儿童患者RhD弱阳性变异体的初步分析

目的对RhD弱阳性儿童患者进行RhD变异体检测分析。方法用微柱凝胶血型鉴定卡及盐水试管法进行RhD血型初筛;微柱凝胶抗球法进行弱D确认试验;确认试验RhD弱阳性者进行PCR-SSP及RHD外显子测序分析。结果 RhD初筛阴性46例(0.38%),确认实验检出弱阳性4例(8.7%);4例RhD弱阳性标本经基因检测,1例1227A杂合子(Del型),1例DⅢa型,2例弱D15型。结论 Del型也可能被血清学方法检出;RhD弱阳性患者中抗原数量减少者较多;针对RhD阳性红细胞是否产生需进一步研究。

2493例RhD阴性献血者的基因分析及4个新RHD等位基因的鉴定

目的研究中国汉族人群RHD等位基因多态性和分子机制。方法2008年1月-2011年9月，对2493例初筛为RH阴性的无偿献血者，采用单克隆抗体鉴定RhD／C／c／E／＇e抗原，D抗原鉴定同时采用间接抗球蛋白法；采用PCR·SSP方法测出d／d、D／d、DEL／d型，再用商用RHD基因检测试剂盒鉴定D／d型的样本中的弱D—15、RHD．CE（2-9）-D、DVI-Ⅲ和Dva型；对于排除前述基因型的样本，对其RHD基因10个外显子序列进行测序比对分析。结果2493例中，有1686名为R／／D基因完全缺失（0／O），占67．6％，其它808名检出有RHD基因：其中20．7％（516／2493）为DEL型（RHD1227G〉A／a），RHD—CE（2-9）-D／d为最常见的融合基因型，占6．5％（163／2493），其次为DⅥ·nl（RHD—CE（3-6）-D／d），占1．2％（31／2493），弱D15型为常见的弱D型，共检出62例（2．5％）；发现的4个新等位基因，分别是RHO78delC／d、RHD520G〉A＋1080dellO／dRHD、438G〉C／d和RHD101A〉G／d。结论汉族人群RHD等位基因多态性与高加索人群存在差异，有丰富的类型和不同分子机制。

RHD1227A型弱D的D抗原表位分析

目的分析携带RHD1227A等位基因的Rh血型弱D型个体的红细胞D抗原表位。方法采用常规血清学方法检测Rh血型D、C、c、E和e抗原表型,间接抗人球蛋白试验(IAT)确认D抗原,序列特异性引物-聚合酶链反应(PCR-SSP)测定RHD基因,并检测RHD杂合型。对确认的弱D型,使用12种抗-D抗原不同表位的单克隆抗体,分析红细胞D抗原表位。结果血清学筛选和PCR-SSP检测鉴定出3例携带RHD1227A等位基因的弱D型样本,Rh小因子均为C+c+E-e+,RHD合子型鉴定均为RHD+/RHD-杂合型,提示3例个体基因型为CDe/cde。3例个体红细胞D抗原表位分析显示均具有基本完整D抗原表位,与Rh(D)阳性对照样本相同。结论发现3例RHD1227A型弱D型;不管RHD1227A等位基因表达DEL型或弱D型,其D抗原表位近似,均表达基本完整D抗原,提示该等位基因不同量的表达可能与其它调节因素有关。

3例弱D表型献血者的RhD抗原表位和分子机制研究

目的研究3例RhD抗原表型为弱D型54的献血者的RhD抗原表位和分子机制。方法采用常规试剂对3例弱D型54样本进行Rh分型,并采用D-screen分析样本的RhD抗原表位。对RHD基因全部外显子测序并分析RHD基因杂合性。使用Robetta服务器进行模型构建。结果 2例样本仅检出365C>T突变,1例样本检出365C>T杂合突变和1 227G>A杂合突变。经D-screen中全部抗体检测的2例样本表现出与部分D表型中DVII相同的D抗原表位分布,另1例未经D-screen全部抗体检测的样本与DVII的D抗原表位分布类似。同源建模分析显示弱D型54的胞内S122L突变也可能影响D抗原胞外区的蛋白结构。结论首次在中国人中报道了弱D型54,并首次分析了该表型的D抗原表位组成。弱D型54具有部分D表型的特征,可能引起同种免疫。

血清学检测柳州地区RhD初筛阴性献血者D变异体结果分析

目的研究柳州地区RhD初筛阴性献血者D变异体分布。方法 425例经盐水法初筛为RhD阴性献血者标本采用IAT试验确认弱D,对IAT阴性的血样进一步采用吸收放散试验检测Del型和真实D阴性。采用单克隆Ig M抗-C,c,E和e血清以盐水法检测Rh表型。参照文献方法计算RhD阴性献血者Rh基因频率、单体型频率和Rh表型期望值,并进行Hardy-Weinberg吻合度检验。结果 425例RhD初筛阴性献血者中共检出D变异体99例(23.29%),其中弱D18例(4.24%),Del型81例(19.05%);确认真实D阴性326例(76.71%)。18例弱D表型分布:Ccee 9例(50.00%)>CCee 4例(22.22%)>cc Ee 3例(16.67%)>CCEe 1例(5.56%)=ccee 1例(5.56%)。81例Del型表型分布:Ccee 47例(58.03%)>CCee 17例(20.99%)>ccee 11例(13.58%)>cc Ee 5例(6.17%)>cc EE 1例(1.23%)。326例真实D阴性表型分布:ccee 199例(61.04%)>Ccee 83例(25.46%)>CCee 22例(6.75%)>cc Ee 16例(4.91%)>cc EE 3例(0.92%)>Cc Ee 2例(0.61%)>CCEe 1例(0.31%)。本文Rh表型的观察值与期望值差异无统计学意义(P>0.05),Hardy-Weinberg吻合度检验良好。单体型频率特点:cde(0.696 7)>Cde(0.261 6)>cd E(0.0417)>Cd E(0.000 0)。基因频率特点:c(0.739 5)>C(0.260 5),e(0.960 7)>E(0.039 3)。结论柳州地区RhD初筛阴性献血者D变异体检出率较高,将弱D和Del型献血者认定为RhD阳性,可提高临床输血安全性。

D抗原阳性个体及无效等位基因携带者RHD基因数目测定

目的 测定Rh血型D抗原阳性个体的RHD基因数目。方法 采用聚合酶链式反应 限制性片段长度多态性 (PCR RFLP)技术 ,扩增 10名D阳性、5名弱D、2 5名Del表型和 12名携带无效等位基因的Rh阴性个体的RH基因座位下游盒子和融合盒子序列 ,产物经DNA限制性内切酶PstI消化后电泳 ,以 5份经血清学和序列分析基因分型方法确认的D阴性样本作为RHD-/RHD-纯合子对照 ,鉴定RHD+ /RHD+ 或RHD+ /RHD-基因型。结果 10名D阳性个体均为RHD+ /RHD+ 纯合子、5份弱D样本及 12名携带无效等位基因的Rh阴性个体全部为RHD+ /RHD-杂合型。 2 5名Del表型个体中 9人为RHD+ /RHD+ 纯合型 (36 % ) ,其中 6人Rh表型为DCCee、3人为DCcee ;另 16名Del个体为RHD+ /RHD-杂合型 ,Rh表型均为DCcee。结论 D阳性个体RHD+ /RHD+ 纯合型多见 ,弱D型个体以RHD+ /RHD-杂合型为主 ,在Del表型个体存在高比率的RHD+ /RHD+ 纯合型 ;携带无效等位基因的个体多为RHD+

流式细胞术检测不同RhD血清型红细胞RhD抗原的表达

本研究旨在建立流式细胞术(FCM)检测红细胞表面RhD抗原的实验方法,并研究不同RhD血清型红细胞表面D抗原表达的差异。选取标准的RhD(+)和RhD(-)细胞按1∶1比例混合,用间接标记法[一抗为IgG抗-D,二抗为FITC-抗-IgG F(ab′)2]染色,应用FCM检测RhD(+)细胞的比例,并确立IgG抗-D的最佳使用稀释度。采用FCM检测RhD阳性、弱D型、RhDel型、RhD阴性红细胞表面D抗原数量。结果显示,IgG抗-D单克隆抗体的最佳使用稀释度是1∶4,1×106/50μl。RhD阳性、弱D型、RhDel型、RhD阴性者RhD(+)红细胞百分率分别为(96.8±2.97)%、(79.5±9.88)%、(47.8±11.43)%、(3.7±2.96)%,红细胞表面D抗原平均荧光强度依次为33.3±6.21道、18.6±5.39道、7.10±1.17道、0.79±0.55道。结论:4种不同血清表现型的RhD抗原数量的差异有显著性,以RhD阳性的抗原数量最多,弱D型次之,RhDel型最少。

不同方法筛查RhD弱表达变异体

目的研究不同检验方法在RhD弱表达变异体中的应用范围及相互之间的关系。方法应用酶介质法和间接抗球蛋白试验(indirect antiglobulin test,IAT)在盐水凝集法初筛出的RhD阴性个体中进一步筛查弱D/部分D,然后在IAT确认的RhD阴性个体中采用吸收放散试验筛查DEL型。结果 278例RhD阴性个体酶介质法和IAT分别筛查出13和15例弱D/部分D,吸收放散试验筛查出64例DEL型。结论在这几种RhD弱表达变异体筛查方法中,盐水凝集法不能筛查RhD弱表达变异体,只能筛查正常表达的RhD抗原;酶介质法和IAT可以筛查弱D/部分D,酶介质法比IAT少检出两例(P>0.05),但得出酶介质法不如IAT敏感的结论尚早,有待于大样本的进一步研究;在IAT确认的RhD阴性个体中,若采用更为敏感的吸收放散试验,仍有部分个体RhD抗原检测为阳性。

广东省中山地区临床初检RhD阴性人群中D变异体分布及特征分析

目的研究分析中山地区初检RhD阴性人群中D变异体血清学和基因分型特征。方法研究共收集2017年12月~2019年2月中山市人民医院门诊及住院病人的血液样本24286例,采用微柱凝胶卡法对其中RhD阴性样本进行初筛;再经间接抗人球蛋白试验(indirect antiglobulin test,IAT)确认弱D或部分D变异型;然后用吸收放散试验对剩余样本进行Del表型筛选。同时,通过聚合酶链反应-序列特异性引物(polymerase chain reaction-sequence specific primmer,PCR-SSP)技术对初筛RhD阴性的样本进行RHD等位基因分型以及血清学方法对初筛阴性样本进行C,c,E和e抗原表型的检测。结果在24286例血液样本中初筛共检出102例阴性样本,中山地区初检阴性比例约为0.42%。经IAT确认试验共鉴定出7例弱D或部分D血液样本(6.86%),且基因型表现多样,但未见亚洲地区常见的弱D15和弱D12表型。接下来的放散试验检测出25例Del型,通过PCR-SSP基因分型技术又检出3例漏检的Del型,Del型在初检阴性样本中占比27.45%,PCR-SSP结果显示该研究中所有Del型血液样本等位基因均为RHD1227A。该研究纳入的102例初检阴性血液样本的RhCcEe表型分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡(χ^(2)=2.625,P>0.05),表示相应等位基因所占比例在遗传中保持不变。在Del型变异体中,除Ccee和CCee表型外,未见其他表型。结论中山地区人群RhD变异体有丰富的类型和不同分子机制,其中Del型占比较高,血清学与基因分型结合可提高D变异体的鉴定能力,防止漏检情况的发生。

189例RhD血清学初筛阴性个体基因多态性研究

目的了解血清学RhD阴性个体基因的多态性及其发生机制。方法从2015年1月-2018年8月本实验室收集经单克隆IgM-抗-D初筛RhD阴性的189(人)份送检标本,采用间接抗球蛋白法及单克隆IgG-抗-D吸收放散方法鉴定其D抗原;采用PCR-SSP方法做中国人常见RHD基因分型,并对其RHD基因10个外显子序列做比对分析。结果本组初筛RhD阴性个体中,具有RHD基因者的比例为32.8%(62/189),完全缺失RHD基因(d/d)者为67.2%(127/189);62名具有RHD基因者:D^el型(RHD1227G>A/d)占66.1%(41/62),融合型占25.8%(16/62),包括DⅥ^Ⅲ[RHD-RHCE(3-6)-RHD/d]9例、DⅤ^Ⅱ[RHD-RHCE(5)-RHD/d)3例、RHD-RHCE(3-9)-RHD]2例、DBT-1[RHD-RHCE(5-7)-RHD/d及RHD-RHCE(3-8)-RHD各1]2例,弱D型占8.1%(5/62),含1例弱D15型[RHD(845G>A)/d]。结论弄清RhD阴性献血者和患者个体基因的结构特点,为临床安全输血提供重要依据。

湖北荆门地区RhD阴性无偿献血者表型分布调查

目的 了解湖北荆门地区无偿献血者中RhD阴性表型分布情况.方法 常规血清学方法初筛RhD阴性标本,用间接抗球蛋白试验确认弱D,用吸收放散试验检测Del,RhC,c,E和e抗原使用血清学方法进行检测.结果 38 921名无偿献血者中初筛为RhD阴性124例;用抗人球蛋白试验确认弱D 11例;除11例弱D和10例假阴性后,103例确认为Rh阴性标本中共检出Del型25例;103例确认为Rh阴性的标本,血清学表型分布为dccee 63例,dCcee 28例,dCCee 6例,dccEe 4例,dccEE 1例,dCcEe 1例.结论 湖北荆门地区RhD阴性献血者中存在相当比例人群携带弱D表达抗原,为确保临床用血的安全,应加强弱D或Del型的确认.

在中国人群中首次发现1例Rh血型弱D12型

目的分析鉴定1名RhD抗原弱阳性个体的血型血清学表型及分子背景。方法采用常规血型血清学技术检测Rh D、C、c、E、e抗原表型;采用序列特异性引物-聚合酶链反应(SSP-PCR)方法同时检测RHD基因和RHCE基因,并测序分析RHD基因全长编码区序列;同时通过特异性PCR技术测定RHD合子型或RHD基因数目。结果血型血清学试验证实该标本为D抗原弱阳性表型,与相应Rh抗血清反应为C-c+E+e+;SSP-PCR检测显示RhCcEe基因定型结果与血型血清学完全一致,且有完整的RHD基因;但RHD基因全长编码区序列分析发现该标本的RHD第6外显子存在1处碱基突变:830G>A,编码区序列其它部分与正常RHD序列相同;RHD杂合性试验鉴定显示为RHD+/RHD-杂合型,推测该个体基因型可能为DcE/dce。结论对照国内外文献报道和GenBank记录的基因序列,该个例为在中国人群中首次发现的弱D12型。

中国人中发现2种新的弱D型

目的鉴定并确认在中国人中发现的2种新的弱D型。方法对2份从上海市血液中心无偿献血者血样中筛查出的RhD抗原减弱的标本,采用常规Rh分型试剂对其作血清学分型,使用D-screen试剂盒分析其RhD抗原表位;对RHD基因全部外显子测序并分析杂合性,使用PCR-SSP方法对新的弱D型作基因分型。结果在2名弱D型献血者中分别发现2种新RHD等位基因:RHD(R10P)和RHD(A414V);D抗原表位分析结果与弱D表型相一致。建立了测定新等位基因的PCR-SSP检测方法。结论在中国人群中发现了2种新的弱D型,初步阐明了这2种弱D表型的分子机制。

福州地区献血人群Rh血型分布特征的调查分析

目的调查福州地区无偿献血者Rh血型各表型的分布特征,建立Rh血型献血者资料库。方法采用血型血清学方法对福州地区2010年1月至2017年12月的313 210名初次献血者进行RhD初筛,初筛阴性者再进行RhD阴性确认和表型检测;抽取13 015名RhD阳性无偿献血者进行表型检测,并建立Rh血型系统表型数据库。结果 313 210名献血者确认RhD阴性1 208人,D变异型30人,RhD阴性血型抗原表型以dccee(53.56%)和dCcee(34.35%)居多,其次为dCCee(7.03%)和dccEe(3.39%),发现稀有表型dCCEE 1人;RhD阳性献血者各表型中DCCee比例最高(45.50%),其后依次为DCcEe(34.17%)、DCcee(8.89%)和DccEE(6.57%),发现DCCEE表型2人。C和E抗原阳性率在RhD阳性和阴性献血人群的分布差异有统计学意义(P<0.01)。结论福州地区无偿献血者Rh血型血清学具有多种表型,RhD阴性献血者以dccee表型为主,RhD阳性献血者以DCCee表型为主;发现Rh血型系统稀有表型dCCEE 1人,DCCEE 2人。通过研究无偿献血人群Rh血型分布,建立本地区Rh血型表型数据库,对保证合理用血及特殊血型患者的安全输血具有重要的临床意义。

中国人群中发现的主要弱D型——弱D15个体的分子背景研究

为了探讨中国汉族人群弱D15型个体的Rh血型系统血型血清学表型及分子背景,采用常规血型血清学技术检测RhD抗原弱阳性个体RhD、C、c、E、e抗原表型;采用序列特异性引物-聚合酶链反应(SSP-PCR)方法同时检测RHD基因和RHCE基因;标本测序分析RHD基因全长编码区序列;同时通过特异性PCR技术测定RHD合子型或RHD基因数目。结果表明,血型血清学试验证实为D抗原弱阳性表型的人群中,有18例为弱D15型(占D抗原弱阳性表型56%),RHD基因全长编码区序列分析发现其第6外显子有一处碱基突变:845G>A,编码区序列其它部分与正常RHD序列相同;检测Rh小因子有3种表型CcEe(2例)、CcEe(2例)、ccEe(14例),分别占弱D15型的11%、11%、78%,血清学检测结果与分子生物学检测结果一致。RHD杂合性试验鉴定显示仅表型为CcEe的2例标本为纯合型RHD+/RHD+,提示基因型为DCe/DcE;其余为杂合型RHD+/RHD-,提示基因型分别是DCe/dce和DcE/dce。结论:弱D15型是中国人群中最主要的弱D型,其中大部分为杂合型。

Rh部分D基因型分析

目的研究7例Rh部分D样本的基因分型。方法采用PCR-SSP技术检测常规血清学试验为D变异型的样本中的Rh部分D进行D基因分型。结果在30例常规血清学试验中,23例具有完整的RHD基因外显子(Rh弱D型),7例部分外显子缺失,为Rh部分D,23例为弱D型,并对部分D样本进行了基因分型,4例检测为D Cat.ⅥⅢ,1例为D Cat.Ⅵtype2,1例为D Cat.Ⅵtype 1,1例为基因2.9外显子融合,表示为RHD-CE(2-9)-D。结论 Rh部分D型与弱D型在血清学试验中无法区分,采用分子生物学方法才能够更准确的分型,更能确保输血安全。

Rh血型弱D和DEL表型的基因突变分析

目的研究Rh血型弱D和DEL表型的基因突变基础。方法用间接抗人球蛋白方法(IAT)和吸收放散的血清学方法鉴定弱D表型和DEL表型,然后用RHD基因特异的聚合酶链反应-序列特异性(PCR-SSP)和序列分析方法鉴定Rh血型弱D和DEL表型RHD基因的外显子中可能存在的变异。结果 Rh血型弱D表型个体的第6外显子有845G>A突变,Rh DEL表型个体的第9外显子有1227G>A突变。结论所应用的RHD基因测序方法可以用于弱D和DEL表型分子基础的研究,并为发现新的D变异表型和新的RHD等位基因奠定基础。

华北地区汉族人群Rh(D)抗原弱表现型个体的分子遗传机制研究

目的探讨汉族人群非血缘关系Rh(D)抗原弱阳性个体的血清学表型及分子遗传机制。方法采用常规血清学技术从非血缘关系随机献血者中筛检Rh(D)抗原弱阳性个体(包括弱D型、部分D型),对其进行Rh D、C、c、E、e抗原表型的检测;采用序列特异性引物-聚合酶链反应(PCR-SSP)方法同时检测其RHD基因和RHCE基因;测序分析RHD基因全长编码区序列;同时通过特异性PCR技术测定其RHD合子型。结果血清学试验证实为D抗原弱阳性表型的有32例个体,占无关供者人群比率为0.015%,其中18例个体为弱D15型(845G>A),1例为弱D12型(830G>A),1例为携带DEL等位基因(1227G>A)的弱D型,8例为部分D表型中的DⅥⅢ型(RHD-CE(3-6)-D),1例为部分D表型中的DⅤa(Hus)(RHD-CE(5)-D),3例标本10个外显子检测均未见异常。Rh小因子检测有3种表型CcEe(4例)、Ccee(10例)、ccEe(18例),其血清学与分子生物学检测一致。RHD杂合性试验鉴定显示仅4例标本为纯合型RHD+/RHD+,其余为杂合型RHD+/RHD-。结论汉族人群D抗原弱阳性比率明显少于高加索人,汉族人群D弱表现型中,弱D15型频率最高;部分D的弱表现型中,DⅥⅢ型占主要比例。

初筛Rh(D)阴性无缘献血者弱D和Del表型调查

目的:了解Rh(D)阴性献血者中弱D和Del表型的分布情况。方法:对初筛Rh(D)阴性无亲缘关系献血者采用间接抗球蛋白试验检测弱D型,采用吸收放散法检测Del型。结果:在409例盐水法初筛为Rh(D)阴性无亲缘关系献血者中,检出弱D表型27例,占6.61%,Del表型61例,占14.91%,确证Rh(D)阴性321例,占78.48%。在确证Rh(D)阴性献血者中ccee占49.14%,其次是Ccee,占23.47%;弱D表型中cc Ee占4.16%,其次是Ccee,占1.71%;Del表型中Ccee占10.02%,CCee占1.71%。结论:对初筛Rh(D)阴性的献血者应采用更为敏感的试验确证是否为弱D表型或Del表型。为保障输血安全,弱D表型和Del表型献血者应作Rh D阳性看待,而作为受血者则应视为Rh D阴性。

弱D25变异型血型抗原表位分析及输血策略探讨

目的对1例输注阳性血液的D变异型患者进行Rh血型血清学及分子生物学鉴定,并对其进行不规则抗体检测,探讨该D变异型的输血策略。方法采集患者标本,用2种不同的单克隆抗-D试剂鉴定D抗原,并用试剂盒检测D变异体抗原表位,Rh CE抗原分型,红细胞直接抗球蛋白试验,不规则抗体筛查;采用多重链接酶依赖的探针扩增（MLPA）方法检测RHD及RHCE基因型,对于MLPA检测不到的RHD突变型等位基因,对RHD基因全部10个外显子进行PCR扩增及产物直接测序分析。结果该患者初步D抗原鉴定结果显示为D抗原弱表达,且直接抗球蛋白试验阴性;D抗原表位检测结果显示其红细胞与D抗原ep D5.4、ep D2.1和ep D3.1表位特异性单克隆抗体产生弱凝集反应,与其余表位抗体均无凝集反应,大量输注D阳性血液后的168 d及232 d抗体筛查结果均为阴性;Rh CE抗原分型为cc Ee,MLPA结果显示其基因型为RHD/d,RHCE基因MLPA基因分型结果与血清学表型一致;RHD基因外显子直接测序发现其第3外显子携带纯合的c.341G〉A（p.Arg114Gln）错义突变。结论患者为弱D25变异型,对弱D25型的D抗原进行表位分析的显示其部分抗原表位缺失。该患者大量输注阳性血液后未产生抗-D,为制定该血型患者的临床输血策略提供数据。