N端B细胞表位缺失的兔出血症病毒VP60蛋白的表达及其免疫原性

本研究将A3C单抗识别的VP60蛋白NTA区域作为识别标记,设计一系列编码VP60 NTA区域重叠多肽的基因序列并连接于pGEX-4T-1载体,确定A3C单抗识别的精确表位。然后构建重组质粒Bacmid-VP60△A3C,将Bacmid-VP60△A3C转染Sf9昆虫细胞,得到重组杆状病毒rBac-VP60△A3C。RT-PCR、HA、IFA和Western Blot鉴定结果表明,重组蛋白VP60△A3C在Sf9细胞中高效表达,电镜观察显示其形态和结构与兔出血症病毒VP60蛋白类似。将重组蛋白VP60△A3C以每只200μg免疫2月龄RHDV血清阴性的新西兰兔,免疫后14 d,以兔出血症病毒WF株攻毒新西兰兔。结果表明,免疫组无死亡,而对照组全部死亡。本研究结果为制备表位缺失的兔出血症亚单位疫苗奠定了基础。

N端携带HBGAs受体结合表位的兔出血症病毒嵌合VP60蛋白的表达及其免疫原性

将HBGAs受体结合表位插入兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白VP60的N端,分析嵌合VP60蛋白的表达及病毒样颗粒(VLPs)形成情况,并研究N端HBGAs受体结合表位的插入对嵌合VP60蛋白免疫原性的影响。通过VP60蛋白N端起始位点HBGAs受体结合表位的插入,获得表位插入的VP60基因。利用Bac-to-Bac系统构建杆状病毒重组质粒,命名为Bacmid-VP60-CR,转染Sf9昆虫细胞后,得到重组杆状病毒rBac-VP60-CR,经HA、IFA和Western Blot鉴定,结果显示,重组蛋白VP60-CR在Sf 9昆虫细胞中得到高效表达,电镜观察显示其可形成与VP60类似的VLPs结构。将重组蛋白免疫2月龄RHDV血清阴性的新西兰兔,200μg/只,免疫后每周采血检测HBGAs表位抗体水平,同时在免疫后14 d,以RHDV WF株攻毒观察VP60-CR重组蛋白的免疫保护效果。结果显示,与VP60对照相比,VP60-CR蛋白可产生更高水平的针对HBGAs表位的抗体水平,且VP60-CR免疫兔可完全抵抗RHDV强毒的攻击。本研究构建了一种N端插入HBGAs受体结合表位的嵌合VP60蛋白,为研究高免疫原性兔出血症基因工程疫苗抗原奠定了基础。

兔出血症病毒和多杀巴氏杆菌嵌合蛋白VP60-Plp E的构建及其免疫原性鉴定

兔病毒性出血症(兔瘟)和兔巴氏杆菌病是对家兔危害最严重的两种疫病。用于防控这两种疫病的二联灭活疫苗存在着生产成本偏高问题。虽然基因工程亚单位疫苗的应用有助于提升二联苗的效力,但是生产成本依然偏高。本研究的目的是获得一种嵌合了巴氏杆菌保护性抗原PlpE的表位的兔出血症病毒VP60重组蛋白。首先通过Bepipred-2.0分析,确定PlpE的免疫显性区域主要位于N端。然后将编码PlpE26-45位、51-95位氨基酸序列的基因片段连接到VP60基因的5’端和3’端,并通过杆状病毒-昆虫细胞表达系统获得嵌合了PlpE表位的重组蛋白VP60-PlpE。血凝试验显示VP60-PlpE具有明显的血凝活性,提示重组蛋白仍然能够形成病毒样颗粒。Western blot实验结果表明VP60-PlpE与PlpE抗血清反应明显。小鼠免疫保护力实验表明VP60-PlpE对巴氏杆菌具有免疫保护力。家兔免疫保护力实验表明VP60-PlpE对兔出血症病毒和巴氏杆菌均具有免疫保护作用。总之,本研究成功构建出一种嵌合了巴氏杆菌保护性表位的兔出血症病毒VP60,为研制更低成本的兔病毒性出血症、兔巴氏杆菌病亚单位疫苗提供了基础。

兔出血症病毒2型SC株VP60蛋白特异性单克隆抗体的制备及鉴定

为了获得我国兔出血症病毒2型(RHDV2)SC株特异性单克隆抗体,研究以纯化RHDV2作为抗原免疫BALB/c小鼠,4次免疫后取脾细胞与SP2/0细胞融合,经间接ELISA方法筛选,获得一株能够稳定分泌RHDV2 VP60蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞,命名为6B3。经Western blot和间接免疫荧光试验验证,该单克隆抗体可识别RHDV2,不与RHDV1反应,具有良好的毒株特异性。亚型鉴定结果为IgG3,轻链为Kappa型,腹水ELISA效价为1∶80 000。本研究得到的针对RHDV2的特异性单抗,将对我国兔出血症的诊断及流行病学调查提供有效制剂。

兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因克隆与序列分析

自感染RHDV致死的兔肝脏组织中提纯病毒 ,提取病毒总RNA ,以RT_PCR方法扩增得到RHDVVP6 0基因全长片段 ,克隆到T载体中 ,经酶切分析及PCR鉴定后进行序列测定。同一毒株不同克隆产物进行 3次测序 ,测序结果已输送到GeenBank中 (注册号为AF45 376 1)。将测得序列与GeneBank中记录的RHDV不同分离株进行比较。比较结果表明 :各毒株间核苷酸的同源性为 91%～ 98% ,氨基酸同源性为 94%～ 99% ,氨基酸变异多发生在高变区 ,进一步证明了毒株的高度保守性 ,为明确我国RHDV地方株VP6 0蛋白的分子特征。

一株无血凝性兔出血症病毒的分离鉴定及其衣壳蛋白VP60基因的克隆和序列分析

从临床病料中分离鉴定出1株无血凝性的致病性兔出血症病毒（RHDV），命名为Yaan-1。HA试验测得该毒株原代及经兔体传3代后的肝毒在25℃、37℃和4℃时均无血凝性；但在琼脂扩散试验和对流免疫电泳中均可见分离株与常规RHDV高免血清形成清晰的沉淀线；电镜观察可见30nm左右的病毒粒子。采用RT-PCR方法将Yaan-1株的衣壳蛋白VP60基因进行了克隆测序，序列分析表明VP60基因序列全长1740bp，编码579个氨基酸，测序结果提交GenBank（注册号为DQ069280），并与世界各国的常规RHDV分离株进行比较，结果表明核苷酸同源性为90．0％～98．0％，氨基酸同源性为94．1％～99．0％，氨基酸变异多发生在衣壳蛋白C、E区；同时对Yaan-1株的分子量、等电点、疏水性、跨膜区等分子结构特征进行了分析。本研究首次报道了无血凝性RHDV中国分离株，丰富了地方毒株资源，为明确我国地方株的分子流行病学，以及对VP60蛋白分子特征研究提供了新材料。

兔出血症病毒VP60蛋白的原核表达及检测方法初步应用

VP60是免出血症病毒（RHDV）的主要结构蛋白，也是免疫原性蛋白，与诱导抗病毒免疫反应直接相关，因而也是检测用首选抗原。本实验在原核系统pPRoEX^TMHTa中表达了VP60基因，经SDS—PAGE电泳中可见表达带。Western blot鉴定结果表明，重组蛋白可被RHD阳性血清特异性识别，具有相应的抗原性。将表达蛋白经SDS—PAGE电泳切胶纯化后免疫BALB／c小鼠，免疫血清经全病毒ELISA检测，效价可达1：3200-1：6400，经琼脂扩散试验检测效价为1：16。重组蛋白纯化、复性后，作为包被抗原初步建立了间接ELISA方法，并检测了48份免血清样品，与全病毒间接ELSIA试剂盒检测结果相同。实验结果表明．用原核系统表达的VP60蛋白．可以作为RHD新型诊断试剂的候选抗原。

兔出血症病毒CD株衣壳蛋白(VP60)基因的克隆、核酸及氨基酸序列比较分析

以兔出血症病毒 CD株人工感染家兔 ,发病死亡后 ,取肝脏匀浆 ,用 Trizol试剂从匀浆上清中提取病毒 RNA。根据 Gen Bank已发表序列保守区设计并合成引物 ,采用 RT- PCR方法扩增了 RHDV衣壳蛋白 VP6 0基因。将所扩增片段克隆到 p MD18- T载体上 ,并进行了序列测定 ,测序结果表明 ,CD株 VP6 0基因全长 174 0 bp。该序列与已发表的其他分布于世界各地的 14株 RHDV序列进行了比较和基因进化树分析。无毒株与各强毒株之间的同源性为 85 .3%～86 .5 % ,强毒株间的同源性较高 ,为 92 .1%～ 10 0 %。根据进化树可把强毒株分为 2大群 ,一群为 CD株、Iowa2 0 0 0株、0 0 - 139株、99- 0 5株 ,其余的为另一群。进一步细分 ,还可以分为 4个亚群和 7个组。但毒株之间的地域性差异并不明显。同时根据 15株 RHDV VP6 0基因的核苷酸序列推导了其所编码的氨基酸序列 ,并进行氨基酸序列的比较和亲水性、柔性区、抗原性和表面结构的比较分析。结果显示 ,各毒株氨基酸之间的的同源性在 90 .5 %～ 10 0 %之间 ,其中无毒株与各强毒株之间的同源性为 90 .5 %～ 91.9% ,强毒株间的同源性在 95 %～ 10 0 %之间 ;氨基酸变异分析未发现突变造成的 VP6

兔病毒性出血症病毒YL株衣壳蛋白(VP60)基因的克隆和生物信息学分析

应用RT-PCR方法从兔出血症病毒(RHDV)西北分离株YL株中克隆出衣壳蛋白VP60基因并测序,YL株是中国西北地区首株被测序的RHDV,测序结果显示VP60基因全长1 740 bp,编码579个氨基酸,测序结果在GenBank中注册(登录号为DQ530363)。从GenBank下载全部已发表的40株RHDV序列,运用生物信息学软件分析,构建系统进化树和氨基酸序列同源性表,结果表明,世界不同地区RHDV分离株基因序列虽然非常保守,达到90%以上,但可以分为5个基因群,并且基因型和地域性没有必然联系,中国的分离株除了WX84株外,其它均处于第V基因群,该基因群内近年分离出的中国4个不同大地区(西北、华东、东北、西南)的RHDV毒株与NJ85株遗传距离很近,很可能都来自同一毒株NJ85。同时,对4个不同大地区的近年的4个代表性分离株的二级结构、抗原性进行了预测分析,结果显示二级结构有一定差异,但抗原性相同,这与RHDV只有一个血清型的看法相一致。

兔出血症病毒Yaan株衣壳蛋白VP60基因的克隆和序列分析

采用RT-PCR方法扩增兔出血症病毒(RHDV)Yaan株衣壳蛋白VP60基因,将扩增片段克隆到pMD 18-T载体上,经酶切及PCR鉴定后测序.结果显示,VP60基因全长1 740 bp,编码579个氨基酸.将Yaan株与其他RHDV分离株进行比较,结果显示,核苷酸同源性为90.5%～97.5%,氨基酸同源性为94.3%～99.5%,氨基酸变异多发生在衣壳蛋白C、E区,表明毒株具有高度保守性;同时对Yaan株与国外标准株AST/89的VP60蛋白氨基酸变异及其亲水性、柔性区、抗原区和表面结构进行了比较分析.

串叶松香草高效再生体系的建立与兔出血症病毒YL株外壳蛋白基因VP60对其遗传转化

通过对串叶松香草(Silphium perfoliatumL.)不同激素浓度配比的诱导分化实验,建立了串叶松香草离体培养高效再生体系,结果表明MS+6-BA(2.0mg/L)+NAA0.1(mg/L)培养基可高效诱导愈伤组织和芽的分化,1/2MS+IBA(0.1mg/L)培养基可快速诱导根的生成,形成再生植株。构建了植物表达载体pBI121-VP60,利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导叶盘法转化串叶松香草以研究高效的串叶松香草转化体系,结果显示以农杆菌LBA4404为介导菌株、以叶片为转化外植体、3d预培养时间和3～4d共培养时间、400mg/L羧苄青霉素和40mg/L卡那霉素筛选浓度转化效果较好,并已筛选到两株拟转基因植株,为利用串叶松香草生产兔出血症病毒动物可食用疫苗建立了初步的技术基础。

中国株兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因在大肠杆菌中的表达及其免疫原性鉴定

应用 RT- PCR技术扩增编码兔出血症病毒 (rabbit hem orrhagic disease virus,RHDV) WX84株衣壳蛋白 VP6 0基因 ,将 PCR产物按相应的阅读框架克隆到表达性载体 p GEX- 6 P- 1中谷胱甘肽转移酶 (GST)基因的下游。将重组质粒转化入大肠杆菌 BL2 1株 ,在 1.0 m mol/ L IPTG和 37℃的条件下诱导 ,VP6 0 - GST基因融合蛋白获了高效表达。经聚丙烯酰胺凝胶电泳和 Western- blotting试验证实所表达的融合蛋白产物相对分子质量与预期的 870 0 0相符。将表达产物经电泳切胶回收目的条带后免疫小鼠 ,所得抗血清应用间接 EL ISA检测 ,与 RHDV病毒粒子呈阳性反应。试验结果表明 ,大肠杆菌中表达的 RHDV VP6

兔出血症病毒YL株衣壳蛋白VP60基因在原核系统中的高效表达

为了在原核系统中高效表达兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白VP60,应用RT-PCR方法从兔出血症病毒(RHDV)西北分离株YL中克隆出了衣壳蛋白VP60基因并测序,结果显示,YL株VP60基因全长1740 bp,GC含量为55.3%,已在GenBank中注册(登录号为DQ530363),VP60基因与中国RHDV最早期分离株WX84的VP60基因核苷酸序列同源性为93.0%,氨基酸序列同源性为95.8%。构建成功YL株VP60基因原核表达载体VP60-pET32a,转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中。1 mmol/L IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测结果显示,VP60融合蛋白分子质量约为75 ku,其表达量占总菌体蛋白的39.8%。Western blot检测结果表明,VP60融合蛋白可以和RHDV抗血清发生特异反应。本研究结果显示,兔出血症病毒在干旱半干旱条件下的遗传变异和免疫学特征无较大变化。

兔出血症病毒ZB分离株VP60基因克隆、截短表达与活性鉴定

为分析兔出血症病毒地方分离株的变异情况，并获得活性良好的兔出血症病毒基因工程抗原，对兔出血症病毒ZB分离株的VP60基因进行了克隆、序列分析与原核表达。ZB株分离病毒与GenBank中的6株RHDVVP60基因的核苷酸序列同源性在92．5％～97．9％之间，参照ZB株分离病毒VP60基因序列，设计合成一对特异性引物，PCR扩增了876bp的VP60基因片段。将目的片段定向克隆至pET30a表达载体中，经鉴定正确后，重组质粒转化BL21表达菌，经IPTG诱导后获得了以包涵体形式表达的重组蛋白，重组蛋白纯化后，Westernblot检测表明具有良好的抗原性与特异性。

兔瘟病毒VP60蛋白原核表达及其应用

为获得活性良好的兔出血症病毒基因工程抗原,本研究对兔出血症病毒ZB分离株的VP60基因进行了原核表达与初步应用。参照ZB株分离病毒VP60基因序列,设计合成一对特异性引物,PCR扩增长876bp的VP60基因片段。将目的片段定向克隆至pET30a表达载体中,经鉴定正确后,重组质粒转化BL21表达菌,经IPTG诱导后获得了以包涵体形式表达的重组蛋白,重组蛋白纯化后,Western blot检测表明具有良好的抗原性与特异性,以该蛋白作为诊断抗原,初步建立了检测兔瘟病毒抗体的间接ELISA诊断方法。本研究为RHDV分子流行病学调查提供了参考,为VP60蛋白结构与功能研究、RHDV抗体检测试剂盒及新型疫苗的研制奠定基础。

VP60 loop区的突变对RHDV VLP功能的影响

[目的]从病毒样颗粒（VLP）的形成、血凝特性以及受体组织血型抗原（HBGA）结合特性方面,分析VP60 loop区在兔出血症病毒（RHDV）VLP功能中的作用。[方法]针对RHDV VP60蛋白的loop区411-417位氨基酸对应的基因设计引物,通过SOE法将411-417位氨基酸等量替换成柔性氨基酸GSGGSGG,获得重组基因VP60-411-417,利用杆状病毒表达系统获得重组病毒r Ac-VP60-411-417。将重组病毒接种Sf9细胞,通过IFA、SDS-PAGE和Western blot等方法证明嵌合蛋白P411-417的表达。通过负染透射电镜观察嵌合蛋白VLP的形成,利用血凝试验分析嵌合蛋白的血凝特性,利用合成多糖结合试验分析嵌合蛋白的受体结合特性。[结果]Western blot、IFA和负染透射电镜试验结果显示,嵌合蛋白P411-417得到有效表达,且能够形成完整的VLP;合成多糖结合试验结果显示,嵌合蛋白能够特异性结合HBGA,但其血凝特性消失。[结论]411-417位氨基酸的突变显著影响RHDV的血凝特性,不影响VLP的形成以及结合HBGA的能力,说明该区域是血凝特性的相关位点,但不是HBGA受体结合的关键位点。

兔出血症病毒VP60抗原优势区和Th细胞表位融合蛋白的原核表达及免疫效力测定

为检测兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白VP60两个抗原优势区串联通用Th细胞表位的融合蛋白AB-Th的免疫效力,本研究采用融合PCR的方法以pBL-RHDV为模板扩增AB-Th基因并亚克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,大量表达AB-Th融合蛋白。结果显示,融合蛋白以包涵体形式表达,并且具有良好的免疫原性。使用纯化后的融合蛋白免疫实验兔,并分别利用ELISA方法和MTS法检测兔免疫后的抗体水平和淋巴细胞增殖能力。结果表明该融合蛋白能够使兔产生针对RHDV VP60蛋白的特异性抗体和导致高水平的淋巴细胞增殖,并能够为实验兔提供100%的保护。

兔出血症病毒VP60基因在昆虫细胞中形成病毒样颗粒及其特性

目的将兔出血症病毒(RHDV)VP60全长基因在昆虫细胞-杆状病毒系统中表达,验证重组蛋白形成病毒样颗粒(VLPs)的能力及其生物学特性,探讨VLPs作为检测抗原及亚单位疫苗的潜力。方法用Bac-to-Bac系统体外表达RHDVVP60全长基因。以免疫荧光及Western blotting检测蛋白表达情况及确定蛋白最佳表达条件;免疫电镜观察VLPs形态,并对VLPs的血凝性、免疫原性进行检测。结果SDS-PAGE电泳分析表明,表达的重组蛋白分子量大小约为68KDa,在免疫荧光、琼脂扩散、ELISA试验中均与RHD多克隆抗血清特异性反应;接种重组病毒的Sf9细胞裂解液在电镜下可观察到与RHDV形态相似的VLPs;该VLPs可凝集人“O”、“B”型红细胞,凝集可被RHD多克隆抗血清所抑制;含VLPs的Sf9细胞裂解液可不经纯化用作间接ELISA抗原,所建立的ELISA方法与进口商品化试剂盒相比,特异性良好,敏感性、检出率稍低;将含VLPs的细胞裂解液加氟氏佐剂免疫兔,HI效价可达1∶40,可经受致死量病毒攻击。结论RHDV-VLPs的获得及其良好的免疫原性,为RHD血清学检测试剂的标准化、亚单位疫苗研制应用奠定基础,同时在转移载体及RHDV受体方面研究亦有潜在应用价值。

昆虫细胞表达兔出血症VP60蛋白间接ELISA方法建立及评价

采用Bac-to-Bac系统表达的兔出血症病毒（RHDV）结构蛋白VP60作为包被抗原,建立抗体检测间接ELISA方法,并对方法性能进行测定。试验以整合有VP60基因的重组杆状病毒接种Sf9昆虫细胞,感染细胞经裂解、离心初步纯化,作为包被抗原建立了检测RHD抗体的间接ELISA方法。经过对反应条件和试剂的优化选择,初步组装成间接ELISA试剂盒,并对其整体性能进行了评价。结果表明,含重组VP60蛋白的Sf9细胞裂解液最适包被稀释度为1：2000,换算为纯化VP60蛋白含量约为1.7μg·mL^-1;待检血清最适稀释度为1：100;羊抗兔IgGHRP标记抗体最适使用浓度为1：30000。初步组装的ELISA试剂盒检测RHD阴性血清无假阳性反应,与其他常见兔病阳性血清无交叉反应,特异性良好;敏感性高于RHDV全病毒间接ELISA和血凝抑制试验,低于进口间接ELISA试剂盒;试剂盒批内和批间变异率在10%以内。37℃加速破坏试验和4℃保存期试验结果表明试剂盒保存期可以稳定在6个月。该方法可应用于兔出血症抗体水平监测及实验兔等级检测中。

兔出血症病毒衣壳蛋白VP60与兔肝脏细胞中相互作用蛋白的初步筛选

为鉴定兔出血症病毒(RHDV)在感染兔肝脏过程中与肝细胞膜表面相互作用的靶蛋白,本研究利用SMART文库构建技术构建了兔肝脏细胞的真核表达cDNA重组质粒文库,将其转染SP2/0细胞,经嘌呤霉素筛选表达兔肝细胞蛋白的阳性SP2/0细胞。以RHDV-VP60蛋白作为固相包被抗原,经筛选,获得能够与VP60蛋白相互结合的表达性阳性SP2/0细胞克隆。测序表明26个克隆与兔的一些功能性蛋白有较高的同源性,其中包括代谢酶类13个、免疫信号通路受体蛋白5个以及其他细胞膜蛋白等。本研究鉴定的与RHDVVP60具有结合性的细胞蛋白为RHDV感染机制的研究奠定了基础。