疯牛病和羊痒病Western blotting检测方法的建立

以朊蛋白单抗AH6和碱性磷酸酶标记的马抗鼠酶标二抗建立了疯牛病和羊痒病的Western blotting检测方法。对Western blotting各种反应条件进行摸索,并确定了最佳工作条件,结果表明:匀浆缓冲液为RIPA时的最佳反应条件包括浓缩胶电泳电压为恒压90V,分离胶电泳电压为恒压160V,转印的最佳电压和时间为恒压100V1.5h;封闭液为3%BSA时,封闭15min,封闭效果最好;AH6的最佳稀释度为1∶4000,4℃下孵育过夜,马抗鼠二抗的最佳稀释度1∶1000,室温下孵育30min。采用已确立的反应条件对样品进行检测并与Prionics-Check WEST-ERN进口试剂盒的检测结果比较,发现其敏感性为100%,特异性为99.4%,与进口试剂盒(100%,100%)无显著差异,这为国产试剂盒研制提供了条件。

拟南芥DBB1a(double B-box 1a)蛋白的表达、纯化及Western blotting检测

PCR扩增拟南芥(Arabidopsis thaliana)DBB1a cDNA的保守区段(GenBank登录号:AT2G21320),转化到冷诱导表达载体pCold TF上,构建pCold-DBB1a重组质粒,转化大肠杆菌DH5a。15℃下IPTG诱导表达融合蛋白,并通过SDS-PAGE检测。证实目的蛋白以可溶形式在约20 kD处高效表达,与预期蛋白大小相吻合。表达蛋白经Ni琼脂糖凝胶亲和层析纯化,SDS-PAGE及Western blotting检测证实纯化后获得高纯度融合蛋白,这为进一步研究DBBl a功能奠定了基础。

快慢转法及不同滤膜和显色检测法在Western blotting中的应用分析

目的探讨快、慢转法及不同滤膜和显色检测法在Western blotting中的应用及各实验环节分析。方法采用MDA-MB-231细胞制备细胞蛋白,应用不同印迹膜[硝酸纤维素膜、聚偏乙烯二氟(PVDF)膜和阳离子尼龙膜]分别采用快转法和慢转法进行增强化学发光法(ECL)和DAB化学显色法检测,并对Western blotting的各实验环节进行了分析。结果(1)在快、慢转法中硝纤膜的蛋白预染marker条带略强于尼龙膜,而尼龙膜又略强于PVDF膜;PVDF膜和尼龙膜的正反面易于混淆,而硝纤膜的正反面不易混淆。(2)在快、慢转法中,PVDF膜的DAB化学显色法图像略强于尼龙膜和硝纤膜,而尼龙膜和硝纤膜无明显差异;与慢转法相比,快转的硝纤膜和尼龙膜中的蛋白条带略呈波浪状。(3)在慢转法中三种膜化学发光法的图像无明显背景,但在快转法中尼龙膜的背景较明显,而硝纤膜和PVDF膜亦无明显背景。结论应根据实验需要选用不同的印迹膜;慢转法通常优于快转法,增强化学发光法优于DAB化学显色法;增强化学发光法特异胜强、灵敏度高,是分析蛋白质表达较为理想的方法。

采用Western blotting的方法分析蚕蛹致敏原成份

目的 应用Western blotting的方法检测蚕蛹（silkworm chrysalis）浸出液中致敏原的成份，为蚕蛹致敏原的研究和临床诊断提供依据。方法取蚕蛹浸出液，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离，再转印到PVDF膜上，封闭后将血清与膜条共同孵育，后与辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgE抗体反应，显色底物用对氨基联苯胺。结果SDS-PAGE显示蚕蛹可辨条带有12条，分子量在14～94kD之间，其中主带有8条，分子量依次为80kD、68kD、62kD、50kD、29kD、23KD、18kD、16kD。Western blotting结果表明，22例蚕蛹过敏患者血清全部呈阳性反应，浸出液中共有6条致敏条带，其中分子量68kD和29kD是主要致敏组份，阳性反应率均为100％。结论蚕蛹分子量68KD和29kD的组份为主要致敏组份，结果可为开发适舍我国特色的蚕蛹变应原提供依据。

医学检验专业开设Western Blotting综合性实验初探

分子生物学是当前生命科学发展的主流，其理论与技术已广泛应用于各个领域。Western Blottlng作为分子生物学的常规技术，在医学领域具有不可忽视的地位。因此，在医学检验专业开设Western Blotting实验课程，已成为一项非常必要的实验教学内容。其一，Western Blotting实验是分子生物学与免疫学的有效结合体，有助于学生对前沿的、跨学科知识加深了解；

用western blotting方法检测乙醇固定细胞中细胞周期素的表达

用 western blotting法测定乙醇固定细胞中细胞周期素 (cyclin)的表达情况 ,探索 western blotting和流式细胞仪对固定细胞在流式细胞术分选前或分选后对同批标本进行蛋白同步分析的可行性。采用对数生长期的 Molt- 4细胞 ,经两种常规固定方法固定后 ,用 western blotting方法检测 cyclin A、B1 、D和 E的表达。另取乙醇固定经流式细胞仪分选的 G1 期和 G2 / M期细胞裂解后 ,用 western blotting方法检测不同时相细胞中 cyclin B1 的表达。结果显示从固定细胞中提取的蛋白经 western blotting检测可得到清晰且分子量正确的条带 ,两种不同方法固定的细胞中检测到的 cyclins表达未见明显差异。乙醇固定细胞经分选后提取蛋白行 western blotting检测可见 G2 / M期细胞的 cyclin B1 有明显表达而 G1 期细胞不明显。细胞进行固定、洗涤、染色和分选等处理后不影响 western blotting对其 cyclins表达的分析 ,说明用 western

利用生物素标记法和 Western blotting技术检测血小板膜糖蛋白

为了建立一种简便的血小板膜糖蛋白检测方法,用生物素标记血小板膜糖蛋白,然后用westernblotting法进行检测。结果显示生物素可标记十几种血小板膜糖蛋白。用以标记的生物素浓度以5mmol/L较为适宜。在Western blotting图谱上,血小板无力症患者的膜糖蛋白Ⅱb、Ⅲa与正常对照相比明显减少。结果提示该方法可用于血小板膜糖蛋白减少性疾病的检测。

Western blotting检测survivin封闭载体转染大肠癌SW620细胞的实验研究

【目的】探讨KNA interferenece(RNAi)对survivin在大肠癌细胞SW620表达的影响及siRNA干扰后诱导survivin蛋白表达降低的机制。【方法】构建survivin特异性的RNA封闭性载体survivin,通过培养大肠癌细胞SW620,survivin封闭性载体转染SW620细胞;Hoechest染色大肠癌细胞,通过荧光显微镜观察细胞形态变化;Western blotting分析肿瘤细胞的蛋白表达情况。【结果】DNA测序证实表达质粒构建成功;免疫荧光显微镜可见细胞凋亡小体;Western blotting显示:大肠癌survivin的蛋白表达明显弱于对照组。【结论】Survivin与大肠癌的发生存在一定的关系,RNAi能够下调survivin的表达。

高内涵分析及Western blotting法在蛋白质核质分布研究中的应用及比较研究

目的使用不同方法对蛋白质的核质分布进行检测并比较差异。方法细胞经免疫荧光染色后使用高内涵分析(high content analysis,HCA)对蛋白质的细胞质或细胞核总荧光强度进行分析;分别提取胞质及胞核蛋白,使用Western blotting法对核质组分中的蛋白质含量进行鉴定。结果两种方法均可检测到蛋白质的出核转运;经定量分析,HCA法检测到的HuR蛋白质/核比升高倍数小于Western blotting法。结论使用HCA法检测蛋白质核质定位具有准确、客观、成本低、快捷、多参数等特点,不失为Western blotting的有效补充及替代方法。

肝脏特异性表达载体的构建及Western blotting检测

研究靶向于肝细胞的组织特异性siRNA,实现siRNA基因治疗的组织特异性,可用于特异性治疗乙肝,突破RNA干扰技术在临床应用的一大障碍。用靶向于EGFP的siRNA(以下简称siEGFP)替代靶向于乙肝病毒保守区的siRNA,构建可以在肝细胞中特异性表达的载体,用来表达siRNA。将目标载体分别转染肝癌细胞HepG2、乳腺癌细胞MDB-MB-231、人胚肾细胞293,在蛋白质水平上检验siRNA抑制的组织特异性。Western blotting结果证实,siEGFP在肝组织来源的细胞系HepG2中抑制效率明显高于其他两组细胞。构建的载体可以在肝癌细胞系中特异性的表达siRNA,而在其他组织细胞中不表达,实现了组织特异性。进一步将siEGFP替换为抑制HBV表达的siRNA,同样可以实现肝脏特异性的表达。

Western blotting中低丰度蛋白转膜方法改进

目的:改进Western blotting转膜方法,提高低丰度蛋白转膜效率。方法:在Western blotting转膜过程中,采用不同孔径的PVDF膜、不同的转膜时间及不同的甲醇含量进行转膜。转膜后,考马斯亮蓝染色观察PAGE胶上蛋白残留情况,ECL发光法检测FGFR1曝光强度。结果:通过改变膜孔径大小和转膜时间所得实验结果可见,孔径为0.22μm的PVDF膜转移2h的转膜效率更高。通过改变转膜液中甲醇含量所得实验结果可见,甲醇含量为10%转膜效率更高。结论:本实验对Western blotting转膜过程中低丰度蛋白的转膜方法进行了成功改进,改进后能提高蛋白显影强度,具有广泛的应用前景,是一种方便可行的操作方法。

In Search of Regulators of <i>LeSPL-CNR</i>by South-Western Blotting and Yeast One-Hybrid Library Screening System

LeSPL-CNR is a crucial transcription factor for fruit ripening of Solanum lycopersicum. The cnr (colorless non-ripening) epimutation resulted from hypermethylation in a 286 bp region of LeSPL-CNR promoter inhibits normal fruit ripening. In present study, potential regulators of LeSPL-CNR, which could bind to the specific 286 bp region, were screened via south-western blotting and yeast one-hybrid (Y1H) library screening system. Results indicated that a total of 13 and 19 candidate proteins were acquired respectively, and both ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase and 40S ribosomal protein were identified by two methods. These would provide some information for revealing roles of DNA methylation and the regulatory mechanism for LeSPL-CNR.

重组N蛋白抗原检测PRRSV抗体ELISA的研究 Ⅳ.与IDEXXELISA试剂盒及Westernblot的比较

利用重组N蛋白抗原建立了检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体的ELISA方法并组装成试剂盒,将试制的3批试剂盒分别与IDEXX生产的试剂盒及Western-blot进行了符合率试验。试验结果表明,所研制的试剂盒与Westernblot的符合率达97.67%以上。对460份临床血清分别用自制的试剂盒和IDEXX公司生产的试剂盒进行检测,其中有37份不相符合,用Westernblot对这37份血清进行验证,有35份血清检测结果与自制的试剂盒检测结果一致。由此表明,自行研制的试剂盒,其特异性和敏感性均能满足目前临床上该疫病的流行病学分析或免疫抗体检测。

定量PCR和Western blot结合检测回药爱康方对肺癌细胞EGFR、NF-κB的表达影响

目的:探讨定量PCR和Western blot结合检测对Lewis肺癌C57小鼠瘤细胞表皮生长因子受体(EGFR)、NF-κB表达影响,观察该方对调节癌细胞信号转导作用机制。方法:小鼠自接种瘤株细胞24 h后称重、编号,随机分为8组,每组5只,分别为:1回药高剂量组(AKH);2荷瘤模型组(对照组);3回药中剂量组(AKM);4单纯化疗药组(CTX组);5回药中剂量组加化疗组(AKM+CTX);6回药低剂量加化疗药组(AKL+CTX);7回药低剂量组(AKL);8回药高剂量加化疗药组(AKH+CTX)。采用RT-PCR和western blot方法检测小鼠组织样本中EGFR、NF-κBm RNA转录水平和蛋白质表达的变化情况。结果:实时荧光定量PCR结果显示:与模型组小鼠比较,给予回药爱康方,高、中、低剂量干预后,小鼠瘤细胞中EGFR m RNA表达水平显著下调(P<0.01),而低剂量对NF-κBm RNA的表达水平无统计学差异(P>0.05),给予回药爱康方,高+CTX、中+CTX、低+CTX、CTX后,小鼠瘤细胞中EGFR表达水平显著下调(P<0.01),小鼠瘤细胞中NF-κBm RNA表达水平显著上调(P<0.01);与模型组比较,给予回药爱康方高、中、低剂量干预后,Lewis肺癌C57小鼠EGFR、NF-κB蛋白表达水平无统计学差异性(P>0.05),给予回药爱康方高+CTX、中+CTX、低+CTX、CTX干预后,Lewis肺癌C57小鼠EGFR蛋白表达水平显著下调、NF-κB蛋白表达水平显著上调(P<0.01或P<0.05)。结论:回药爱康方高、中、低与回药开康方高+CTX、中+CTX、低+CTX、CTX均对EGFRm RNA的表达水平有影响,仅低剂量对NF-κBm RNA的表达水平无影响,同时回药爱康方高、中、低剂量均对EGFR、NF-κB蛋白表达无影响。

麻疯树外植体愈伤组织中毒蛋白的Western-blot鉴定

The proteins from endosperm, root, stem, leaf, leafstalk of Jatropha curcas L. and their calli were hybridized to the seed toxin protein (curcin) of Jatropha curcas L. by western blot. The result showed that the curcin was specifically expressed in the endosperm and its calli, while it was not detected in root, stem, leaf, and leafstalk of Jatropha curcas L. and their calli . This study indicated that calli induced from endosperm can be used to produce curcin.

固定后乳腺癌细胞雌激素受体和孕激素受体的FCM和Westernblot检测

背景与目的:雌激素受体(estrogenreceptor,ER)和孕激素受体(progesteronereceptor,PR)水平的定性、定量检测,对乳腺癌患者预后判断和内分泌治疗效果的评价具有重要意义。Westernblot法和流式细胞术(flowcytometry,FCM)是蛋白质定性、定量分析的重要手段,但常规Westernblot法要求提取新鲜样本的蛋白质。本研究拟建立固定后乳腺癌细胞ER和PR的Westernblot检测方法,探索Westernblot法和FCM对同批固定样本ER、PR进行同步分析的可行性。方法:取不同乳腺癌细胞株对数生长期新鲜细胞和固定细胞的蛋白提取物,分别用ERα单克隆抗体1D5和PR单克隆抗体PgR636以Westernblot法对ER、PR的表达情况进行检测,并与同期固定细胞的FCM检测结果进行比较。结果:经Westernblot法检测,T-47d、MCF-7、ZR-75-1细胞可见分子量正确的ERα清晰条带,固定T-47d和ZR-75-1细胞的ERα条带较新鲜细胞的条带浓,MM231细胞ERα检测为阴性;T-47d和ZR-75-1细胞可见清晰且分子量正确的PR条带,固定细胞的PR条带较新鲜细胞的条带浓,MM231和MCF-7细胞PR检测为阴性;同期固定细胞ER、PR阳性表达的FCM检测结果与Westernblot检测结果一致。结论:不同乳腺癌细胞在经0.25%多聚甲醛(paraformaldehyde,PFA)和75%乙醇固定后,可用于ER、PR的FCM定量检测。

以融合蛋白为抗原的简化Westernblot法诊断囊虫病

目的：为囊虫的诊断提供简便有效的方法。方法：猪囊尾蚴ｃＤＮＡ表达文库中筛选出的β－半乳糖苷糖－猪囊虫ｃＤＮＡ编码的融合蛋白为抗原，进行简化的Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析。结果：四个克隆的融合蛋白（ｃＣ１、ｃＣ２、ｃＰ１和ｃＨ１）联合使用，检测１２４例人囊虫病血清中的抗囊尾蚴ＩｇＧ抗体，阳性率达９３．７％，三个克隆的融合蛋白（ｃＣ１、ｃＣ２、和ｃＰ１）联合使用，检测３８例猪囊虫病血清中的相应抗体，阳性率达１００％，均高于各克隆融合蛋白单独使用的阳性率，且与其他寄生虫病血清无交叉反应。结论：以融合蛋白为抗原所进行的Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析具有高度灵敏性和特异性，且简便易操作。

免疫组化、Western blot蛋白印迹和免疫荧光染色观察磷酸鞘氨醇受体2大鼠海马中的表达变化

目的观察磷酸鞘氨醇受体2(S1PR2)基因在颞叶癫痫大鼠海马中的表达变化。方法将72只健康雄性Wistar大鼠随机均分为实验组(36例)和对照组(36例)。实验组使用氯化锂—匹罗卡品进行颞叶癫痫诱导制模,成功后持续大发作1h终止待检,对照组以相同剂量生理盐水注射,然后以进行免疫组化、Western blot印迹和免疫荧光染色检测并进行统计学分析。结果免疫组化检测结果显示,两组1d、3d、7d、28d、56d海马S1PR2阳性细胞计数相比有统计学意义(P<0.05);Western blot检测结果显示,两组3d、7d、28d、56d海马S1PR2蛋白表达水平相比有统计学意义(P<0.05);免疫荧光染色检测显示,S1PR2蛋白表达阳性为红色,星形胶质细胞为绿色,细胞核为蓝色。结论颞叶癫痫大鼠海马中S1PR2表达水平显著下降,说明颞叶癫痫发病机制可能与神经元功能、星形胶质细胞增生受到S1PR2影响有关。

Western Blot和流式细胞术检测磷酸化STAT3的比较

目的对Western Blot和流式细胞术(Flowcytometry,FCM)这两种磷酸化STAT3的检测方法进行比较。方法用不同浓度的白细胞介素5(interleukin 5,IL-5)刺激人早幼粒细胞白血病细胞株HL-60,活化细胞内的STAT3,然后分别用Western Blot和流式细胞术进行检测。结果 Western Blot与流式细胞术的检测结果一致。结论 Western Blot与流式细胞术用于磷酸化STAT3的检测各有优势,可以互为补充。

Western blot方法检测胞质中细胞色素C含量的改进

目的探讨用Western blot技术检测胞质中细胞色素C(Cyt C)的最佳转膜时间。方法取大鼠小肠上皮细胞,提取胞质蛋白。蛋白定量后,取20μg样品上样于聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。取22μm孔径硝酸纤维素膜(NC膜),电压100 V,分别电转移15、30、60、90、120 min。NC膜用丽春红染色,蒸馏水漂洗后加入Cyt C一抗、二抗孵育,放射自显影显色。结果在转膜过程中,随着时间的增加,转移到NC膜的总蛋白增多;而Cyt C条带出现了先增加(30 min),后减少,再增加(120 min)的趋势。结论 Cyt C虽然是小分子量蛋白,但Western blot的转膜时间并不需要减少,相反要增加到120 min才能得到最佳效果。