大鼠骨髓单个核细胞诱导扩增为内皮祖细胞的细胞分离方法、接种数目、培养瓶包被条件

目的筛选大鼠骨髓单个核细胞(BMMNCs)诱导扩增为内皮祖细胞(BM-EPCs)的细胞分离方法、接种数目、培养瓶包被条件,构建一个高效、高产量、高纯度的骨髓来源BM-EPCs分离培养诱导扩增方法。方法取2周龄雄性SD大鼠,脱颈处死后分离大鼠双侧胫骨和股骨,收集骨髓细胞悬液。配制30%、50%、60%和70%浓度的Percoll细胞分离液,通过Percoll密度梯度离心法分离出大鼠BMMNCs种子细胞,并计算活细胞比例。将获得的BMMNCs分为1×10^(5)、5×10^(5)、1×10^(6)、2.5×10^(6)、5×10^(6)、1×10^(7)六个组别,分别接种于25 cm^(2)无菌培养瓶中,培养7 d后镜下观察各组细胞集落形成数目,并计算每10^(6)细胞的集落形成数。运用Graphpad prism9.5软件进行Logistic拟合曲线,根据相关系数R^(2)确定相关性,根据其P值将有统计学差异的接种数目纳入范围,随后使用R语言编程定义计算函数,根据已知种子细胞总数及相关性函数限制下,通过迭代寻找最佳的BMMNCs细胞接种数目。分别配制20、50、100 nmol/L浓度的人纤连蛋白(FN)溶液,以不添加FN的空白溶液为对照,分别包被空白培养瓶2、6、12、24 h,将收集的48 h未贴壁BMMNCs接种于FN包被的各培养瓶中,静置培养3 d后计算各组集落形成数目,确定FN包被的最佳浓度与时间。接种48 h未贴壁BMMNCs于25 cm^(2)培养瓶底,使用EGM-2完全培养基定向诱导,于显微镜下观察集落形成及诱导扩增进程。取培养14 d的BM-EPCs,分别采用双阳性染色法和流式细胞术鉴定BM-EPCs的纯度。结果使用Percoll分离法可把BMMNCs细胞清晰的分为5层,其中30%与50%Percoll细胞分离层之间为BMMNCs活细胞比率最高。BMMNCs的最优接种数目为2.5×10^(6)个。以50 nmol/L的FN溶液包被24 h或以100 nmol/L的FN溶液包被6 h皆可有效促进细胞集落形成。细胞接种7 d后获得形态良好的铺路石样细胞并建立生长优势,表明BMMNCs已经诱导成为形态良好的BM-EPCs。Dil-Ac-LDL/FITC-UEA-1双阳性细胞占比为91.89%±5.77%,CD31+KDR阳性率为90.73%±0.61%、CD14阳性率为0.53%±0.17%、CD45阳性率0.77%±0.34%,说明获得的BM-EPCs纯度良好。结论大鼠BMMNCs诱导扩增为BM-EPCs过程中,可使用Percoll密度梯度离心法分离BMMNCs,BMMNCs的最优细胞接种数目为2.5×10^(6)个,细胞培养瓶包被条件为以50 nmol/L的FN溶液包被24 h或以100 nmol/L的FN溶液包被6 h,分离培养诱导获得的BM-EPCs形态和纯度均良好。

改良全骨髓贴壁法分离及培养大鼠骨髓间充质干细胞

目的建立简单、优化的分离及培养大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的方法,为组织工程支架研究提供细胞基础。方法分别采用常规和改良的全骨髓贴壁法分离和培养BMSCs。常规法按照传统全骨髓贴壁法,对骨髓冲洗液进行过筛和离心处理后加入完全培养基进行培养。在改良全骨髓贴壁法中,将骨髓冲出骨髓腔后直接加入完全培养基进行培养。倒置相差显微镜下观察两组细胞形态,采用细胞计数试剂盒(CCK-8)法比较两组BMSCs的增殖活性,流式细胞术检测表面标志物CD90、CD29、CD11b/c、CD45。对改良法培养的BMSCs进行定向诱导成骨及成脂分化,并通过茜素红染色检测其成骨分化潜能,通过油红O染色检测其成脂分化潜能。结果改良全骨髓贴壁法培养的BMSCs形态均一,细胞集簇排列呈“鱼群状”“漩涡状”。改良法比常规法培养的BMSCs增殖活性强(P<0.05)。改良法与常规法培养的BMSCs均高表达CD90和CD29,低表达CD11b/c和CD45。改良法培养的BMSCs成骨、成脂诱导分化后茜素红染色和油红O染色均为阳性。结论改良全骨髓贴壁法可成功分离并培养BMSCs,培养的BMSCs具有多向分化潜能,为组织工程支架的研究奠定了细胞基础。

小鼠骨髓间充质干细胞分离方法的比较与探讨

目的探讨可高效分离小鼠骨髓间充质干细胞(mBMSCs)的技术方法。方法分别采用骨片消化爬片法、全骨髓贴壁法、骨片消化液上清法和骨片消化研钵法等四种方法分离7~9周龄雄性C57BL/6小鼠的mBMSCs;于倒置显微镜下观察原代mBMSCs形态;运用流式细胞术检测mBMSCs特征性免疫表型;采用多向分化诱导检测mBMSCs成骨分化能力与成脂分化能力。结果分离获得的原代细胞首次换液后于倒置显微镜下观察:骨片消化爬片法分离的细胞,仅见大量骨碎片和杂细胞,该法所分离细胞不再进行后续检测评估;全骨髓贴壁法分离的细胞,仅可见少量多角形贴壁细胞,夹杂大量杂细胞;骨片消化液上清法分离的细胞也可见较多长梭形、三角形贴壁细胞,但杂细胞较多;骨片消化研钵法分离的细胞,可见较多长梭形、多角形贴壁细胞,杂细胞少。分离细胞经培养传代到第3代(P3代)时,一方面采用流式细胞术分析mBMSCs特征性免疫表型,结果表明骨片消化液上清法和骨片消化研钵法分离的mBMSCs纯度均较高,全骨髓贴壁法不理想;另一方面,进行成骨分化诱导与成脂分化诱导,结果表明与全骨髓贴壁法分离的细胞相比,骨片消化液上清法和骨片消化研钵法所分离出的细胞具有较强的多向分化潜能。结论骨片消化液上清法和骨片消化研钵法分离获得的mBMSCs纯度较高、质量较好。

SD大鼠骨髓基质干细胞的全骨髓培养与鉴定

目的:采用体外全骨髓培养法培养SD大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)并进行鉴定。方法:采用全骨髓贴壁法分离扩增大鼠骨髓基质干细胞,采用流式细胞仪检测细胞表面分子CD29、CD34、CD45的表达。结果:全骨髓培养法能迅速、有效地培养和获得大量骨髓基质干细胞,流式细胞仪检测显示CD29阳性率为99.0%,CD34阳性率1.5%,CD45阳性率0.8%。结论:全骨髓贴壁培养法是获得骨髓基质干细简捷、高效、经济的途径,可以获得较纯的BMSCs。

大鼠骨髓间充质干细胞的培养鉴定以及向神经干细胞分化的实验研究

目的:体外培养并鉴定大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),研究其生物学特性,初步探索酸性成纤维细胞生长因子(acidic fibroblast growth factor,aFGF)诱导其向神经干细胞(neural stem cells,NSCs)分化的可行性。方法:全骨髓贴壁培养法分离培养大鼠BMSCs,倒置相差显微镜观察其形态特征,MTT法绘制生长曲线,流式细胞仪(flow cytometry,FCM)测定细胞周期并鉴定细胞表面标志物。用80 ng/ml aFGF的无血清DMEM/F12培养液诱导大鼠BMSCs向NSCs分化,镜下观察细胞形态特征,免疫荧光染色方法检测神经巢蛋白(Nestin)、神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)的表达。结果:大鼠BMSCs贴壁生长,呈梭形,多角形。第1、3、5代BMSCs的生长曲线均呈S形,活性无明显差异。细胞周期显示94.34%BMSCs处于G0/G1期,有较强的分裂增殖能力。FCM检测CD29、CD54、CD90表达阳性,CD45表达阴性。诱导6 h后细胞的胞体收缩成椭圆形或球形并伸出细长突起,免疫荧光染色显示Nestin表达阳性,继续诱导发现双极和多极细胞增多,诱导6 d后相互连接成网状,成典型的神经元样细胞,NSE表达阳性。结论:全骨髓贴壁培养法能培养出高纯度的BMSCs,细胞生长稳定、增殖快、可多次传代,具有干细胞特性。经aFGF诱导后具有向NSCs分化的潜能,NSCs能进一步分化为神经元样细胞。

全骨髓贴壁法培养兔骨髓间充质干细胞体外定向成骨诱导分化及鉴定

背景:流式细胞仪分离法和免疫磁珠分离法对细胞活性影响较大,密度梯度离心法虽然能够获得纯度高的单核细胞,但由于多次离心可造成细胞的大量流失且对细胞活性有一定的影响使其应用值得商榷。目的:采用全骨髓贴壁法分离兔骨髓间充质干细胞进行成骨诱导分化及鉴定。方法:采用全骨髓贴壁法体外分离培养兔骨髓间充质干细胞,倒置显微镜下观察细胞形态学特征。在成骨诱导剂作用下,通过碱性磷酸酶染色试剂盒行碱性磷酸酶染色,Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色,VonKossa法及茜素红进行矿化结节染色以及电镜下检测兔骨髓间充质干细胞成骨诱导后的形态结构。结果与结论:经诱导后细胞出现与成骨细胞相似的形态学特征,碱性磷酸酶染色阳性,Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色,Von-Kossa法及茜素红矿化结节染色阳性。表明经成骨诱导剂诱导后全骨髓贴壁法体外分离纯化培养的兔骨髓间充质干细胞能向成骨细胞方向分化增殖。

兔骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定

目的:探讨一种简便可行的兔骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs)体外分离培养方法。方法:通过全骨髓贴壁分离法体外分离、扩增兔骨髓间充质干细胞,观察其增殖和生长特性,绘制生长曲线;倒置相差显微镜观察细胞形态;并向软骨细胞诱导分化,采用番红快绿染色和甲苯胺蓝染色鉴定。结果:经全骨髓贴壁法得到的骨髓间充质干细胞性状稳定,为纺锤状,呈克隆样生长;成软骨诱导培养的骨髓间充质干细胞,表现出软骨细胞的形态特征和生物学特征。结论:采用全骨髓贴壁分离法操作简便,是培养兔骨髓间充质干细胞的理想方案,在适当的条件下BMSCs能多向分化。

全骨髓贴壁法培养人骨髓间充质干细胞的改良研究

本研究旨在利用红细胞自然沉降性原理,以传统的全骨髓贴壁法为基础,探讨一种改良后简便而高效的人骨髓间充质干细胞培养方法。采用6孔板培养细胞,将骨髓标本用MSC完全培养液培养48 h,吸取上层无红细胞的上清层,置于新的培养孔以分离获取MSC。用倒置显微镜观察细胞形态及贴壁情况,记录细胞首次贴壁时间、首次传代时间,并以传统全骨髓贴壁法为对照;应用流式细胞术检测细胞周期、细胞表面标记;用油红O及碱性磷酸酶试剂盒分别对MSC成脂、成骨能力进行鉴定;应用计数板计数法描绘第1代,第3代,第5代MSC增殖曲线。结果表明,用改良法培养的MSC高表达CD90、CD105、CD13、CD44,低表达CD14、CD45、CD34;细胞周期中G0/G1期88.76%,G2/M期3.04%,S期8.2%,符合干细胞周期特征;增殖曲线呈典型"S"型;油红O与碱性磷酸酶染色均为阳性。同时与传统方法相比,改良方法的细胞贴壁率显著高于传统方法(P=0.0004),首次贴壁时间短(P<0.0001)、首次传代时间短(P=0.001)。结论:骨髓标本培养48 h后的上清层中含大量贴壁活性的悬浮MSC,改良方法是一种比传统贴壁法更具有便捷、高效等优点的培养方法。

差速贴壁法纯化分离GFP转基因小鼠骨髓间充质干细胞

目的运用差速贴壁法分离纯化绿色荧光蛋白(GFP)转基因小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)。方法分离GFP转基因小鼠骨髓细胞直接种植在培养瓶中,分别于2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、24h和48h进行首次全量换液,培养3d后按细胞类型对贴壁细胞分别计数,并用CD44、CD45、CD54进行免疫细胞化学染色。另外,选4h、8h、24h后换液的细胞进行传代培养,传至第5代,计算扩增倍数,用CD44、CD45、CD54进行免疫细胞化学染色。结果随着首次换液时间的延长,贴壁细胞密度增多,BMSCs的比例减少。首次换液时间在接种后2h的细胞纯度高,但细胞密度低;24h后的细胞密度高而纯度低;8h后的细胞密度大具有较高的纯度。传代后的GFP转基因小鼠BMSCs能稳定表达GFP。结论差速贴壁法能有效分离纯化GFP转基因小鼠BMSCs,首次换液时间在接种后8～10h时的传代细胞纯度高,具有扩增能力,可作为组织工程和基因治疗研究的种子细胞。

差速贴壁法分离兔骨髓源性间充质干细胞和内皮祖细胞及其生物学特性的研究

本研究探讨一种高效、稳定的从兔骨髓中同时分离培养间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSC)和内皮祖细胞(Endothelial Progenitor Cells,EPC)的方法并观察其生物学特性。抽取兔骨髓,应用密度梯度分离单个核细胞,采用差速贴壁经纤连蛋白包被并结合EGM-2MV培养基分别扩增MSC和EPC。用台盼蓝法测定细胞传代成活率,通过绘制生长曲线法、MTT法、DNA周期检测MSC和EPC的增殖能力及诱导分化成骨细胞、成脂肪细胞能力,并结合流式细胞术(FCM)检测MSC免疫原型以鉴定MSC;细胞吞噬功能特异性地摄取Dil-ac-LDL及FITC-UEA-1,并结合CD133、VEGFR2/KDR、CD34免疫荧光鉴定EPC,并计算其纯度。结果表明,经密度梯度分离单个核细胞,在早期贴壁细胞24 h换液时即可见明显集落形成,8 d后达80%融合,细胞呈均匀一致的长梭形排列;2次贴壁细胞经EGM-2MV培养基培养,第3天开始伸展,约8 d可融合近80%,细胞呈多角形,出现条索状结构;2种细胞台盼蓝法测定细胞传代成活率均在90%以上,传至第2代后,生长曲线均近似"S"形;MTT法检测显示,细胞生长d 3至d 5时光密度值变化较明显;MSC G0-G1期为(93.32±1.65)%、EPC G0-G1为(93.05±1.95)%,2种细胞DNA周期无明显差异;早期贴壁细胞FCM检测CD90、CD44阳性率为(99.7±1.12)%、(99.1±2.33)%;CD14、CD45、CD79a阳性率分别为(4.8±0.38)%、(6.8±0.49)%及(0.4±0.08)%,经体外诱导能够向成骨细胞及脂肪细胞分化,鉴定为MSC;2次贴壁细胞传至第2代经Dil-ac-LDL、FITC-UEA-1双荧光染色阳性率(82.1±3.4)%,CD133、VEGFR2/KDR、CD34免疫荧光染色阳性率分别为(74.2±3.2)%、(64.7±4.3)%及(43.5±1.5)%,鉴定为EPC。结论:应用密度梯度分离法结合差速贴壁筛选法可培养出高纯度的MSC,2次贴壁细胞经纤连蛋白预包被并结合EGM-2MV培养基体外诱导可培养出增殖能力较强的EPC,为组织工程学研究提供种子细胞。

骨髓间充质干细胞的成骨性诱导

目的:观察大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化的效果。方法:采用全骨髓贴壁法培养SD大鼠骨髓间充质干细胞,把生长状态良好的第3代骨髓间充质干细胞,分为两组,对照组用DMEM-LG培养基培养;实验组用含有成骨诱导剂的DMEM-LG培养基培养。结果:全骨髓贴壁法培养的原代骨髓间充质干细胞贴壁且呈梭形;经成骨诱导剂诱导后骨髓间充质干细胞呈卵圆形贴壁生长,碱性磷酸酶活性明显强于对照组(P<0.01),茜素红染色出现阳性的钙化结节。结论:全骨髓贴壁法培养骨髓间充质干细胞方法简单、实用,所培养的骨髓间充质干细胞在成骨诱导后表现了成骨细胞的形态学和生物学特性。

全骨髓贴壁法分离培养小鼠骨髓间充质干细胞

为体外建立一种高效、稳定的从小鼠骨髓中分离培养间充质干细胞的方法。采用全骨髓贴壁法分离C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞,传至第三代后运用流式细胞术检测第三代细胞的表面抗原;取第三代细胞,分别向成骨、成软骨诱导分化。结果显示:流式细胞术检测CD29、Scal-1、CD45的阳性率分别为97.1%、87.1%、0.7%;在成骨培养基的诱导下,碱性磷酸酶染色、茜素红染色均呈阳性;在成软骨培养基的诱导下,阿利辛蓝染色阳性。由此可知,通过此方法可以获得较高纯度的小鼠骨髓间充质干细胞,并且具有多向分化潜能。

应用全骨髓贴壁法获取高纯度大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

目的探讨体外获取高纯度大鼠骨髓间充质干细胞的方法。方法应用全骨髓贴壁法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,进行传代培养,倒置显微镜下观察细胞形态并测定其生长曲线,流式细胞术检测细胞周期,免疫细胞化学法鉴定细胞表面标志CD34、CD44及CD45。结果获取的大鼠骨髓间充质干细胞形态呈均一成纤维细胞样,并呈集落样生长。细胞生长曲线示,在传代后的第4-5天细胞开始明显增殖,进入指数增生期。细胞周期显示81.49%P3代细胞为G0/G1期,经免疫细胞化学染色结果显示CD44阳性,CD34、CD45阴性。结论体外应用全骨髓贴壁法可以分离培养出高纯度的大鼠骨髓间充质干细胞,而且此法简单易行、经济。

大鼠骨髓间充质干细胞体外培养与慢病毒转染方法的建立

本研究建立大鼠骨髓间充质干细胞(BMMSC)体外分离培养、表型鉴定和标记的方法,为临床进行细胞移植治疗提供合格的细胞。无菌条件下取大鼠股骨、胫骨,用冲洗法冲出骨髓,贴壁培养法分离纯化BMMSC,体外扩增;流式细胞术进行免疫表型鉴定,并进行成骨,成脂分化鉴定;利用携带绿色荧光蛋白(GFP)基因的慢病毒液转染大鼠BMMSC。结果表明,贴壁培养法能有效分离纯化大鼠BMMSC,细胞呈均一的成纤维细胞样;流式细胞术显示,第4代BMMSC中CD29、CD44表达阳性,CD34、CD45表达阴性。在相应的诱导培养条件下,BMMSC均能成骨及成脂分化。BMMSC用慢病毒液转染后表达GFP。结论:贴壁培养法简单、可行和稳定;分离培养的细胞具有BMMSC的生物学特性和多向分化潜能;BMMSC经慢病毒液转染后表达GFP,标记效率高,可作为标记细胞的一种有效手段,适合体内示踪。

小鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养和鉴定方法学探讨

目的探讨骨髓间充质干细胞体外分离培养和鉴定方法,找到一种能在质和量上均能满足需要的体外培养条件。方法无菌条件下分离处死后取小鼠双下肢骨,低糖DMEM培养液冲出骨髓,离心5mins,用5ml含10%胎牛血清的低糖DMEM培养液重悬细胞。加入等体积密度为1.073g/L percoll分离液离心30mins。取中层云雾状细胞。37℃、5%CO2培养箱中贴壁培养。取5-10代细胞培养至对数生长期后,洗涤离心。取100μl细胞悬液分别加入相应抗体,避光孵育30mins,洗涤离心。流式细胞仪检测,CELLQUEST软件收集数据。结果骨髓间充质干细胞是一类纺锤形或梭形细胞,与纤维细胞类似,顺向呈"鱼群样"排列。CD45、CD34、CD31呈阴性表达,表达率分别为0.82%,0.27%,0.97%;CD44、CD90、CD71呈阳性表达,表达率分别为99.8%,99.7%,99.36%。不同代数细胞表面分子的表达情况无明显差异(P>0.05)。结论贴壁培养法能够在质和量上满足骨髓间充质干细胞的体外培养条件。

罗曼鹤鸡骨髓间充质干细胞的分离培养和鉴定

目的建立鸡骨髓间充质干细胞（BMSCs）的分离培养和鉴定体系。方法从1～14天龄罗曼鹤鸡骨髓中分离骨髓细胞，差速贴壁法纯化、扩增BMSCs。倒置显微镜下观察细胞形态特征，MTY法绘制生长曲线，流式细胞仪检测细胞标志物，并分别进行成骨、成脂诱导分化能力检测。结果分离培养的细胞呈成纤维细胞样或长梭形，生长状态良好；CD29阳性表达率为92．10％，CD34阳性表达率仅为0．80％；经成骨诱导分化，出现明显的钙化结节，茜素红染色阳性；经成脂诱导分化，油红O染色阳性，细胞内出现明显的脂质小滴。结论建立了操作简单、高效的鸡BMSCs分离培养和鉴定体系，为鸡BMSCs的进一步研究和应用提供了良好的基础。

兔骨髓间充质干细胞的体外分离培养及鉴定

目的:观察兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)生长特性及潜在分化潜能,为组织工程中种子细胞选择提供实验基础。方法:应用全骨髓贴壁法分离培养兔BMSCs,相差显微镜下观察其生长特点,应用流式细胞术对第三代细胞进行表面抗原鉴定。经成脂和成骨诱导液体外诱导兔BMSCs向脂肪细胞、成骨细胞分化,对诱导2周后的细胞进行油红O染色、茜素红染色、Van-kossa银染染色及碱性磷酸酶染色。结果:经流式细胞术鉴定,全骨髓贴壁法可获得兔BMSCs,第三代兔BMSCs生物特征基本一致并能诱导分化为脂肪细胞及成骨细胞,成脂诱导后油红O染色细胞内出现红色脂滴,成骨诱导后茜素红染色、Vankossa银染均可观察到矿化结节。碱性磷酸酶活性染色对照组呈弱阳性,诱导组呈强阳性。结论:全骨髓贴壁法是分离培养兔BM-SCs简便可行的方法。BMSCs来源丰富并有成脂及成骨潜能,是组织工程的优良种子细胞。

染色体短期培养法的改良及在白血病患者染色体核型分析中的应用

目的改良骨髓染色体短期培养法并对130例白血病患者进行染色体核型分析。方法通过单因子梯度实验,对影响骨髓染色体短期培养法的秋水仙素浓度、作用时间、低渗时间等主要因素进行优化,并在改良基础上,进行了3因素3水平正交实验优化骨髓染色体制备体系,进一步对我院130例白血病患者进行了染色体核型分析。结果秋水仙素浓度、秋水仙素作用时间、低渗时间等因素都有适宜的范围,过高或过低都会影响染色体制备成功率,正交实验结果表明骨髓染色体制备的最适体系为秋水仙素质量浓度0.07μg/mL,作用时间80min,低渗时间35min。通过改良的染色体短期培养法对130例白血病患者进行了染色体核型分析,染色体制备成功率达到了97.69%,异常核型检出率为82.3%。结论 0.07μg/mL秋水仙素作用80min,低渗时间35min的改良骨髓染色体制备体系值得临床推广。

骨髓内皮祖细胞EPCs两种分离方法及其对比研究

目的:研究免疫磁珠法和贴壁换液法分离骨髓内皮祖细胞的可行性和条件,并比较两种方法优缺点.方法:利用免疫磁珠法和贴壁换液法从骨髓中分别提取内皮祖细胞,体外观察细胞生长及形态变化,通过检测细胞血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)、Ⅷ因子相关抗原抗体表达、摄取乙酰化-低密度脂蛋白(Ac-LDL)情况和超微结构等进行鉴定.同时,流式细胞检测分离所得细胞的纯度、细胞计数测定分离所得细胞的数量及MTT法检测细胞生长增殖状况等,对两种分离方法进行对比研究.结果:用免疫磁珠法和贴壁换液法从骨髓中分别提取的细胞,体外培养后细胞呈铺路石形,透射电镜显示细胞内具有特征性的W-P小体,免疫荧光染色检测细胞相关抗原VEGFR-2,Ⅷ/vWF呈阳性,同时细胞摄取Ac-LDL,证实为内皮祖细胞.免疫磁珠法与贴壁换液法相比,分离所得内皮祖细胞数量是后者2倍,纯度为76%,明显高于贴壁换液法的29%;同时,两者对细胞增殖生长无明显影响.结论:利用免疫磁珠法和贴壁换液法均可分离得到骨髓内皮祖细胞,它将成为新的组织工程种子细胞.免疫磁珠法分离得到细胞纯度更高、数量更大,但步骤复杂、价格昂贵;贴壁换液法得到细胞纯度和数量偏低,但方法简单、经济、实用性强.

无血清条件下骨髓间充质干细胞增殖及分泌VEGF的实验研究

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)在不同无血清培养时间下增殖及分泌血管内皮生长因子(VEGF)的规律。方法采用贴壁培养法纯化BMSCs,流式细胞仪鉴定第3代(P3)BMSCs的细胞表型;比较BMSCs在不同无血清培养时间下的细胞凋亡率;将BMSCs分为无血清培养12、24、36、48及72h组,用ELISA方法检测VEGF的分泌。结果原代BMSCs培养24h后贴壁生长良好;经流式细胞仪检测,BMSCs表面CD34、CD45阴性,而CD29、CD44、CD90阳性,符合BMSCs特征;无血清培养12、24、36、48、72h后细胞凋亡率组间比较,差异无统计学意义(P>0.05),培养96h后凋亡率与其余各组比较差异有统计学意义(P<0.05);随着无血清培养时间的延长,BMSCs分泌VEGF逐渐增多(P<0.05),无血清培养72h组分泌VEGF水平最高。结论大鼠BMSCs在无血清培养条件下,72h内细胞凋亡无明显增多,且随着无血清培养时间的延长,分泌VEGF逐渐增多。