Resistance Analysis of the Binary Insect-resistant Transgenic Soybean to Heliothis viriplaca

[Objective] The aim of the research was to analyze the resistance of binary insect-resistant transgenic soybean to Heliothis viriplaca.[Method]In this experiment, resistance analysis of the stabilized binary insect-resistant transgenic soybean to Heliothis viriplaca was conducted in lab and in field conditions.[Result] The results indicated that the leaves of insect-resistant transgenic soybeans T5-150 and T5-195 showed lighter damage than those of non-transgenic soybeans. Meanwhile, the Heliothis viriplaca larvae fed on leaves of these two transgenic soybeans were characterized by less leaf consumption, shortening survival day, slower development and less pupation.[Conclusion]It was concluded that insect-resistance of transgenic soybean to Heliothis viriplaca was increased dramatically and the research provided a reference for selecting binary insect-resistant transgenic soybean to Heliothis viriplaca.

苜蓿夜蛾人工饲养技术

在 (2 6± 1)℃、光周期 14∶ 10 (光照∶黑暗 )、相对湿度 5 0 %～ 75 %的人工气候箱中 ,用以黄豆、小麦、酵母粉为主要原料 ,配以蔗糖、琼脂、山梨酸、对羟基苯甲酸甲酯 (尼泊金 )、维生素 C、复合维生素液、KOH液、乙酸液、甲醛液配制成的人工饲料饲养各虫态苜蓿夜蛾 ,连续饲养 17代 ,单雌产卵量、孵化率、幼虫成活率、幼虫期、蛹期、蛹重、化蛹率和羽化率等未出现退化现象。成虫补充糖分加复合维生素等营养成分 。

诱导因子对苜蓿夜蛾和大豆食心虫嗅觉与产卵选择的影响

测定了苜蓿夜蛾和大豆食心虫对昆虫取食等诱导处理的大豆植株的嗅觉反应与产卵选择。结果表明:食性范围不同的2种昆虫对诱导大豆产生了相似的行为反应,喷施1mmol/L和10mmol/L茉莉酸甲酯、10mmol/L水杨酸甲酯的大豆植株对2种昆虫的雌虫有明显的驱避作用,触角电位反应值明显高于对照植株,而雄虫嗅觉反应敏感性低于雌虫,作出驱避选择的数量也少于雌虫。1mmol/L水杨酸甲酯处理的植株有引诱作用,植株上2种昆虫的着卵量明显高于其他处理,与对照相当。

甲胺基阿维菌素对甜菜夜蛾、棉铃虫、粘虫和苜蓿夜蛾的活性研究

甲胺基阿维菌素对甜菜夜蛾、棉铃虫、粘虫和苜蓿夜蛾的致死中浓度分别为 0 384、0 0 4 8、0 0 73和 1 2 38μg/g。甲胺基阿维菌素对甜菜夜蛾、棉铃虫和粘虫的杀虫活力明显高于阿维菌素、高效氯氰菊酯和辛硫磷。甲胺基阿维菌素对棉铃虫的毒力高于粘虫 ,对上述两害虫的毒力又明显高于甜菜夜蛾和苜蓿夜蛾。甲胺基阿维菌素是防治甜菜夜蛾、棉铃虫和粘虫较高效的药剂 。

双价抗虫转基因大豆抗苜蓿夜蛾分析

苜蓿夜蛾是影响我国大豆生产的重要食叶性害虫之一。在实验室和网室人工接虫条件下,对已获得的遗传稳定的双价抗虫转基因大豆抗苜蓿夜蛾能力进行了分析。结果表明,与对照非转基因大豆相比,抗虫转基因大豆株系T5-150和T5-195的叶片损害程度明显减轻;同时,苜蓿夜蛾幼虫食叶量显著下降、存活天数缩短,发育变慢,蛹化数也显著降低。表明抗虫转基因大豆抗苜蓿夜蛾能力显著提高。

苜蓿夜蛾触角感器的扫描电镜观察

[目的]为了明确苜蓿夜蛾雌雄成虫触角和感觉器的外部形态特点。[方法]利用电子扫描显微镜,对苜蓿夜蛾雌雄成虫触角的形态特征、感觉器的类型、形态和分布特点进行扫描电镜观察,并且对雌蜂、雄蜂触角感觉器进行性别间差异进行比较。[结果]苜蓿夜蛾触角类型属于线状触角,由柄节、梗节和鞭节组成。触角上着生有毛形感器(STⅠ和STⅡ型)、刺形感器、腔锥形感器(SCOⅠ和SCOⅡ型)、耳形感器、鳞形感器、栓锥形感器、锥形感器和Bhm氏鬃毛。其中,仅雌雄虫触角上的耳形感器形态有所差异。触角感器主要分布于触角鞭节的迎风面和侧面,以毛形感器数量最多,刺形感器排列较整齐和规律,鞭节背风面有半包围状整齐排列的鳞片,鳞片结合处有零星分布的磷形感器、刺形感器。柄节和梗节周围被鳞片包被并分布着Bhm氏鬃毛感器。通过对雌雄触角感器的测量,发现雌雄虫大部分感器大小存在显著差异。[结论]苜蓿夜蛾触角属于线状触角,共有8种类型感器。除耳形感器外,其他触角感器雌雄间形态一致,而且雄虫触角感器明显比雌虫触角感器发达。

夜蛾科卵的分类（鳞翅目）（一）

本文记述了１２种夜蛾的卵。从不同方向的电镜像片显示出他们的形状和被用作分类的特征，包括精孔区的形态特征，纵脊和横道的状况，气孔的位置、形状和大小，小室的形状和表面结构。

苜蓿夜蛾hsp90基因cDNA序列的克隆与表达研究

热休克蛋白（heat shock proteins,HSPs）是生物体适应外界不良环境条件的关键蛋白。热休克蛋白90（HSP90）是HSP家族的重要成员。本试验以苜蓿夜蛾为材料提取虫体总RNA,利用RT-PCR和RACE技术,扩增得到hsp90基因全长cDNA序列,命名为Hvhsp90（GenBank登录号KF636495）。该序列含有2 472个碱基,包括一个2 154个碱基的开放阅读框,编码一个含717个氨基酸的蛋白,分子量约为82.5ku,等电点为4.97,且含有5个标签序列及胞质特征序列MEEVD,推导的氨基酸序列与鳞翅目其他昆虫HSP90相似性85%~99%之间。RTPCR结果表明,该基因在苜蓿夜蛾不同发育时期和不同组织均有mRNA水平的特异性表达。该基因在大肠杆菌表达系统中进行了诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,HvHSP90能够高效表达,并与预测的融合蛋白分子量相符。

苜蓿夜蛾中肠丝氨酸蛋白酶cDNA的克隆、序列分析及原核表达

【目的】本研究旨在从苜蓿夜蛾Heliothis viriplaca中肠克隆出丝氨酸蛋白酶（serine protease,SP）基因的cDNA序列,测定原核表达后的蛋白经纯化及复性后的活性。【方法】运用RT-PCR和cDNA末端快速扩增方法（rapid amplification of cDNA ends,RACE）克隆苜蓿夜蛾幼虫中肠丝氨酸蛋白酶cDNA全序列,用大肠杆菌Escherichia coli表达系统进行表达。重组蛋白经纯化后,利用梯度透析法进行复性,以BApNA为底物,进行活性测定。【结果】克隆获得的苜蓿夜蛾中肠丝氨酸蛋白酶基因命名为HvSP（GenBank登录号：JX866720）,该基因全长880 bp,开放阅读框长762 bp,编码254个氨基酸,推测分子量和pI值分别为26.9 kDa和9.49。由HvSP推导的氨基酸与鳞翅目昆虫SP氨基酸序列的一致性在52%~95%之间,其中与棉铃虫Helicoverpa armigera SP（GenBank登录号：CAA72962）的氨基酸序列一致性最高,达95%。成功构建重组载体pET21b-HvSP进行原核表达,Western-blot鉴定确定为目的蛋白。蛋白可溶性分析发现重组蛋白为包涵体。在Glycine-NaOH缓冲液中,当pH为10.0时,复性的重组蛋白活性达到最高,为35.74 U/mL。【结论】本研究在苜蓿夜蛾体内获得了一个新的丝氨酸蛋白酶基因,且原核表达后的重组蛋白经过变性、纯化及复性后具有活性。该结果为进一步研究丝氨酸蛋白酶在鳞翅目昆虫体内的生理功能奠定了基础。

苜蓿实夜蛾几丁质脱乙酰基酶基因cDNA序列的克隆与序列分析

几丁质脱乙酰基酶（CDA）在昆虫几丁质代谢中具有重要作用。本研究以苜蓿实夜蛾5龄幼虫虫体为材料提取总RNA，利用RT-PCR和RACE技术，扩增得到该虫CDA基因的cDNA序列。该序列含有1984个碱基，包括1个1626个碱基的开放阅读框，编码一个含541个氨基酸的蛋白，分子量约为61．86ku。克隆基因推导的氨基酸序列具有几丁质脱乙酰基酶典型的3个功能区，分别是几丁质结合区（47～103），催化区（199-355），低密度脂蛋白受体区（124～158）。序列比对表明，克隆的苜蓿实夜蛾CDA与其他昆虫的CDA在核苷酸和氨基酸水平上的一致性存在较大差异。苜蓿实夜蛾CDA的氨基酸序列与棉铃虫CDA（GQ411189）一致性达到98％，而与另外3种昆虫粉纹夜蛾CDA（AY966402）、蓓带夜蛾CDA（EU660852）和棉铃虫CDA（GQ411190＼GQ411191＼EF600051）氨基酸序列间的一致性只有36％～38％，属于两类CDA类群中的一类。基因的cDNA序列已经登录GenBank并获得登录号GU188855。

苜蓿夜蛾促前胸腺激素基因的克隆与原核表达

促前胸腺激素(Prothoracicotropic hormone,PTTH)是一类重要的昆虫激素,它对昆虫生长、蜕皮、变态、滞育具有重要调控作用。以苜蓿夜蛾5龄幼虫为材料提取总RNA,利用RT-PCR和RACE技术,扩增得到苜蓿夜蛾促前胸腺激素基因的cDNA序列,该序列含有823个碱基,包括1个681个碱基的开放阅读框,编码1个含226个氨基酸的蛋白,分子量约为26.3 kD,等电点为8.51。序列分析表明,苜蓿夜蛾PTTH的氨基酸序列与其他昆虫,尤其是鳞翅目夜蛾科昆虫的PTTH高度同源。获得的基因已登录GenBank,登录号为JF731347。利用原核表达载体pET21b在大肠杆菌中成功表达了苜蓿夜蛾PTTH基因,并用Ni-NTA亲和层析柱将带His-tag的目的蛋白进行纯化。

大豆叶片主要营养物质含量及对实夜蛾幼虫取食和发育历期的影响

在室内条件下研究了6个品种大豆叶片对实夜蛾幼虫取食和发育历期的影响,并检测了豆叶主要营养物质的含量。结果表明:不同大豆品种营养物质含量间差异显著,可溶性糖含量最高的品种是"吉育67",可溶性蛋白含量最高的是"吉农20"。幼虫在不同品种豆叶上的取食量和发育历期也存在差异,在"长农16"上取食量最大,为101.68 cm2,在"吉农20"上取食量最小,为65.17 cm2;在"长农16"上,发育历期最长为18.02 d,在"吉育55"上发育历期最短,为15.29 d。大豆叶片可溶性糖含量增加能刺激实夜蛾幼虫取食量增加,发育历期降低;可溶性蛋白含量增加可减少幼虫取食,发育历期延长。在供试品种中,"长农23"和"吉农20"对实夜蛾的抗性较强,表现为幼虫取食量较少。

苜蓿夜蛾保幼激素酯酶cDNA的克隆、序列分析及表达研究

【目的】研究苜蓿夜蛾Heliothis viriplaca保幼激素酯酶(Juvenile hormone esterase,JHE)的功能和作用机理。【方法】本试验提取苜蓿夜蛾的总RNA,并利用RT-PCR和RACE技术,扩增得到苜蓿夜蛾保幼激素酯酶基因的全长c DNA序列,命名为Hvjhe(Gen Bank登录号:JQ901384)。【结果】该基因含有3 106 bp,包括一个1 746 bp的开放阅读框,编码一个含581个氨基酸的多肽,分子量约为63.9 ku,多肽的等电点为5.11,且氨基酸序列具含有5个保幼激素酯酶特有的氨基酸保守模块。推导的氨基酸序列与烟芽夜蛾Heliothis virescens和棉铃虫Helicoverpa armigera中获得的保幼激素酯酶相似性较高,分别达到83%和82%。荧光定量PCR结果表明,该基因在苜蓿夜蛾不同发育时期和不同组织中都有m RNA水平的特异性表达,且在预蛹期表达量相对较高,取食期、蛹期期和成虫期表达量相对较低;在中肠和脂肪体内的表达量相对于其它组织较高。该基因在大肠杆菌Escherich coli表达系统中进行了诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,表达出与预测的蛋白分子量相符的融合蛋白。【结论】研究结果表明本试验获得了苜蓿夜蛾中一个新的保幼激素酯酶基因的c DNA序列。

苜蓿夜蛾葡萄糖氧化酶cDNA的克隆、表达及特性研究

【目的】从苜蓿夜蛾Heliothis viriplaca体内克隆葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase,GOX)基因cDNA序列,并进行原核表达及活性测定。同时对GOX在不同组织的特异表达及对葡萄糖诱导反应的特性进行研究。【方法】以苜蓿夜蛾为材料提取总RNA,利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术,扩增苜蓿夜蛾GOX基因全长cDNA序列。利用原核表达载体p ET-21b在大肠杆菌中表达苜蓿夜蛾的GOX基因,并用Ni-NTA亲和层析柱将带His-tag的目的蛋白进行纯化,再利用梯度透析法进行复性,以葡萄糖为底物进行酶的活性测定。同时利用Real-time PCR分析GOX的组织特异性表达和对葡萄糖的诱导反应。【结果】该cDNA序列有2 154个碱基,开放阅读框1 824个碱基,编码607个氨基酸组成的多肽,分子量为67.04 ku,多肽的等电点为5.13。该序列命名为Hv GOX,在Gen Bank的登录号为KT907054。序列分析表明,Hv GOX的氨基酸序列与其他昆虫的GOX氨基酸序列高度同源。该基因在大肠杆菌表达系统中成功地进行了诱导表达,表达出与预测的蛋白分子量相符的融合蛋白。由原核表达载体表达后的蛋白经过变性、纯化和复性后有活性。Real-time PCR结果表明,该基因在苜蓿夜蛾的不同组织均有m RNA水平的特异表达,其中在唾腺中的表达量最高;同时用0.01%、0.1%、1%和10%葡萄糖溶液浸泡的大豆叶喂食的幼虫,幼虫体内的GOX的表达均被诱导,且在10%的浓度时诱导表达量最高。【结论】本研究在苜蓿夜蛾体内获得一个新的葡萄糖氧化酶基因,该结果为进一步研究葡萄糖氧化酶在昆虫体内的生物功能奠定基础。

苜蓿夜蛾丝氨酸蛋白酶基因cDNA序列的克隆与原核表达研究

【目的】丝氨酸蛋白酶（Serine protease,SP）是以丝氨酸为活性中心的重要的蛋白水解酶。在昆虫中,丝氨酸蛋白酶参与消化、发育、先天免疫反应和组织重建等重要的生理过程。本试验以苜蓿夜蛾Heliothis viriplaca为材料,克隆其丝氨酸蛋白酶基因的cDNA序列,再对该基因进行原核表达并对表达产物进行活性测定研究。【方法】从苜蓿夜蛾中肠中提取总RNA,通过RT-PCR和RACE技术,扩增获得丝氨酸蛋白酶基因cDNA全长序列,用大肠杆菌E.coli表达系统进行表达;再对表达的重组蛋白进行变性、纯化与复性,并以BTEE为底物进行活性测定。【结果】克隆得到的苜蓿夜蛾中肠丝氨酸蛋白酶基因命名为Hv SP,该基因已登录Gen Bank,登录号为KT907053。该基因全长1 017 bp,开放阅读框为886 bp,编码295个氨基酸,分子量约为30.8 ku,等电点为8.27,推导的氨基酸序列与其他昆虫丝氨酸蛋白酶氨基酸序列相似性在46%-92%之间。在Tris-HCl缓冲液中,p H为8.5时,复性的重组蛋白活性最高,为28.7 U/m L。荧光定量PCR结果表明,Hv SP基因的m RNA在苜蓿夜蛾的多个组织中特异性表达,且在中肠中表达量最高,但在唾腺中未检测到Hv SP的m RNA表达。【结论】该研究克隆了一个新的苜蓿夜蛾丝氨酸蛋白酶基因的cDNA序列,且原核表达后的重组蛋白经过变性、纯化及复性后具有活性,为进一步探索丝氨酸蛋白酶在昆虫体内的生理生化功能奠定了基础。