血清Wnt4基因启动子区的DNA甲基化程度对早产患者预测价值分析

目的 分析血清Wnt4基因启动子区的DNA甲基化程度对早产患者的预测价值。方法 随机选择2019年1-12月在该院产科病区产检的孕产妇480例,其中450例随访至分娩,将其中40例自发性早产的孕产妇作为早产组,410例足月产孕产妇作为健康组。比较健康组、早产组、早产组不同孕周者的血清Wnt4基因启动子区的DNA甲基化水平。分析健康组、早产组的临床数据,采用Logistic回归分析早产的风险因素,绘制受试者工作特征(ROC)曲线分析血清Wnt4基因启动子区的DNA甲基化程度对早产的预测价值。结果 与健康组比较,早产组血清Wnt4基因启动子区的DNA甲基化程度明显增高(P<0.05);与早产组34~<37周妊娠期女性相比,孕周28~<34周妊娠期女性血清Wnt4基因启动子区的DNA甲基化程度明显增高(P<0.05);与健康组比较,早产组产次≥2次、妊娠期被动吸烟、阴道胎儿纤维连接蛋白(fFN)阳性、家庭平均月收入<1 000元的比例明显增加(P<0.05),宫颈长度明显缩短(P<0.05);Logistic回归分析结果显示,产次≥2次、妊娠期被动吸烟、宫颈长度短、阴道fFN阳性、家庭平均月收入<1 000元、血清Wnt4基因启动子区的DNA甲基化程度高均是早产的主要风险因素(P<0.05);ROC曲线分析结果表明,血清Wnt4基因启动子区的DNA甲基化程度预测早产的曲线下面积为0.868(95%CI:0.834~0.898),最佳截断值为51.43%,灵敏度、特异度、准确度分别为82.50%、84.63%、84.44%。结论 血清Wnt4基因启动子区的DNA甲基化程度高对于早产具有一定的临床预测价值。

白斑狗鱼Wnt4基因的克隆及其表达分析

为探讨无翅型MMTV整合位点家族成员(Wnt4)基因在白斑狗鱼性别发育过程中的作用,通过反转录PCR法克隆获得白斑狗鱼Wnt4基因片段,运用ClustalX和MEGA6.1软件对其氨基酸同源性及物种进化关系进行分析。研究结果显示,克隆获得的Wnt4基因片段长度为1505bp,其中开放阅读框长度为1059bp,编码352个氨基酸。氨基酸同源性分析表明,白斑狗鱼与虹鳟、青鳉同源性较高,与非洲爪蟾和褐家鼠等相似性则较低。系统发育结果显示,白斑狗鱼与白边锯鳞鱼亲缘关系最近,与海胆和栉孔扇贝、厚壳贻贝的亲缘关系最远。实时荧光定量PCR分析显示,Wnt4基因在白斑狗鱼卵巢、精巢、肠道、肌肉、鳃、脑等组织中均有表达,卵巢的表达最明显,卵巢表达量明显高于精巢,Wnt4基因在卵巢后期发育过程中,表达量呈现下降趋势。研究结果表明,Wnt4基因在白斑狗鱼卵巢发育的早期参与到某些器官的形成及功能的维持。本研究结果可为白斑狗鱼的性别发育机制提供参考资料。

栉孔扇贝wnt4基因cDNA克隆及表达分析

由栉孔扇贝(Chlamys farreri)转录组数据库获得wnt4基因的一段表达序列标签(EST)序列,利用SMART-RACE技术克隆了wnt4基因cDNA全长序列,该序列长1 239 bp,其中开放阅读框为1 068 bp,可以编码355个氨基酸,推导的氨基酸序列含有WNT家族特有序列,且与沙蚕(Platynereis dumerilii)、海胆(Heliocidariserythrogramma)、人(Homo sapiens)等物种WNT4同源性都在60%以上。半定量RT-PCR结果显示,除肾脏外,wnt4基因在栉孔扇贝的精巢、卵巢、闭壳肌、肝胰腺、鳃、外套膜组织中均有表达,但表达量较低。定量RT-PCR结果表明:wnt4基因在成熟期的精卵巢中表达量最高,增殖期和休止期表达量次之,生长期表达量最低;整个生殖周期中精巢表达量高于卵巢。该基因在栉孔扇贝多个组织中的表达特性,暗示其参与了多样的生物学过程;在性腺中的表达特征表明其可能参与两性性腺的发育并在生殖细胞成熟过程中发挥作用。

长牡蛎(Crassostrea gigas)Wnt4基因cDNA克隆与表达分析

Wnt4作为Wnt基因家族的重要成员,在动物的生长发育过程中起重要调控作用。本文利用RACE技术克隆了长牡蛎Wnt4基因c DNA全长序列,该序列全长1999bp,开放阅读框为1068bp,编码355个氨基酸,该蛋白序列与人(Homo sapiens)、沙蚕(Platynereis dumerilii)和栉孔扇贝(Chlamys farreri)Wnt4蛋白的相似性分别为44%、48%和46%。通过荧光定量RT-PCR分析长牡蛎Wnt4基因在成体不同组织和不同发育阶段的表达情况,发现长牡蛎的Wnt4基因具有广泛的组织表达特点,在所检测的多种组织中(外套膜、鳃、唇瓣、消化腺、雄性性腺、雌性性腺)均有表达,推测长牡蛎的Wnt4以信号分子的形式参与多种组织细胞的生命过程;长牡蛎个体发育过程中Wnt4基因的高表达主要集中在胚胎发育的早期(桑葚期最高,原肠胚期次之),幼贝期该基因的表达量很低,说明Wnt4基因可能在早期发育阶段参与了某些器官的形成。

厚壳贻贝Wnt4基因时空表达

为探究Wnt4基因在厚壳贻贝幼虫发育阶段和组织生长过程中的作用,通过RACE技术克隆了厚壳贻贝Wnt4基因c DNA全长序列,该序列全长3342 bp,开放阅读框为1074 bp,编码357个氨基酸。该序列与人、小鼠、海胆、栉孔扇贝和长牡蛎等物种的同源性分别为61%、61%、60%、71%和76%。通过实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析Wnt4基因在厚壳贻贝成体多个组织中(外套膜、闭壳肌、鳃、雌雄性腺、足和消化腺)均有表达,其中在外套膜中表达量最高,推测可能与贝壳形成有关;Wnt4基因在厚壳贻贝幼虫发育阶段高表达主要集中在壳顶期,并推测Wnt4基因可能参与了贝壳形态结构发生转变的过程以及某些器官的形成与发育。本研究为进一步开展双壳贝类Wnt基因家族的功能研究提供了理论依据。

栉江珧wnt4基因cDNA的克隆表达及调控

本研究运用同源克隆技术和RACE技术克隆了栉江珧(Atrina pectinata)wnt4基因cDNA全长序列。该基因序列全长为1493 bp,其中开放阅读框1074 bp,编码由357个氨基酸组成的蛋白。氨基酸序列分析表明,栉江珧wnt4基因具有wnt家族保守结构域,与栉孔扇贝(Chlamys farreri)、海胆(Paracentrotus lividus)等物种具有高度的同源性。荧光定量PCR分析表明,wnt4基因表达具有广泛性和组织差异性,且与性别和性腺繁殖周期相关。wnt4基因表达量与性腺成熟度相关,并且整个繁殖周期卵巢表达量均显著高于精巢,说明wnt4基因参与了栉江珧两性性腺的发育,并在卵巢中发挥更重要的作用。不同发育阶段胚胎荧光定量分析表明,wnt4基因主要参与了栉江珧的早期胚胎发育。在胚胎发育早期(囊胚期和原肠期)wnt4基因的表达水平最高,是成体表达量的500倍;在担轮幼虫和D形幼虫期迅速下降,暗示wnt4基因可能在栉江珧早期发育阶段参与了某些器官的形成。17β-雌二醇诱导实验显示,17β-雌二醇可能通过反馈调节抑制卵巢wnt4基因表达(P<0.05);短时间处理,17β-雌二醇能诱导精巢wnt4基因显著表达(P<0.05)。

日本青鳉2种WNT4基因的克隆及鉴定(英文)

Wingless-type MMTV integration site family,member 4(WNT4) is a critical signaling molecule,regulating cell-cell interactions,proliferation,differentiation,migration,and gene activation [1,2].It is a highly conserved gene with mammals and has multiple roles in organogenesis and homeeostasis,and it has special importance in the sexual differentiation of the ovary [3 - 6].

WNT4基因在房间隔缺损患者心肌组织中的表达

目的:探讨房间隔缺损(ASD)患者心房肌组织中WNT4基因的表达变化,分析WNT4基因与ASD病理生理学之间的关系。方法:获取20例单纯Ⅱ孔型ASD患者和9例正常对照右房心耳肌组织标本,采用RT-PCR技术检测心房肌组织中WNT4基因mRNA的表达丰度。结果:WNT4基因表达于正常和ASD患者心房肌组织中,正常心肌组织中的表达丰度为(54.67±25.85)%,ASD患者心肌组织中的表达丰度为(33.21±20.37)%,ASD患者心肌组织中WNT4基因的表达丰度显著低于正常对照(t=2.4151,P<0.05)。结论:WNT4基因在心肌组织中的异常表达可能与ASD的病理生理学有关,其在ASD患者心肌组织中表达下调可能与ASD病理状态下右房压力负荷增加导致胎儿心脏基因程序启动、心脏特异性染色体重构机制有关。

WNT4基因沉默对PAX2诱导肾小管上皮细胞间充质转分化的影响

目的:观察体外转染配对盒基因2(PAX2)对WNT4通路的激活作用及WNT4通路对PAX2诱导转分化的作用,探讨PAX2转分化机制。方法:应用脂质体介导将重组质粒pEGFP-PAX2转染入体外培养的大鼠肾小管上皮细胞,经G418筛选,建立稳定表达PAX2细胞系。细胞分为稳定转染PAX2组、空载组和对照组。Western blotting法和实时荧光定量(Real-time)PCR法检测各组细胞WNT4和β-catenin表达。应用靶向WNT4基因的siRNA沉默稳定转染PAX2细胞的WNT4,应用荧光显微镜观察转染效率,进行沉默鉴定筛选出最佳干扰链。将最佳干扰链WNT4siRNA转染至稳定转染PAX2细胞。在沉默24、48、72和96h应用Westernblotting法和Real-time PCR法检测β-catenin、正常肾小管上皮细胞表型标志物E-钙黏蛋白(E-cadherin)和成纤维细胞表型标志物α-肌动蛋白(α-SMA)表达,同时筛选出沉默最佳时间点。应用免疫组织化学染色法检测沉默最佳时间点组E-cadherin和α-SMA蛋白表达。结果:Western blotting和Real-time PCR检测,稳定转染PAX2细胞组WNT4和β-catenin蛋白及mRNA表达水平较空载组和对照组明显增加(P<0.05)。阴性siRNA转染入稳定转染PAX2细胞24h后荧光显微镜观察,转染效率为47.46%±4.48%。3条WNT4干扰链分别转染至稳定转染PAX2细胞,Real-time PCR和Western blotting结果显示第3干扰链沉默效果最佳,WNT4mRNA表达抑制率为66.9%±3.8%(P<0.05);WNT4蛋白表达抑制率为63.7%±2.5%(P<0.05)。将最佳干扰链转染至稳定转染PAX2细胞,干扰24、48、72和96h后,各时间点细胞中的β-catenin mRNA及蛋白表达水平较对照组下调,72h组下调明显(P<0.05);各时间点细胞中E-cadherin mRNA及蛋白表达水平较对照组明显上调,72h组上调明显(P<0.05);各时间点细胞中α-SMA mRNA及蛋白表达水平较对照组明显下调,72h下调明显(P<0.05)。结论:PAX2转染至肾小管上皮细胞后激活了WNT4通路,PAX2在体外诱导正常肾小管上皮细胞间充质转分化可能是通过WNT4/β-catenin通路完成。

沉默Wnt4基因抑制大鼠肾间质纤维化

目的探讨沉默Wnt4基因对肾间质纤维化的影响,为慢性肾病的治疗提供理论依据。方法 128只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、阴性对照组和Wnt4基因沉默组,每组32只。构建Wnt4 siRNA慢病毒载体体内转染沉默组的大鼠,于转染后第3、7、10、14天分为四个亚组,每组8只大鼠。通过H&E染色病理检查、RT-PCR技术检测肾间质改变及β-连环蛋白、Wnt4、α-SMA表达情况。结果 H&E染色病理检查结果表明:假手术组四个时间点未见肾间质改变;UUO组、阴性沉默组及沉默组造模后3 d出现肾间质水肿、少量肾间质纤维化,10、14 d肾间质弥漫性巨噬细胞、淋巴细胞浸润,呈加重趋势;阴性沉默组基因与UUO组相同;沉默组四个时间点均出现不同程度肾间质纤维化,14 d肾间质纤维化程度低于阴性沉默组及UUO组(P<0.05);Wnt4基因沉默后UUO组mRNA表达量的相关性分析显示,Wnt4与β-catenin mRNA表达量具有显著相关性(r=0.886,P<0.001)。Wnt4与α-SMA mRNA表达量具有显著相关性(r=0.930,P<0.001)。Wnt4基因沉默后沉默组mRNA表达量的相关性分析显示,Wnt4与β-catenin mRNA表达量无显著相关性(r=0.204,P=0.263)。Wnt4与α-SMA mRNA表达量具有显著相关性(r=0.753,P<0.001)。结论沉默Wnt4基因在肾间质纤维化大鼠中可明显抑制肾间质纤维化,可能对其有治疗作用。

中华鳖Wnt4基因克隆及表达分析

通过RACE技术成功获得中华鳖(Pelodiscus sinensis)Wnt4基因的cDNA全长序列,并利用实时荧光定量PCR分析了该基因在不同组织、胚胎不同发育时期的表达特征以及Wnt激动剂(Wnt agonist 1)对其表达的影响。结果表明:中华鳖Wnt4基因cDNA全长2432 bp,开放阅读框为1095 bp,编码364个氨基酸。中华鳖Wnt4基因与海龟(Chelonia mydas)和三趾箱龟(Terrapene carolina triunguis)具有高度同源性。Wnt4基因在雌雄个体性腺中表达量最高,且雌性卵巢中表达水平显著高于雄性精巢(P<0.05)。在胚胎不同发育时期(14~21期)雌雄性之间有明显的表达差异(P<0.05),推测其参与了中华鳖性别分化的过程。Wnt激动剂能上调Wnt4基因的表达水平,此结果为中华鳖性别分化机制的研究提供了参考。

沉默WNT4基因对稳定转染PAX2基因大鼠肾小管上皮细胞迁移和侵袭能力的影响

目的:探讨沉默WNT4基因对稳定转染配对盒基因2 (PAX2)大鼠肾小管上皮细胞迁移和侵袭能力的影响,阐明PAX2基因是否通过WNT4基因调控细胞生物学活性。方法:选取对数生长期的PAX2基因稳转细胞系,分为稳转组和对照组。稳转组细胞分为稳转对照组(不应用WNT siRNA沉默)和沉默72h组(应用WNT siRNA沉默72h)。Western blotting法检测稳转组和对照组大鼠肾小管上皮细胞中PAX2和WNT4蛋白的相对表达量,Real time PCR法检测稳转对照组和沉默72h组大鼠肾小管上皮细胞中WNT4mRNA相对表达量,细胞划痕实验检测稳转对照组和沉默72h组大鼠肾小管上皮细胞的细胞迁移率,Transwell实验检测稳转对照组和沉默72h组大鼠肾小管上皮细胞的穿膜细胞数。结果:Western blotting法检测,稳转组大鼠肾小管上皮细胞中PAX2和WNT4蛋白相对表达量高于对照组(P<0.05)。Real-time PCR法检测,沉默72h组大鼠肾小管上皮细胞中WNT4mRNA相对表达量低于稳转对照组(P<0.05)。细胞划痕实验10h后,沉默72h组大鼠肾小管上皮细胞的细胞迁移率低于稳转对照组,但组间比较差异无统计学意义(P>0.05);细胞划痕实验18h后,沉默72h组大鼠肾小管上皮细胞的细胞迁移率低于稳转对照组(P>0.05)。Transwwell实验,沉默72h组大鼠肾小管上皮细胞的穿膜细胞数低于稳转对照组(P<0.05)。结论:PAX2基因可能通过WNT4基因调控细胞的生物学活性。

皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)WNT4基因生物信息学分析及与性腺发育相关性的研究

WNT4作为WNT基因家族的重要成员,在动物的性腺发育过程中起重要调控作用。从皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)转录组文库中获得WNT4基因的cDNA序列,该序列长2002 bp,包括5′非编码区(5′UTR)342 bp,3′非编码区(3′UTR)595 bp,开放阅读框(ORF)长度为1071 bp,可以编码356个氨基酸。该蛋白序列与福寿螺(Pomacea canaliculata)、长牡蛎(Crassostrea gigas)、栉孔扇贝(Azumapecten farreri)和厚壳贻贝(Mytilus coruscus)的同源性分别为71.86%、70.92%、67.51%和65.32%。通过qRT-PCR分析WNT4基因在雌雄皱纹盘鲍不同月份不同组织中的表达特点,其结果显示,除肝胰腺外,WNT4基因在其雌雄个体不同月份的鳃、外套膜、肌肉和性腺中均有表达;在雌性个体性腺中,WNT4基因的表达量以7月份为最高,显著高于其他月份;其次为5、8月,显著高于6、9月的表达量;5月与8月、6月与9月之间均差异不显著。在雄性个体性腺中,不同月份WNT4的表达量7月>8月>9月>5月>6月;7、8月的表达量均显著高于其他月份,9月显著高于6月的表达量,与5月差异不显著,5月表达量与6月差异不显著。此外,WNT4基因在精巢的表达量均高于卵巢。原位杂交(ISH)结果显示,WNT4在5—9月雌性皱纹盘鲍性腺的卵母细胞和雄性性腺的结缔组织均有明显的蓝紫色杂交信号。皱纹盘鲍WNT4基因在各个组织均有表达,表明其的表达特点是广泛性的,参与多种组织细胞的生命过程;在不同月份性腺中的表达特征,推测其可能在两性性腺发育过程中发挥作用。

石油烃暴露对栉孔扇贝组织Wnt4基因表达的影响

采用荧光定量PCR的方法测定了不同浓度石油烃暴露下栉孔扇贝各组织Wnt4基因相对表达量的变化,结果表明,栉孔扇贝各组织Wnt4基因表达量在不同浓度石油烃影响下变化程度具有明显差异,对照组表达量大小顺序为精巢>卵巢>鳃丝>消化盲囊;在浓度为0.1mg·L^(-1)石油烃影响下,除鳃丝Wnt4基因表达量有上升趋势之外,其余各组织均无显著变化(P>0.05);而在0.3mg·L^(-1)及以上石油烃浓度组,四种组织Wnt4基因表达量随暴露时间均出现明显上升或者被抑制的现象(P<0.05),各组织Wnt4基因被激活和被抑制的时间和程度均有不同,受石油烃暴露影响的程度为鳃丝>卵巢>精巢>消化盲囊。本研究认为0.3mg·L-1及以上浓度石油烃暴露对栉孔扇贝各组织特别是鳃丝Wnt4基因表达量的影响较大,对栉孔扇贝的生长发育影响明显;各组织Wnt4基因表达量在不同浓度石油烃的影响下呈现一定的规律性,其变化跟各组织解毒指标的变化具有一定相似性,是较好的反映栉孔扇贝在石油烃暴露下其生长发育变化程度的生物学指标。