赤点石斑鱼诺达病毒的纯化及其衣壳蛋白的Western-blot分析

采用差速离心,蔗糖(10%～40%,W/V)密度梯度离心和氯化铯(30%～40%,W/W)等密度梯度离心法,对赤点石斑鱼诺达病毒大亚湾株(RGCN)进行了纯化,测定计算其浮密度为1.3102～1.3243g·cm-3。通过Westernblot法检测到的病毒的结构蛋白的分子量为37和31kDa,而以31kDa的蛋白为主。

黑曲霉葡萄糖氧化酶基因的原核表达及其蛋白产物的Western-blot分析

为进一步研究黑曲酶中国株3.758葡萄糖氧化酶(GOD)在大肠杆菌中的表达水平和条件,将黑曲霉中国株3.758的葡萄糖氧化酶(GOD)基因定向克隆于原核表达载体pET-11a上,构建了融合表达的重组质粒pET/GO,转化E.coliBL21(DE3)plysS,用IPTG诱导,超声波粉碎细菌细胞,SDS-PAGE电泳检测,GOD基因获得了表达,表达的融合蛋白相对分子质量为66.5 kDa。用市售葡萄糖氧化酶免疫家兔获得抗血清,酶联法(ELISA)测定其效价为106,West-ern-blot分析证明表达的融合蛋白与兔抗GOD血清有较强的特异性,为黑曲霉3.758葡萄糖氧化酶(GOD)抗体的制备奠定了基础。

Western-blot法测定重组人纽表位肽12的抗原特异性

利用Western-blot法测定重组人纽表位肽12的抗原特异性,结果显示目标蛋白有明显的显色带.本方法灵敏、准确、简单,适用于重组人纽表位肽12抗原特异性检测.

Western-blot综合性实验在分子诊断学教学中的实施

对Western-blot综合性实验在分子诊断学教学中的实施情况进行探讨,并分析其教学中存在的问题及提出解决对策,为有关院校开设Western-blot实验教学提供参考。

叶用莴苣幼苗幼叶总蛋白SDS-PAGE和Western-blot方法的优化

为建立一套适合叶用莴苣(Lactuca sativeL.)热激蛋白研究的SDS-PAGE和Western-blot方法。以叶用莴苣W7为材料,采用改进的TCA/Acetone法提取叶片蛋白,比较了2种电压下SDS凝胶分离蛋白质的效果,使用4℃保存2周的抗体稀释液,并且得到了较清晰的热激蛋白70和内参蛋白Rubisco条带,初步确定了叶用莴苣叶片热激蛋白的western-blot实验条件。

果梅CCoAOMT蛋白Western-blot体系建立与优化

[目的]本文旨在建立一套适合于果梅(Prunus mume)Western-blot的蛋白质提取和技术体系。[方法]以果梅品种‘小绿萼’花芽为试验材料,以咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(CCo AOMT)为目标蛋白,分别采用Tris-HCl法和SDS上样缓冲液直接提取法,比较2种提取方法的优劣,并通过设置不同的蛋白上样量(20、30、40、50及60μg)、转膜时间(40、60及90 min)、一抗稀释比例(1∶500、1∶1 000、1∶2 000及1∶5 000)以及一抗孵育时间(室温1 h、室温2 h及4℃过夜)等组合,研究适合果梅花芽CCo AOMT蛋白Western-blot的最佳体系。[结果]成功建立了快速、灵敏、特异的Western-blot体系,确定了果梅花芽CCoAOMT蛋白的Western-blot试验条件。SDS上样缓冲液直接提取法提取蛋白快速、高效,最佳条件为以蛋白上样量30μg、转膜1 h、一抗稀释比例1∶1 000以及一抗孵育2 h。[结论]本试验建立了简单、快速和重复性好的SDS上样缓冲液直接提取法以及优化的上样量、转膜时间和抗体浓度等Western-blot体系,为梅等木本植物开展Western-blot研究提供依据。

Western-blot方法分析人甲状腺及其肿瘤组织中bFGFs

目的：研究人甲状腺瘤的发生分期ｂＦＧＦｓ基因异常表达的关系。方法：采用Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ方法对人甲状腺及其肿瘤组织来源的ｂＦＧＦｓ进行分析研究。结果：人正常甲状腺组织来源的ｂＦＧＦｓ分子量为１７ＫＤ和１８ＫＤ，而人甲状腺肿瘤组织来源的ｂＦＧＦｓ为１４ＫＤ、１７ＫＤ和１８ＫＤ。结论：１４ＫＤｂＦＧＦｓ的出现提示人甲状腺肿瘤的发生和发展可能与ｂＦＧＦｓ的基因异常表达有关。

艾蒿、青蒿花粉变应原组分的研究

目的 对艾蒿、青蒿花粉变应原进行分离、鉴定。方法 采用不同的提取方式得到艾蒿、青蒿花粉的粗浸液 ,通过饱和 (NH4 ) 2 SO4 分级沉淀、聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)分离蛋白质组分 ,并用凝胶成像系统测定各组分的相对分子质量 (Mr) ;采用Western blotting鉴定 2种花粉的主要及次要变应原。结果 艾蒿、青蒿花粉分别分离到二十和十多种蛋白质组分。其中艾蒿花粉的组分中有 9种蛋白能与患者血清中蒿属花粉特异性IgE结合 ,Mr 为 6 2 0 0 0、4 30 0 0、380 0 0的蛋白条带的结合率最高。青蒿花粉的组分中有 11种蛋白能与患者血清中蒿属花粉特异性IgE结合 ,Mr 为 4 30 0 0、380 0 0的蛋白条带结合率最高。结论 艾蒿花粉的主要变应原Mr 分别为 6 2 0 0 0、4 30 0 0和 380 0 0 ,青蒿花粉的主要变应原Mr 分别为 4 30 0 0和 380 0 0 ;2种花粉变应原组分存在很大相似性 。

小麦和荞麦过敏原的分离与免疫学特性初步鉴定

为了提取、分离小麦(Triticum aestivum)和荞麦(Fagopyrum esculentum)的主要过敏原并对其免疫学特性进行鉴定,以磷酸盐缓冲液(PBS)制备小麦和荞麦总蛋白粗提液,通过SDS-PAGE分析总蛋白组成,利用麦类食品过敏患者血清中的IgE能特异性结合过敏原的特性,通过免疫印迹(Western-Blotting)鉴定其中的过敏原成分,然后用离子交换层析(DE-52)对总蛋白进行初步分离,并用Western-Blotting鉴定分离后组份的免疫学特性。SDS-PAGE分析显示,小麦蛋白条带共有18条,其中主要条带有12条(55、42、39、36、29、27、23、21、18、15、12、9 kD);荞麦蛋白条带共有17条,其中主要条带有8条(55、44、36、32、22、16、13、10kD)。Western-Blotting鉴定表明,小麦阳性条带有9条(36、32、29、26、23、18、15、12、9 kD),其中23 kD的过敏原特异性最强;荞麦阳性条带有5条(55、36、32、292、2 kD),其中22 kD的过敏原特异性最强。DE-52阴离子交换层析分离后经Western-Blotting分析显示,分离后过敏原的相对含量均有显著提高,且依然具有较强的免疫学活性,如经纯化后荞麦22 kD的过敏原相对含量由10.73%提高到21.07%。初步鉴定出小麦的主要过敏原为23 kD蛋白,而荞麦的主要过敏原为22 kD蛋白。

牙鲆生长激素基因的克隆及其在大肠杆菌中的融合表达

采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法, 从牙鲆(Paralichthys olivaceus)脑垂体总RNA中扩增出编码牙鲆生长素(GH)成熟肽基因序列.重组至融合表达载体pGEX-4T-3中,构建成牙鲆GH基因融合表达载体pGEX-gh, 转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选阳性克隆,IPTG诱导表达.经SDS-PAGE电泳显示在45kD处有特异的蛋白条带出现,该蛋白的表达量随诱导时间的延长而增加,3h达最高值,达到细胞总蛋白的18.3%.该融合蛋白在胞内主要以包涵体状态存在,经优化表达条件,成功地获得了可溶性的融合蛋白,经Glutathione Sepharase 4B凝胶纯化后用Western-blotting检测表明其为牙鲆生长激素,并通过酶联免疫吸附受体法证实其具有生物学活性.

猪2型圆环病毒广东株ORF2基因在大肠埃希氏菌中的表达

应用PCR扩增猪 2型圆环病毒广东株ORF2后部一段基因 ,将PCR产物用KpnⅠ和HindⅢ酶切后与同样处理过的 pBAD/gⅢB载体连接 ,转化TOP1 0细胞后挑取阳性克隆 ,酶切鉴定和测序后 ,用L 阿拉伯糖诱导 ,经SDS PAGE和Western blotting分析 ,表明ORF2基因在大肠埃希氏菌中得到了表达 ,表达的多肽为 2 8ku。

4种病原弧菌外膜蛋白的提取及抗原性初步分析

利用十二烷基磺酸钠抽提并结合超速离心的方法提取了鳗弧茵（Vibrio anguillarum）、河口弧菌（V．aestuarianus）、霍乱弧菌fEcholerae）和副溶血弧菌（V．parahaemolyticus）4种致病性弧茵的主要外膜蛋白，通过SDS．PAGE分析比较4种弧菌主要外膜蛋白的组分。结果表明：4株弧菌的外膜蛋白电泳图谱一般可得到5～10条蛋白带，分子量多数集中在26～40kD和48～85kD。对所提取的4种弧菌主要外膜蛋白进行SDS．PAGE后．分别与自制的兔抗鳗弧菌血清、抗河口弧菌血清、抗副溶血弧菌血清进行Western．blotting印迹分析。结果显示每种全菌抗血清可与相应菌的外膜蛋白部分组分发生免疫反应，并与其他3种弧菌外膜蛋白的部分组分产生交叉免疫反应，这些反应条带分子量主要集中于30～48kD之间。本研究为进一步研究致病性弧菌外膜蛋白免疫学特性提供参考。

bcl-2基因在小鼠睾丸及试验隐睾中表达的研究

目的 研究 bcl- 2基因在正常小鼠睾丸中的定位表达及试验隐睾所导致的改变。 方法 以 West-ern- blotting印迹法从蛋白水平检测 bcl- 2基因在正常小鼠睾丸及试验隐睾中的表达、变化 ;地高辛标记 bcl- 2基因c DNA探针 ,石蜡组织切片原位杂交技术 ,从 m RNA水平检测 bcl- 2基因在小鼠生精上皮中的定位及试验隐睾所导致的改变。 结果 Bcl- 2蛋白在正常小鼠睾丸中有较丰富的表达 ,试验隐睾导致其表达明显降低 ;bcl- 2基因在生精细胞中有较高水平的 m RNA转录 ,表达细胞主要为各级生精细胞 ,支持细胞和间质细胞未见表达 ,隐睾术后仍然保持较高水平的 m RNA转录。 结论 Bcl- 2蛋白可能在生精细胞主动退化的调节中起着重要作用。

A型禽偏肺病毒F蛋白的原核表达与抗原性分析

利用大肠杆菌表达A型禽偏肺病毒(aMPV)F融合蛋白,并检测其抗原活性。通过扩增aMPV F融合蛋白的编码基因,与原核表达载体pBCX(pet43.1改造载体)连接构建重组表达载体pBCX/aMPV/A/F,从上清中非变性纯化重组蛋白,并进行Western-blotting分析。结果表明,该融合蛋白相对分子质量为74 kDa,具有与aMPV单克隆抗体良好的结合能力,说明此融合蛋白具有良好的抗原性,可用于抗体检测。

白果过敏蛋白及其过敏原性研究

对白果的主要过敏蛋白进行鉴定,并对其过敏原性进行分析。以SDS-PAGE和Western-Blotting分析鉴定白果蛋白提取液中的蛋白质组分和过敏蛋白,通过间接ELISA法检测过敏小鼠血清中sIgE的效价。白果的蛋白质条带主要有13条,其中以21kD和32kD含量最多。Western-Blotting分析结果表明,白果蛋白中存在3条过敏原蛋白,分子质量分别为21、32、36kD。当酶标二抗稀释度为1:1000,白果蛋白包被质量浓度为50μg/mL,间接ELISA测得过敏小鼠血清中sIgE的效价为1:6400。对白果蛋白进行分析鉴定,明确了白果中存在的过敏原蛋白。

芝麻过敏原的分离、鉴定与纯化

通过SDS-PAGE电泳分离芝麻的蛋白质组份,采用免疫印迹(Western-blotting)方法其鉴定过敏原,通过离子交换层析对芝麻主要过敏原进行初步纯化。结果表明白芝麻粗提液SDS-PAGE显示有14条蛋白条带。黑芝麻粗提掖SDS-PAGE显示有16条蛋白条带。Western-Blotting显示对芝麻过敏患者的混合阳性血清均能与黑芝麻、白芝麻11 ku蛋白反应,离子交换层析可初步纯化出白芝麻11 ku的过敏原蛋白。

日本囊对虾原肌球蛋白的原核表达、抗体制备以及组织表达分析

食物过敏是人类常见的一种过敏性疾病,主要由食物中的蛋白质引起。原肌球蛋白(tropomyosin,TPM)是食用虾蟹等甲壳动物引起过敏反应的主要致敏物质。研究从日本囊对虾肌肉组织中克隆了TPM基因,进行了原核表达和蛋白质纯化,并进一步制备了相应的抗体。Western-blotting分析表明原肌球蛋白在日本囊对虾组织中普遍表达,并且肌肉组织中表达量最高而鳃和皮肤组织中表达量最低。研究结果为对虾过敏性疾病的诊断和治疗以及脱敏食品开发等奠定了理论基础。

长白猪γ-干扰素基因的原核表达与分析

以含长白猪IFN-γ基因的质粒载体为模板,用原核表达引物扩增了长白猪IFN-γ基因,将其定向克隆至原核表达载体pET28b的EcoRⅠ和XhoⅠ位点,构建了长白猪IFN-γ基因的原核表达载体pET28b-PoIFN-γ。经酶切、PCR鉴定,表明所构建的重组质粒为特异性长白猪IFN-γ基因原核表达质粒。将该重组质粒转化大肠埃希氏菌BL21(DE3)细胞,阳性菌落筛选、SDS-PAGE分析以及Western-blotting分析表明,成功构建了表达重组猪IFN-γ的大肠埃希氏菌基因工程菌株。亚细胞定位分析表明,目的蛋白经原核表达后主要以不溶性包涵体形式存在,其他少量可溶性目的蛋白存在于细胞浆中。

p73蛋白在食管癌中表达及其临床意义

目的 :研究p73蛋白在食管癌中的表达及其临床意义。方法 :采用Westernbloting技术检测 37例食管鳞状细胞癌肿瘤组织、癌旁组织、区域淋巴结和相应正常食管组织中p73蛋白的表达 ,并探讨与食管癌临床病理特征的关系。结果 :37例食管肿瘤组织中有 18例 (48.6 % )p73蛋白过度表达 ,其阳性表达率显著高于相应的癌旁组织、区域淋巴结和正常组织 (P <0 .0 5 ) ,并与食管癌TNM分期、细胞分化程度和病理类型均无明显关系 (P >0 .0 5 )。结论 :p73蛋白在食管肿瘤组织中呈高水平阳性检出率 ,p73蛋白可能参与了调控食管癌的发展过程。

大黄鱼β2-微球蛋白基因的克隆及其在大肠杆菌中的重组表达

主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)是一类高度多态的基因群,它广泛分布于各种脊椎动物体内,在启动特异性免疫应答中起关键作用.MHC根据结构分为I型和II型两种.β2-微球蛋白(β2-microglobulin,β2m)是MHCI型分子的轻链.本文根据大黄鱼β2m的表达序列标签(expressed sequence tags,EST)序列设计合成了特异性引物,利用RT-PCR技术从大黄鱼脾脏组织中克隆了β2m基因(Pscr-β2m);构建了含β2m基因的原核表达载体(pGEX4T-2-β2m),在0.1mmol/dm3IPTG诱导下重组β2m得到了表达;采用Sepharose 4B亲合层析纯化目的蛋白并制备了抗体;Western-blotting分析证实了该抗体具有与天然大黄鱼脾脏组织中β2m蛋白反应的特性.这些结果为进一步研究鱼类β2m结构与功能的关系,以及制备MHCI类分子四聚体奠定基础.