中国内江猪各脏器组织中人类ABO血型抗原的分布

目的确证中国内江猪各脏器组织中是否存在人类ＡＢＯ血型抗原。方法抗人类血型Ａ、Ｂ、Ｈ抗原单克隆抗体为一抗，免疫组织化学ＥｎＶｉｓｉｏｎ法分别检测１０头中国内江猪多种组织人类血型Ａ、Ｂ、Ｈ抗原分布。结果所有血管内皮细胞均无Ａ、Ｂ、Ｈ抗原表达。其它多种组织表达Ａ抗原，而不表达Ｂ、Ｈ抗原。结论中国内江猪的部分脏器组织中有人类Ａ血型抗原表达，虽不属于超急性排斥反应抗原，但在猪→人异种移植中是值得研究并应加以克服的异种抗原。中国内江猪人血型抗原的表达不同于已报道的其它猪种，有可能寻找一种抗原性弱的猪作为异种移植供者的选育对象。

生物血管主要组织相容性复合体抗原表达及内皮化的实验研究

为了解胰蛋白酶处理前后版纳微型猪近交系血管的主要组织相容性复合体 (Major histocom patibilitycomplex,MHC)表达及去细胞后重新内皮化情况 ,为异种移植及猪血管用于血管组织工程提供资料 ,取猪颈动脉 ,胰蛋白酶预处理猪血管前后 Western Blot法检测 MHC抗原表达 ,在自行设计制作的新型动力性生物反应器中 ,用原代培养的内皮细胞种植在去细胞血管基质材料表面 ,扫描电镜检测内皮化效果。结果表明 ,胰蛋白酶预处理血管后 ,未见 MHC抗原表达 ,扫描电镜可见血管腔内皮细胞形态正常 ,沿血管长轴分布 ,提示经胰蛋白酶预处理的猪血管 MHC抗原大大降低 ,人内皮细胞能成功内皮化 。

中国版纳近交系小型猪心脏异种抗原表位α1,3-Gal的分布

目的 研究中国版纳小型猪心脏的异种抗原α1,3 Gal的分布和半定量分析 ,为小型猪心脏的转基因和异种移植提供资料。方法 通过亲和免疫组织化学法和图像分析对 10头版纳小型猪心脏进行α1,3 Gal的分布和半定量研究。结果 α1,3 Gal主要分布于细胞膜 ,细胞浆也有少量表达 ,胞核无表达。在小型猪心内膜、心肌间质、心外膜、神经束膜等处有α1,3 Gal分布 ,心肌细胞未发现α1,3 Gal分布。半定量分析发现α1,3 Gal表达量心房内膜最多 ,心肌间质最少。结论 异种抗原α1,3 Gal在心脏中的表达存在较大差异 。

牛、猪红细胞表面异种抗原改造的比较

把动物红细胞输用给人,即异种输血,可以缓解目前血源紧张的矛盾,但牛和猪的红细胞与人的血浆发生强烈的凝集反应,不能直接输用。本研究首次对牛和猪红细胞表面抗原进行修饰改造,并对改造后的猪、牛红细胞进行比较,从而为开拓丰富来源、安全有效的人血代用品奠定基础。使用基因重组的咖啡豆α半乳糖苷酶清除牛和猪红细胞表面的主要异种抗原αGal抗原,结合使用化学材料甲氧基聚乙二醇(mPEG)修饰遮蔽牛和猪红细胞表面的非主要异种抗原nonαGal抗原,以实现对牛和猪红细胞表面异种抗原的改造。结果:改造后的牛、猪红细胞与人混合血浆的盐水凝集反应消失,具有和人红细胞相似的血清学特征;牛红细胞比猪红细胞脆性低,异种抗原的表达量低,及其他的一些特征说明牛红细胞比猪红细胞更适合作为人红细胞代用品。结论:改造后的牛红细胞与人血浆相匹配,有可能成为人红细胞代用品。

版纳微型猪近交系椎间盘异种抗原α-半乳糖基的分布

目的 探讨中国版纳微型猪近交系 (BMI)椎间盘组织中异种抗原的分布 ,为临床猪 -人异种椎间盘移植提供依据。方法 采用 BMI 6头 ,雄性 ,8～ 11月龄的 L1～ 5椎间盘组织 ,常规福尔马林固定 ,石蜡包埋切片。以植物凝集素 (BSI- B4 )作为亲和物质 ,采用免疫组织化学 SABC方法、DAB显色 ,观察猪椎间盘组织中异种抗原 (α-半乳糖基 )的分布情况。结果 椎间盘纤维环软骨细胞及髓核软骨样细胞核膜有阳性染色的黄色颗粒沉着 ,而基质、弹力及胶原纤维无着色。结论 BMI椎间盘组织中有异种抗原存在 ,但抗原表达较弱 。

中国内江猪胰腺组织异种抗原的研究

为获取临床猪→人异种胰腺移植的基础资料 ,分别采用植物凝集素 BSIB4、健康人血清、人类血型抗原 A、B、H物质单克隆抗体免疫组化法检测 1 0头内江猪胰腺组织中异种移植抗原的表达。结果显示 :内江猪胰腺组织中血管内皮、导管上皮细胞表达α- Gal;部分胰岛细胞、胰腺外分泌细胞和所有导管上皮细胞均表达人类血型 A抗原。结论 :人体内存在抗内江猪胰腺组织部分细胞的天然抗体 ;

版纳小型猪脱细胞骨基质的抗原检测及力学性状

制备版纳小型猪脱细胞骨基质,进行组织学和生物力学观察,并进行了异种抗原-αga l表达的检测,结果表明经脱细胞处理后,去除了骨组织的细胞成分,同时消除了抗原性,力学性质上与正常对照无明显差异,可以作为一种合适的骨组织工程支架材料。

异种移植抗原α-gal介导人血清杀伤A549细胞的实验研究

背景与目的人体α-1,3半乳糖基转移酶(α-1,3Galactosy ltransferase,α-1,3GT)基因功能失活而不表达α-半乳糖基(α-galactosyl,α-gal)表位,但天然存在着大量抗α-gal抗体,异种器官移植研究结果提示,在人肿瘤细胞上重新表达异种移植抗原α-gal,可能诱发类似于宿主抗移植物超急性排斥反应的抗肿瘤效应。本研究通过基因导入手段,建立稳定表达异种移植抗原α-gal的转基因人肺癌细胞系,探讨α-gal介导的人血清抗肿瘤的可能性及其机制。方法将前期成功构建的α-1,3GT基因真核表达质粒pEGFP-N1-GT瞬时转染人肺腺癌细胞A549,筛选并建立稳定的转基因细胞系A549-GT。MTT增殖实验和显微镜观察转基因细胞生物学特性变化;RT-PCR检测A549-GT中α-1,3GT基因mRNA表达;荧光素标记的凝集素(FITC-BS-IB4lectin)染色检测α-1,3GT在肿瘤细胞表面合成α-gal的能力;A549-GT细胞及其培养基分别与正常人细胞共培养,检验α-1,3GT基因的稳定性和酶活性的稳定性;人血清结合实验检测A549-GT与IgM和补体C3结合情况。结果RT-PCR检测到转基因细胞系A549-GT中有α-1,3GTmRNA表达。荧光显微镜和流式细胞术检测结果显示:A549-GT能够长期稳定表达异种移植抗原α-gal表位;A549-GT与其亲本细胞在生长形态及增殖速度上无明显差异;A549-GT细胞及其培养基分别与正常人胚肺成纤维细胞MRC-5共培养均不能使MRC-5获得α-gal合成能力;经人血清处理后,荧光免疫实验观察到转基因细胞系A549-GT能与血清抗体IgM结合并诱导补体C3结合。结论异种移植抗原α-gal在肿瘤细胞上的重新表达,可能通过补体依赖的细胞毒机制,介导类似于异种器官移植排斥反应的抗肿瘤效应。

五指山小型猪单个核细胞表面α Gal抗原表达差异的分析

利用猪的器官为挽救脏器终末衰竭病人而进行的异种移植是有效救治病人的途径之一.由于猪细胞表面存在的α1,3半乳糖会引起超急性免疫排斥反应,导致移植器官最终被移植受体排斥.除人类和旧大陆猴外,所有哺乳动物细胞表面都有αGal半乳糖表达,但个体间表达量存在显著差异.为研究近交系五指山小型猪细胞表面α1,3半乳糖表达的个体差异,本实验利用FITC-isolectin进行荧光标记,通过流式细胞术以及激光共聚焦分析,对14例5月龄猪样本外周血单个核细胞表面的α1,3半乳糖水平进行检测.利用猪肾上皮PK15细胞确定FITC-isolectin标记的最适浓度为25ng/μl(细胞标记效率大于85%).结果显示,14头猪外周血单个核细胞表面α1,3半乳糖的表达差异范围在1.25～2.09倍之间,远低于普通非近交系猪的个体差异.本研究为利用近交系五指山小型猪作为异种器官移植的研究材料提供了基础数据.

流式细胞分析测定猪外周血单个核细胞Gal α1,3 Gal水平(英文)

在考虑以猪器官作为供体对人进行异种器官移植时,α1,3半乳糖被认为是引起超急性免疫排斥的主要异种抗原.人们建立了各种方法以降低猪α1,3半乳糖水平,但是也有可能筛选得到在自然情况下α1,3半乳糖表达水平比较低的猪.为了研究在正常猪单个核细胞中α1,3半乳糖浓度分布的差异,利用鸡免疫球蛋白Y(ck-IgY)抗体通过流式细胞分析对正常猪的α1,3半乳糖水平的差异进行检测.取3～8周龄猪的全血,用肝素抗凝处理后经密度梯度离心获取外周血单个核细胞(PBMCs),与FITC标记的ck-IgY(10μg/ml)孵育,经流式细胞仪检测α1,3半乳糖水平.结果显示,相同周龄猪的α1,3半乳糖水平可有0.4～2.6倍差异,同一猪的水平在不同周龄有1.3～5.6倍差异.ck-IgY的特异性由棉籽糖和α1,3半乳二糖测定,棉籽糖(100μmol/L)可抑制70%ck-IgY结合,而α1,3半乳二糖(6.25μmol/L)可完全取消ck-IgY的结合,说明ck-IgY与猪单个核细胞是特异性结合.上述发现说明,ck-IgY是检测猪单个核细胞表面α1,3半乳糖的特异试剂,不同猪或是同一猪在不同时间的α1,3半乳糖水平有着明显的差异.

人类α-1,2-岩藻糖苷转移酶在猪血管内皮细胞的表达及作用

目的:探讨人类α-1,2-岩藻糖苷转移酶(HT)基因在猪血管内皮细胞(PIECs)的表达及意义。方法:将人HT基因重组质粒通过脂质体转染进猪血管内皮细胞,经G418筛选(500mg/L),用流式细胞仪检测HT的表达,表达阳性细胞与人血清共同孵育检测细胞的生存率。结果:流式细胞仪检测结果显示,未经转染HT基因的PIECS的H抗原表达率是13.80%,平均荧光强度很低是32.39,α-Gal表达率是99.98%,平均荧光强度是1347.09;转HT基因的PIECS其H抗原表达率是40.17%B平均荧光强度是143.66,α-Gal表达率是41.15%B平均荧光强度是158.72。转HT基因的细胞在人血清的作用下生存率明显高于未转染的细胞。结论:转染HT基因的PIECs明显提高了H抗原的表达,同时降低了α-Gal的表达,为转基因动物实验探讨克服异种移植超急性排斥反应(HAR)提供理论依据。

α-半乳糖苷酶清除猪细胞表面的α-Gal抗原

目的:探讨脆弱类杆菌来源的基因重组α-半乳糖苷酶清除猪细胞表面α-Gal抗原的作用。方法:用不同浓度的α-半乳糖苷酶酶解猪红细胞、猪胚肾细胞PK15、猪睾丸细胞ST和原代培养的猪成纤维细胞上的α-Gal抗原,酶解温度为26℃,作用时间为2 h;用25μg/m L的FITC-IB4凝集素标记酶解前后的细胞,采用流式细胞仪检测细胞表面α-Gal抗原的清除率。结果:流式细胞检测结果表明,不同组织来源的猪细胞表面的α-Gal抗原的表达量明显不同,所需酶的剂量也不同,但其表面的α-Gal抗原均能被α-半乳糖苷酶清除。结论:脆弱类杆菌来源的α-半乳糖苷酶可以清除猪细胞表面的α-Gal抗原,提示该酶对降低异种移植引起的超急性排斥反应有重要意义。

大鼠脂肪来源干细胞抵抗人血清介导的异种体液免疫杀伤作用及其机制

目的研究大鼠脂肪来源干细胞（rASC）抵抗人血清介导的异种体液性杀伤的作用及其主要机制。方法分离培养SD大鼠ASC，将2～8代的rASC作为实验材料，以大鼠淋巴细胞（rLC）作为对照。采用流式细胞技术，检测两种细胞异种抗原”Gal的表达情况，体积分数20％正常人血清对两种细胞的杀伤作用、两种细胞分别与正常人血清中天然抗体IgM和IgG的结合情况，以及与正常人血清作用后补体C3c、CAc,CSb-9在两种细胞上的沉积情况。结果成功分离和培养rASC，rASC表面标志检测呈CD44阳性、CD45阴性、CD90阳性及主要组织相容性抗原Ⅱ阴性，并成功诱导rASC向成脂细胞和成骨细胞分化。相对于rLC，rASC对人血清介导的异种体液性杀伤具有明显的抵抗作用，其几何平均荧光强度（Gmean）值为（20．42±2．80）％，低于rLC的（51．84±6．70）Vo（P〈0．01）；rASC上α-Gal的表达量为13．97±0．33，显著低于rLC的24．47±3．03（P〈0．05）；rASC与人血清中IgG和IgM的结合量分别为9．4±2．0和5．73±1．0，显著低于rLC的107．2±4．8和27．49±3．9（P〈0．01）；与正常人血清作用后，rLC可见显著的C3c、CAc和C5b-9沉积（Gmean值分别为1924±509．4、177．3±37．17和37．05±7．4），但rASC仅有较少C3c和CAc沉积（Gmean值分别为294．6±38．02和35．23±3．1），C5b-9沉积几乎为阴性（Gmean值为5．63±1．74），两种细胞间比较，差异均有统计学意义（P〈0．05或P〈0．01）。结论rASC能明显抵抗人血清介导的异种体液免疫杀伤作用，其机制可能与rASC低表达异种抗原α-Gal及抑制了补体攻膜复合物形成有关。

猪血管内皮细胞上人天然抗体识别的抗原表位的研究

为了测定猪血管内皮细胞膜表面可能存在的碳水化合物抗原表位,5个人工合成的糖结合物(还原胺化法)和猪胃粘膜糖肽片断被用于中和人天然抗体.然后再用这类中和之后的人血清与猪血管内皮细胞行补体依赖的细胞毒反应(MTT法),并与牛血清白蛋白对比.有2个糖结合物能部分和人天然素体,它们是:(1)去唾液酸分枝双糖-牛血清白蛋白;(2)Le^a-Le^x钥孔虫戚血蓝素.这些糖结合物均含有Gal(β1,3)GlcNAc或Gal(β1,4)GlcNAc.猪胃粘膜糖肽片断具有较强地抑制人血清细胞毒性的作用,除含有Gal(β1,3)GlcNAc、Gal(β1,4)GlcNAc之外,它的主要结构为GlcNAc(χ1,4)Gal.用钥孔虫戚血蓝素作载体能加强糖结合物中和人天然抗体的作用.提示天然抗体认别成簇状的糖表位结构.

大鼠骨髓间充质干细胞抵抗人血清介导的异种体液免疫杀伤作用及其机制

目的:研究大鼠骨髓间充干细胞(r BMSC)抵抗人血清介导的异种体液性杀伤的作用及其主要机制。方法:分离培养SD大鼠BMSC,将第4代的r BMSC作为实验材料,以大鼠淋巴细胞(r LC)作为对照。采用流式细胞技术,检查两种细胞异种抗原α-Gal的表达情况,体积分数20%正常人血清对两种细胞的杀伤作用、两种细胞分别与正常人血清中天然抗体Ig M和Ig G的结合情况,以及与正常人血清作用后补体C3c、C4c、C5b-9在两种细胞上的沉积情况。结果:成功分离和培养r BMSC。相对于r LC,r BMSC对人血清介导的异种体液性杀伤具有明显的抵抗作用(P<0.01);r BMSC上α-Gal的表达显著低于r LC(P<0.05);r BMSC与人血清中Ig G和Ig M的结合量显著低于r LC(P<0.01);与正常人血清作用后,r LC可见显著的C3c、C4c和C5b-9沉积,但r BMSC仅有较少C3c和C4c沉积,两种细胞间比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论:r BMSC能明显抵抗人血清介导的异种体液免疫杀伤作用,其机制可能与r BMSC低表达异种抗原α-Gal及抑制了补体攻膜复合物形成有关。