时钟模型的NoSQL最终一致性的研究

最终一致性作为衡量NoSQL数据库性能的重要指标,对NoSQL的应用与发展起着重要作用。针对最终一致性解决方案存在的问题,提出基于向量时钟的最终一致性模型。模型为数据加入了版本的概念,通过版本向量和时间戳的引入,为数据标识了版本信息,同时给出了冲突检测和处理方案。对比分析表明,方案很好地解决了问题,提高了最终一致性的性能,在NoSQL数据库的设计过程中具有较好的应用价值。

消息联盟系统中保持消息因果序协议的研究

由多个代理服务器组成的消息中间件联盟系统提供了更好的扩展性,但没有保证消息之间的因果序关系。该文提出并设计了一个新的保证消息因果序的通信协议MOMCO,该协议基于向量时钟,不但保证在消息联盟系统中消息的因果序,而且携带的排序控制信息量小,避免了采用二维矩阵时钟导致的较高代价,适用于大规模应用的场合。

分布式计算的并发测量

本文提出了一种分布式计算的并发测量方法，这些测量使用基于局部时钟的区域向量时钟，延迟向量和计算高度等概念量化了并发计算时间和同步延迟时间，不用定义原子事件和划分事件粒度；测量机制独立于被测量的程序，容易计算，管理简单。

CPSO-LSSVM在自回归钟差预报中的应用

建立了基于自回归算法的钟差预报模型,利用具有较强非线性运算能力和容错能力的最小二乘-支持向量机算法来求解自回归参数,同时利用具有快速寻优特点的粒子群算法来优化最小二乘-支持向量机参数。为了克服粒子群算法容易陷入局部极值而形成早熟的缺点,提出了分别在粒子初始化位置和陷入局部极值的位置上进行混沌处理,提高了粒子搜索的遍历性和寻优能力,从整体上优化了算法。最后通过星载钟差数据对该算法进行了验证,结果表明:本文算法能够实现亚纳秒量级的预报精度并提升卫星授时导航性能。

大鼠PER2基因RNAi慢病毒载体的构建及干扰效率的测定

目的构建及筛选有效干扰大鼠血管平滑肌细胞PER2基因的shRNA慢病毒载体,并测定其干扰效率。方法设计大鼠PER2的siRNA靶序列,插入慢病毒载体质粒pGLV-U6-EGFP中,构建pLentivirus-per2-rat表达重组体并转染至A7r5大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞内,利用Real-time PCR方法检测PER2基因的mRNA表达水平,筛选有效沉默钟基因PER2表达的RNAi慢病毒载体。结果经电泳、基因测序证实插入的目的序列正确,有PER2表达,成功构建了pLentivirus-per2-rat表达重组体;转染慢病毒载体pLentivirus-per2-rat至A7r5大鼠胸血管平滑肌细胞,测定转染效率达70%;Real-time PCR检测PER2基因的mRNA相对表达量,筛选出有效干扰大鼠血管平滑肌细胞钟基因Per2表达的siRNA片段,使PER2mRNA表达量下调约84%。结论成功构建了大鼠PER2的RNAi慢病毒载体,为进一步研究时钟基因的功能奠定了基础。

虚拟时间及其在数据竞争检测中的应用

为将虚拟时间机制应用于数据竞争检测,提出描述虚拟时间3种基本实现形式的统一模型.先建立分布式执行的抽象模型,在此模型下统一描述虚拟时间的3种基本实现形式,即标量时间系统、向量时间系统和矩阵时间系统,并以向量时间系统和矩阵时间系统为例介绍虚拟时间的4种优化技术,最后讨论将虚拟时间应用到共享内存并发系统的数据竞争检测中需要解决的问题以及4个应用实例.结果表明,提出的模型能统一描述虚拟时间的不同实现形式,并能降低基于虚拟时间检测数据竞争的应用难度.

多移动终端笔记数据的同步方案设计

本文主要针对安卓个人云笔记应用的笔记数据的同步问题,包括多个移动终端的笔记数据的同步,同步冲突等,采用乐观复制,矢量时钟等技术,根据笔记是包含文本和若干附件的富媒体笔记的特点,提出了合适的数据模型,采用差量传输方式,设计了一套可行的同步方案。

雷达数字电路板故障诊断测试向量和故障字典模块设计技巧

介绍了一种基于VFP (VisualFoxPro)开发软件的雷达数字电路板故障诊断软件测试平台的测试向量生成和故障字典模块设计方法 ,重点讨论了其中某些关键技术的对策。

基于局部时钟的区域向量时钟

文中分析了传统向量时钟在应用中的局限性，提出了基于局部时钟的区域向量时钟，证明了这一时钟，刻画了计算的因果关系．区域向量时钟独立于程序实现，管理简单，降低了向量时钟方法在实际应用中的复杂度，适合于对分布式计算的性能分析和并发测量．

一种高精度实时GPS卫星钟差预测算法

为获得高精度实时GPS卫星钟差,文章提出一种基于多项式和最小二乘支持向量机(Least Squares Support Vector Machines,LS-SVM)相结合的钟差预报方法。该方法采用国际GNSS服务发布的超快速观测星历建模进行短期预报,首先根据卫星钟的物理特性用附有周期项的多项式模型进行拟合以提取趋势项和周期项,然后用LS-SVM对多项式拟合残差进行建模预报,最后将预报结果加上趋势项和周期项,得到最终的钟差预报值。试验结果表明,所提算法能够实时有效地对GPS卫星钟差进行预报,且精度优于超快速预报星历。

分布式计算在实时应用系统中的实现

实时系统是计算机应用的一个重要方面 ,许多实时系统由于检测和控制的设备在地理上的分散性 ,要实现集中式的计算机控制本身就有较大的难度 .分布式处理则相对较灵活 ,同时具有较好的性能价格比和容错性 ,近年来发展迅速 .本文以上海虹桥国际机场电力监控系统为例 。

基于同步向量的配电网运行数据监测装置设计

针对传统配电网在向智能配电网过渡过程中对运行数据监测多样性、实时性和准确性的要求,以及现有配电网数据监测装置数据采集实时性差和功能单一的现状情况,本文提出了基于同步向量的配电网运行数据监测装置设计方案,具体包括基于GPS时钟同步的电流监测模块、基于同步向量的运行阻抗监测模块和谐波监测模块,可实现配电网运行过程中电流、阻抗、损耗和谐波等多种数据的实时精确监测功能。同时设计了基于同步向量的配电网运行数据监测装置,对解决配电网中远程数据传输而导致的延迟问题、谐波测量精确度不高导致的系统性能下降问题以及单相接地故障的定位速度和精准度偏低问题均具有较好的针对性效果,可为传统配电网向智能配电网过渡提供数据精确监测设备的研发设计方案。

基于最小二乘支持向量机的钟差预报

为提高卫星钟差预报的精度,采用最小二乘支持向量机进行预报。对比不同核函数对LS-SVM预报精度的影响,并将其与二次多项式和灰色系统模型比较。结果表明,最小二乘支持向量机的短期(1天)预报精度明显优于另外两种模型,且线性核函数更适合最小二乘支持向量机的钟差预报。

利用遗传优化LSSVR进行导航卫星钟差预报

为提高导航卫星钟差预报的精度,提出了一种最小二乘支持向量回归(LSSVR)和遗传算法(GA)相结合的导航卫星钟差预报方法。根据卫星钟差序列变化的非线性特征,选用高斯径向基函数(RBF)建立卫星钟差LSSVR预测模型。针对LSSVR模型的参数选择问题,引入GA对不同星座以及原子钟类型预测模型的参数进行搜索寻优。该方法能够在较大范围内自动确定优化参数,提高LSSVR的泛化性能。将所提出的方法用于GPS卫星钟差的短期预报,并与常规预报方法进行对比。结果表明,GA-LSSVR模型对不同星座以及原子钟类型钟差预报均表现出良好的稳健性,能够在一定程度上抑制钟差预报误差随时间延长不断增大的问题,整体预报精度优于常规方法。

实用的相序分辨电路

介绍两种电子分辨电路 ,用于分辨三相电源的相序 ,可实现对电气设备正、逆序供电控制 .这与市场上应用的一般分辨的电路相比 ,具有体积小、可靠、简单。

基于DSP的神经网络SVPWM控制系统的设计

本文简述了基于DSP的神经网络控制系统的软硬件设计。采用TMS320LF2407A来实现空间电压矢量脉宽调制,实现神经网络的在控制系统的应用。并提出了采用一种多时钟分配方法对控制软件进行优化。