新型杀虫蛋白VIPs研究进展

简述了芽孢杆菌属 (Bacillus)中的新型活性杀虫蛋白 营养期杀虫蛋白VIPs及其编码基因的发现、特性、作用模式及机制等研究进展 ,并对其杀虫活性和安全因素作了初步评估和预示。

营养期杀虫蛋白VIPs研究进展

营养期杀虫蛋白(vegetative insecticidal proteins,VIPs)是苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)在对数生长中期分泌的一类新型杀虫毒蛋白。本文简述了芽孢杆菌属(Bacillus)中的新型活性杀虫蛋白营养期杀虫蛋白VIPs及其编码基因的发现、特性、作用模式等研究进展。

苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白Vips研究进展

苏云金芽孢杆菌Bt营养期杀虫蛋白Vips主要分为Vip1、Vip2和Vip33种。Vip1和Vip2构成二元毒素,对叶甲科昆虫具有特异杀虫活性。Vip3对鳞翅目昆虫具有广谱杀虫活性,该蛋白广泛存在于Bt中,与已知杀虫晶体蛋白ICPs没有序列相似性。Vip3通过诱发细胞凋亡,最终导致昆虫死亡,这与Btδ-内毒素的作用机理完全不同,Vips的发现对于Bt的进一步开发利用具有重要意义。本文主要对营养期杀虫蛋白Vips的分布、特性、作用机制及应用等进行报道。

苏云金芽孢杆菌vip3A基因的鉴定、克隆及活性分析

【目的】鉴定我国自行分离的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)菌株中vip3A基因的分布和基因型,从其中对鳞翅目幼虫表现高毒力的Bt菌株中克隆vip3Aa基因。【方法】利用PCR-RFLP方法确定vip3A基因的分布和鉴定基因型,利用PCR方法克隆vip3A全长基因。【结果】171株野生型Bt菌株中共鉴定出63株含有vip3A基因,均与vip3Aa1类基因相似。从TF9和Bt16菌株中克隆得到2个vip3Aa基因,分别构建了携带vip3Aa基因的表达载体p30vip-26和p30vip-27,SDS-PAGE和Western Blot分析表明,IPTG诱导后均可表达88 kDa左右的Vip3A蛋白,蛋白可溶性分析表明约10%可溶。这两种基因序列已被国际Bt基因命名委员会分别正式命名为vip3Aa26和vip3Aa27。生物测定结果显示,Vip3Aa27蛋白对粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)和棉铃虫(Helicoverpa armigera)3种重要鳞翅目害虫初孵幼虫的毒力较高,LC50值分别为0.125μg/mL,0.238μg/mL和9.238μg/mL。而Vip3Aa26蛋白仅对粉纹夜蛾有活性,LC50值为4.423μg/mL。【结论】本研究中的Vip3Aa27蛋白对粉纹夜蛾、甜菜夜蛾和棉铃虫幼虫均能表现高杀虫活性,而Vip3Aa26蛋白仅对粉纹夜蛾幼虫有活性,实验结果表明Vip3A蛋白个别氨基酸的变化对其杀虫活性影响很大。

新型Bt杀虫蛋白:VIP杀虫的机理与植物转基因应用

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是目前应用最多的生物杀虫剂。它能够产生多种杀虫因子,其中最主要是杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal proteins,ICP)和营养期杀虫蛋白(vegetative insecticidal protein,VIP)。VIP在Bt营养期生长阶段开始分泌,它们不形成蛋白晶体,和ICP在进化上没有同源性。VIP的杀虫活性很高,达到了纳克级水平,为一类新型杀虫蛋白,被认为是第二代生物杀虫剂。VIP根据蛋白质序列同源性主要分为三类:VIP1、VIP2和VIP3。VIP1和VIP2共同构成二元毒素对鞘翅目萤叶甲科昆虫具有特异性毒杀作用,VIP3对鳞翅目害虫具有很高的杀虫活性。由于VIP对一些可能对ICP产生抗性的害虫具有高效的毒杀作用,而且害虫对ICP和VIP产生交互抗性的几率也很小,因此转VIP植物研究受到了科学家的青睐,并已有不少成功的报道和专利。目前为止,已经利用VIP3构建了转基因水稻、转基因玉米、转基因棉花等多种转基因作物。

苏云金杆菌辅助蛋白P20对营养期杀虫蛋白Vip3A表达的影响

为检测苏云金杆菌辅助蛋白P20对Vip3A表达和杀虫活性的影响,将p20基因与vip3A基因相连构建了重组质粒pHVP20,然后电激转化至Bt中进行了共表达,以仅携带vip3A基因的质粒pHPT3作为对照质粒。Westernblot结果显示,当vip3A基因和p20基因在Bt无晶体缺陷株CryB中共表达时,Vip3A蛋白的最大表达量约是其在CryB(pHPT3)菌株中单独表达的1.5倍。生物测定结果表明,CryB(pHVP20)和CryB(pHPT3)菌株对初孵斜纹夜蛾幼虫的LC50值分别为48.79μg/mL和78.00μg/mL,这说明P20蛋白可以促进vip3A基因在Bt中的表达,但对提高Vip3A蛋白的杀虫毒力没有显著性帮助。

苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白基因vip3A在枯草芽胞杆菌中的表达

枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis常被用于表达杀虫和抗菌蛋白。为了探讨苏云金芽胞杆菌B.thuringiensis营养期杀虫蛋白基因(vip3A)在枯草芽胞杆菌中的表达情况,促进杀虫防病工程菌构建,将枯草芽胞杆菌168菌株核糖体小亚基S4蛋白基因的启动子与苏云金芽胞杆菌WB7菌株vip3A基因的编码序列连接,插入大肠杆菌Escherichia coli与枯草芽胞杆菌穿梭载体pAD123,得到重组原核表达质粒pADpvip,将重组质粒转化枯草芽胞杆菌标准菌株168和分离自辣椒体内的生防内生枯草芽胞杆菌BS-2菌株中,获得工程菌株。SDS-PAGE分析表明在枯草芽胞杆菌168菌株的部分工程菌株中有约88kDa大小的VIP条带,而BS-2的工程菌株中未见相应的条带,表明Vip3A蛋白仅在168菌株中表达。生物测定表明有5株168的工程菌株(168vip1-4,6)表现较高的杀虫活性,工程菌株发酵稀释液(约107CFU/mL)处理的小白菜叶片饲喂斜纹夜蛾2龄幼虫72h的杀虫效果可达87.64%～92.13%,但vip3A基因转入内生枯草芽胞杆菌BS-2中不表现杀虫作用。毒力测定表明168vip2菌株对斜纹夜蛾2龄幼虫72h的LC50为0.0194mL/mL。这些结果为进一步研究基因在枯草芽胞杆菌中的表达构建杀虫防病工程菌打下了基础。

苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白Vip与Cry蛋白的协同作用

将构建的营养期杀虫蛋白基因vip83表达质粒pBMB2 32 8和含杀虫晶体蛋白基因(cry1Ac1 0或cry1Ca)质粒同时电转化无质粒突变株BMB1 71并双抗筛选。经PCR特异引物扩增验证 ,分别得到含cry1Ac1 0和vip83、cry1Ca和vip83的双基因重组菌BMB2 830 1 71和BMB2 882 1 71。用单基因重组菌作对照 ,分别测定了营养期杀虫蛋白Vip83与杀虫晶体蛋白Cry1Ac1 0和Cry1Ca两组蛋白对 3种重要鳞翅目害虫毒力。经统计分析 ,结果表明两组杀虫蛋白Vip83与Cry1Ac1 0和Vip83与Cry1Ca之间对棉铃虫均存在拮抗作用 ,对甜菜夜蛾协同作用不明显 ;但对小菜蛾前者协同作用不明显 ,而后者则有增效作用 ,其共毒系数为32 6。双基因的遗传稳定性检测表明这种正负协同关系具有一定的分子遗传稳定性 。

ICP蛋白和VIP蛋白杀虫机理和毒性专一性的分子基础

苏云金芽胞杆菌在其整个生命周期中可产生2种不同类型的专一性极强的杀虫蛋白,一种是在其产孢过程中形成的杀虫晶体蛋白(ICPs),包括晶体毒素(Cry)和细胞裂解毒素(Cyt),前者对鳞翅目、鞘翅目、双翅目、鳞翅目和双翅目或鳞翅目和鞘翅目以及线虫具有专一的杀虫活性,后者在体外具广泛的溶细胞活性,但其杀虫谱较窄,杀虫活性较低;另一种是在营养生长期合成并分泌到胞外的非晶体杀虫蛋白即营养期杀虫蛋白(VIPs),具有与杀虫晶体蛋白相似的毒性活性和专一性。然而,这3种蛋白的分子结构和毒性机理各不相同。本文综述了ICP蛋白和VIP蛋白的杀虫机理和害虫抗性产生的分子基础,以及营养期杀虫蛋白的发现和应用对延缓或防止害虫针对ICP蛋白产生抗性的意义。

苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白VIP3研究进展

营养期杀虫蛋白(vegetative insectcidal protein,VIP)是由苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis,Bt)在营养生长指数中期至稳定期期间分泌产生的一类新型杀虫因子,分为VIP1、VIP2和VIP3三种,以VIP3的研究最为深入。VIP3A对鳞翅目害虫具广谱杀虫活性,可作用于敏感昆虫中肠上皮细胞刷状缘膜囊致离子通道的形成,杀虫活性达纳克级水平。利用BtICPs不同启动子与vip3基因重组可提高VIP3蛋白的表达量和稳定性。转vip3基因植物也已有构建成功的报道。本文从VIP3的类型和杀虫活性、作用机理、vip3基因的定位和分离、vip3基因重组和转vip3基因植物等方面详细介绍了VIP3近十年来的研究进展。

苏云金杆菌营养期蛋白杀虫活性及Vip3A-LS1基因克隆

对营养期高活性杀虫菌株进行筛选,得到高效菌株BtLS1,对其营养期杀虫蛋白活性及发酵特性进行了系统研究,克隆了该菌株的vip3A新基因。测定了31株vip3A基因阳性菌株营养期杀虫蛋白的活性,发现BtLS1和BtLS8菌株对甜菜夜蛾Spodopteraexigua生长的抑制作用明显高于其他菌株。进一步研究表明,BtLS1菌株营养期杀虫蛋白对初孵和2龄甜菜夜蛾幼虫的体重增长抑制率分别为95.3%±2.1%和90.7%±6.6%;对棉铃虫Helicoverpaarmigera初孵幼虫的校正死亡率为22.1%,对2龄幼虫的体重增长抑制率为78.7%±6.6%。发酵液中以胞内可溶性物质为主。设计vip3A全长基因特异引物PCR扩增,插入质粒pBluescriptSK(+),克隆测序证实该菌株中存在vip3A新基因,命名为Vip3A-LS1,GenBank登录号为DQ016968。按该序列推断的蛋白与同类蛋白的8个氨基酸之间存在差异。

Bt营养期杀虫蛋白Vip3及其作用受体的研究进展

营养期杀虫蛋白Vip3是苏云金芽胞杆菌在对数生长中期开始分泌表达的一类对鳞翅目害虫具有广谱杀虫活性的蛋白质,它与已知的杀虫晶体蛋白相似性很低。本文主要从vip3基因的挖掘,Vip3蛋白的特性、作用受体及其应用等方面作简要综述。

苏云金杆菌晶体蛋白Cyt1A对营养期杀虫蛋白Vip3A杀虫毒力的影响

为检测苏云金杆菌晶体蛋白Cyt1A对Vip3A表达和杀虫活性的影响,将p20和cyt1A基因与vip3A基因连接构建了重组质粒pHVC20,然后电激转化至苏云金杆菌无晶体突变株CryB中进行了共表达,以单独表达Vip3A蛋白的CryB(pHPT3)作为对照菌株。Westernblot结果显示,Vip3A蛋白在CryB(pHVC20)菌株中的最大表达量约为在CryB(pHPT3)菌株的2倍,这可能是由于前者中的辅助蛋白P20增加了Vip3A表达量的缘故,晶体蛋白Cyt1A的存在对Vip3A的正常表达没有影响。生物测定结果表明,CryB(pHVC20)和CryB(pHPT3)菌株对斜纹夜蛾初孵幼虫的LC50值分别为10.62!g/ml和78!g/ml,前者的毒力比后者提高了6倍,这表明Cyt1A蛋白和Vip3A蛋白对目标昆虫的毒力可能存在着协同增效作用。

苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白Vip3的研究进展

为了更好地理解Vip3毒素的研究进展,从Vip3毒素的类型、理化特性、功能、杀虫机理以及应用研究等方面做了详细的综述。并指出,尽管Vip3毒素的研究取得了很大的进展,但是还有一些重要的问题在后续研究中亟待解决。

苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白Vip3A研究进展

营养期杀虫蛋白(Vegetative Insecticidal Proteins,VIP)Vip3A是苏云金芽胞杆菌(Bacillus thurigiensis,Bt)在营养生长对数中期开始分泌的一类杀虫蛋白,其广泛存在于Bt菌中,现已发现8类37种,在遗传上比较保守。与杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins,ICPs)相比,Vip3A蛋白具有热不稳定性,其杀虫机理与ICPs也不同,并且Vip3A蛋白与不同Bt杀虫晶体蛋白具有协同增效作用,这为筛选新的杀虫基因、构建特异高毒力工程菌和转基因抗虫植物以及杀虫分子机理等基础研究提供了新的思路。

苏云金芽孢杆菌新型营养期杀虫蛋白Vip3A研究

营养期杀虫蛋白(Vegetative Insecticidal Protein,Vip)Vip3A是苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)在营养生长对数中期分泌产生的一类新型杀虫蛋白。Vip3A广泛存在于Bt中,与晶体杀虫蛋白(InsecticidalCrystal Proteins,ICPs)没有任何同源性,不具有多样性,在遗传上比较保守。其N-端存在一趋化信号传导因子相似序列,C-端存在着纤维素结合结构域。Vip3A蛋白通过诱发细胞凋亡,最终导致细胞死亡,这与Btδ-内毒素的作用机理完全不同。本文主要对Vip3A杀虫蛋白的发现、特性及作用机理作一简要综述。

苏云金芽孢杆菌Vip3Aa10毒素结合肽的筛选及活性测定

【目的】Vip3A是由苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)在对数生长期产生并分泌到胞外的对鳞翅目昆虫有较广杀虫谱的毒素,其在敏感昆虫中肠上的结合受体尚未得到鉴定。利用噬菌体展示技术,论文试图从肽库中筛选到能与Vip3A毒素特异性结合的多肽,为研究Vip3A毒素的杀虫模式提供线索。【方法】将构建的p ET28a-Vip3Aa10表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后,用亲和纯化的方法制备Vip3Aa10,并用胰蛋白酶活化和离子交换层析进一步纯化。以活化的Vip3Aa10毒素为诱饵,经"吸附-洗脱-扩繁"4轮条件逐渐严格的淘选,从噬菌体随机肽库中筛选能特异性地与活化的Vip3Aa10结合的噬菌体。以筛选到的噬菌体基因组DNA为模板,经PCR扩增和测序,获得插入到噬菌体上的外源基因的序列,并推导出相应多肽的氨基酸序列。将化学合成的多肽与活化的Vip3Aa10一起与甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)刷状缘膜囊泡共育后,用免疫印迹方法检测多肽对活化的Vip3Aa10与BBMV结合的影响。将合成的多肽与活化的Vip3Aa10一起涂布在饲料表面,晾干后,每孔放1只1龄的甜菜夜蛾幼虫。6 d后统计昆虫死亡情况。【结果】在25℃条件下用IPTG诱导含p ET28a-Vip3Aa10质粒的大肠杆菌BL21(DE3)可以表达出可溶性的Vip3Aa10蛋白。经亲和纯化、胰蛋白酶活化以及离子交换层析后,可得到较纯的活化的Vip3Aa10。以活化的Vip3Aa10为诱饵,经过4轮条件逐渐严格的淘选,从十二肽库中筛选出9条多肽,其中3条多肽的丰度较高,分别命名为P12-1、P12-2和P12-3,从七肽库中筛选出5条多肽,其中1条多肽的丰度较高,命名为P7-1。结合试验和杀虫活性测定试验结果表明,P12-2和P7-1多肽能不同程度地抑制Vip3Aa10与甜菜夜蛾刷状缘膜囊泡的结合,以及抑制Vip3Aa10的杀虫活性。【结论】用噬菌体展示技术筛选的多肽P7-1能显著性地抑制Vip3Aa10与刷状缘膜囊泡的结合,可降低35%以上的Vip3Aa10的杀虫活性。

苏云金芽胞杆菌Vip3Aa11蛋白C端点突变对其杀虫活性的影响

为研究Vip3Aa11羧基端对其杀虫活性和敏感性的影响,本研究利用定点突变技术构建了Vip3Aa11的3个突变体S543N、D547E和T681V。经SDS-PAGE分析证实3个突变体蛋白均能在大肠杆菌中表达分子量约88 k D的目的蛋白,生物活性测定显示,与Vip3Aa11相比,突变体S543N对甜菜夜蛾Helicoverpa armigera的杀虫活性提高了5倍。突变体D547E对甜菜夜蛾杀虫活性显著降低。突变体S543N、D547E和T681V对棉铃虫Spodoptera exigua的杀虫活性无明显变化。说明Vip3Aa11 C端部分氨基酸的定点突变对其杀虫活性有影响,且对不同害虫的杀虫活性变化趋势不同。本研究比较了Vip3Aa11蛋白与突变蛋白之间杀虫活性的差异,为研究Vip3Aa类蛋白的结构和机理奠定基础。

新型Vip3-like蛋白的从头预测建模及其结构域分析

Vip3-like蛋白对小菜蛾等鳞翅目昆虫有杀虫活性,是苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白Vip3的同源蛋白.为建立Vip3-like三维结构的理论模型并对其结构域进行生物信息学分析,选择从头预测的方法对Vip3-like蛋白三维结构的理论模型进行预测分析.分析结果表明,Vip3-like蛋白由1个Vip3A-N超家族结构域和3个糖类结合结构域组成.与模式蛋白Vip3Aa相比,Vip3-like是一种分子量更大的蛋白质,且2种蛋白的表面静电势分布也存在差异.其Vip3A-N结构域仅由α螺旋和无规则卷曲组成,没有发现β折叠.3个糖类结合结构域主要由无规则卷曲和β折叠组成,仅存在1个α螺旋结构.结构域分析预示无规则卷曲和β折叠可能在Vip3-like和受体结合的过程中扮演着重要角色.通过比较分析,发现Vip3Aa和Vip3-like蛋白在三级结构上存在较大差异,仅仅在局部结构存在一定的相似性,Vip3-like可能并不属于Vip3Aa类蛋白家族而属于一种全新的Bt营养期杀虫蛋白质.

营养期杀虫蛋白Vip3类转基因抗虫作物的研发进展

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)产生的营养期杀虫蛋白Vip3是由5个结构域组成的四聚体,其N-端主要控制结构的稳定,C-端为潜在的特异性受体结合域,共有14个模式样本,超过110种蛋白。与晶体蛋白(crystal proteins, Cry蛋白)一样,Vip3经蛋白酶消化后的杀虫活性物质主要作用于昆虫的中肠组织,可通过与特异性受体的结合引起肠道穿孔或细胞溶解,从而导致昆虫死亡。由于Vip3与Cry蛋白具有不同的杀虫机制和很强的杀虫谱互补性,国内外多采取这2类基因叠加的策略来研发新型转基因抗虫作物。Vip3Aa转基因玉米和棉花已经在美国和巴西等国家商业化种植,成为治理草地贪夜蛾等靶标害虫对Cry蛋白产生抗性的主要手段。实验室的选择压汰选表明,多种靶标害虫也可对Vip3产生较高的抗性,田间监测已证实其抗性的存在。因此,对靶标害虫的抗性监测与治理对Vip3类转基因抗虫作物产业化具有重要意义。