Crystallization and preliminary X-ray crystallographic analysis of yeast prion protein Ure2p with shortened N-terminal

An orthorhombic crystal form of a recombi-nant yeast prion protein with shortened N-terminal, 90Ure2p, has been obtained. Crystals were grown by the vapordiffu-sion technique against a mother liquor containing imidazole. Crystals belong to the primitive orthorhombic lattice with the cell parameters a = 54.5 A, b = 74.7 A, c = 131.0 A. The crystals diffract to beyond 3.0 A resolution at a synchrotron beamline.

淫羊藿提取物对酵母朊病毒[PSI^+]治愈的影响

研究6种菊科中药对酵母朊病毒[PSI+]治愈效果。通过在培养基内加入适量浓度中药成分的方式,利用表型检测方法在细胞水平上检测中药对酵母朊病毒的治愈。淫羊藿醇提物对朊病毒[PSI+]最佳治愈浓度为0.097 5 g/mL,治愈率可达到3%,而水提物没有治愈作用。淫羊藿醇提物对酵母朊病毒有一定的治愈作用。

酵母双杂交技术筛选朊蛋白PrP23-231互作蛋白

利用酵母双杂交技术,以pSos-PrP23-231载体为诱饵质粒,筛选小鼠脑cDNA文库中能与朊蛋白PrP23-231相互作用的蛋白。通过一次筛选,三次验证,从小鼠脑cDNA文库中得到2个阳性克隆,通过BLAST序列比对得到2个候选基因序列,并对验证后的阳性克隆的外源性片段进行测序及同源性分析,得到的蛋白编码基因可能与朊蛋白存在相互作用,其作用可能与疯牛病发病机制有关。

朊蛋白(prp23-231)酵母双杂交诱饵载体的构建及其自激活作用的检测

PCR扩增小鼠朊蛋白(prp23-231)基因,克隆入诱饵载体pSos,将重组质粒与对照质粒共转化酵母菌cdc25H,成功地构建了小鼠朊蛋白(prp23-231)酵母双杂交诱饵载体pSos-prp23-231,并证实该段基因表达的蛋白对酵母菌cdc25H既无毒性,也没有自激活作用。

两面针水提物对酵母朊病毒作用研究

为研究两面针水提物的抗朊病毒作用,借助酵母朊病毒[PSI+]表型系统分析两面针水提物对[PSI+]表型的治疗作用,引入半变性琼脂糖凝胶电泳技术在蛋白水平分析两面针水提物对酵母朊病毒的治疗效果。结果显示,两面针水提物浓度为125mg/mL时,作用酵母朊病毒[PSI+]细胞5d的治愈率为90.2%;并且两面针水提物浓度在25mg/mL～125mg/mL范围内,药物剂量与酵母朊病毒[PSI+]表型治疗效果呈现较好正相关性。蛋白水平试验表明两面针水提物作用酵母朊病毒[PSI+]细胞5d后红色菌落的朊病毒聚集体大小与[psi-]相似。

一种半变性琼脂糖凝胶电泳技术的改良

建立一种经济快捷的利用半变性琼脂糖凝胶电泳技术分析酵母朊病毒迁移特性的方法,在蛋白样品制备过程中采用珠磨破碎法代替文献使用的昂贵的藤黄节杆菌酶酶解法破碎酵母细胞,使用TBE代替文献使用的TAE作为电泳缓冲液,并使用电湿转法代替文献使用的毛细虹吸法转印蛋白。对酵母朊病毒[PSI+]的朊蛋白迁移特性分析结果显示,改良法不影响文献法的准确性,但降低了实验成本,缩短了实验时间。

朊蛋白(prp105-125缺失)酵母双杂交诱饵载体的构建和鉴定

对小鼠朊蛋白(prp105-125缺失)的基因片段进行扩增,并将扩增片段导入诱饵载体pSos中构建酵母双杂交诱饵载体pSos-prp朊蛋白(prp105-125缺失),用重组质粒转化感受态酵母菌cdc25H,检验其表达产物在酵母细胞中有无毒性及自激活作用。序列分析结果表明,该试验成功构建了小鼠朊蛋白(prp105-125缺失)酵母双杂交诱饵载体,且该诱饵质粒的表达产物对酵母菌cdc25H既无毒性也无自激活作用。

牛朊蛋白和酵母朊毒体结构域融合蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备

利用DNA重组技术将酵母Ure2p朊蛋白结构域(UPD)基因插入牛朊蛋白(BPrP)表达质粒pET-PrP中,构建原核表达载体pET-PrP-UPD。阳性质粒转化宿主菌BL21(DE3),在IPTG诱导下获得高效表达。Westernblot检测表明表达的重组蛋白与单克隆抗体6H4呈现特异性反应,且纯化的PrP-UPD融合蛋白在体外具有聚集成淀粉样纤维、抵抗蛋白酶K消化等朊毒体的结构特点。利用纯化的PrP-UPD免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合,经克隆和筛选,获得3株稳定分泌抗重组PrP单抗的杂交瘤细胞,分别命名为1G3、3A4、4D1,其中1G3分泌的单抗能识别细胞型牛朊蛋白,其Ig亚类为IgG2b,腹水ELISA效价为1×105,Western blot表明该单抗具有较强的特异性。

白术水提物对酵母朊病毒[PSI^+]治愈作用的定量研究

目的定量研究白术水提物对酵母朊病毒[PSI+]的治愈作用。方法首先用含白术水提物的培养基培养酵母朊病毒[PSI+]阳性菌株,初步评价白术的治愈作用。然后在细胞水平借助影印培养法和蛋白水平上使用半变性琼脂糖凝胶电泳结合蛋白免疫技术进一步验证白术水提物对酵母朊病毒[PSI+]的治愈作用。结果白术水提物作用酵母朊病毒[PSI+]5d后的治愈率为6%。结论白术水提物对酵母朊病毒[PSI+]有一定的治愈作用。

NaF、NaBr、NaI对酵母朊病毒[PSI^+]形成的影响

为研究NaF、NaBr、NaI对酵母朊病毒[PSI+]形成的影响,利用表达融合蛋白GFP-Sup35p酵母朊病毒模型,借助半变性琼脂糖凝胶电泳技术,结合免疫印迹方法在蛋白水平上定量分析NaF、NaBr、NaI对酵母朊病毒[PSI+]形成的影响。结果显示,在细胞表型方面NaF、NaBr诱导出酵母朊病毒[PSI+],且所需浓度分别为0.02、1.0 mol/L;NaI在浓度为0.25 mol/L可以诱导出[PSI+]经盐酸胍治愈后的酵母朊病毒[psi-]。在蛋白水平,NaF、NaBr、NaI盐作用后的[psi-]细胞内Sup35p并没有形成聚集体。

基于酵母的高灵敏度抗朊病毒药物筛选模型建立及应用

建立一种高灵敏度抗朊病毒药物筛选模型研究传统中药的抗朊病毒作用。通过比较五种酵母朊病毒[PSI+]菌株在表型、生长特性和对抗朊病毒化合物敏感性方面的差异,优选出高药物敏感性酵母朊病毒[PSI+]菌株,并引入半变性琼脂糖凝胶电泳技术建立了一种高灵敏度抗朊病毒药物筛选模型;利用该模型研究了20种中药水提物治愈朊病毒的活性,发现淫羊藿和两面针水提物浓度为0.1 g.mL-1时,对酵母朊病毒[PSI+]的5 d治愈率分别为12.5%±3.5%和56.2%±9.1%,蛋白水平实验表明淫羊藿和两面针水提物具有治愈酵母朊病毒[PSI+]作用。

中药水提物对酵母朊病毒[PSI^+]的治愈作用

筛选能够治愈酵母朊病毒[PSI+]的中药,为开发抗朊病毒中药制剂提供依据。采用试管二倍稀释法测定18种中药水提物的最小抑菌浓度,液体治愈法研究中药水提物对酵母朊病毒[PSI+]的治愈作用。结果表明:白芨、五味子水提物质量浓度为125 mg/mL时,对酵母朊病毒[PSI+]均有治愈作用,同时,白芨、五味子水提物作用酵母朊病毒[PSI+]5d的治愈率分别为67.5%和33.2%。

一种研究酵母朊病毒流动性的荧光漂白后恢复技术的改良

为建立一种经济简便的利用荧光漂白后恢复技术检测酵母朊病毒流动性的方法,在参照文献荧光漂白后恢复技术研究酵母朊病毒流动性的基础上,借助表达融合蛋白GFP-Sup35p的酵母朊病毒模型(NGMC),对文献法的样片制备过程进行改良。采用YPAD培养基和价格低廉的普通载玻分别替代文献使用的培养酵母的合成培养基和固定酵母的腔室载玻片。结果表明:改良法在保持文献法准确性的基础上,操作更为简单,极大地降低了实验成本。

基于酵母朊病毒[PSI^+]的两种模型改进研究

为改进基于酵母朊病毒[PSI+]的抗朊病毒药物筛选模型灵敏度和促朊病毒形成条件筛选模型准确度偏低的不足,采用表型分析法研究了盐酸胍、氯化镁对4种酵母朊病毒菌株的表型影响,结果表明:ERG6Δ酵母朊病毒[PSI+]菌株对盐酸胍最为敏感,SSBΔ酵母朊病毒[psi-]菌株对氯化镁最为敏感;ERG6Δ酵母朊病毒[PSI+]菌株适合构建高灵敏度抗朊病毒药物筛选模型,SSBΔ酵母朊病毒[psi-]菌株适合构建高准确度促朊病毒形成条件筛选模型。

定量研究石斛醇提取物对酵母朊病毒的治愈作用

为研究石斛醇提取物的抗朊病毒作用,借助酵母朊病毒[PSI+]表型系统分析石斛醇提取物对酵母朊病毒[PSI+]表型的作用,引入半变性琼脂糖凝胶电泳技术在蛋白质水平分析石斛醇提取物对酵母朊病毒的治疗效果。结果显示,石斛醇提取物浓度在15 g/L时,作用酵母朊病毒[PSI+]细胞5 d的治愈率为5%;并且石斛醇提取物浓度在5~20 g/L范围内时,药物剂量与酵母朊病毒[PSI+]表型治疗效果呈现较好正相关性。蛋白水平试验表明石斛醇提取物作用酵母朊病毒[PSI+]细胞5 d后红色菌落的朊病毒聚集体大小与[psi-]相似。

羟基脲抑制盐酸胍对于酵母朊病毒[PSI^+]的治愈

目的研究细胞分裂与盐酸胍作用下酵母朊病毒[PSI+]聚集体解聚的关系。方法本研究借助重组表达Sup35p-GFP的菌株,采用表型分析方法与半变性琼脂糖凝胶电泳(SDD-AGE)结合蛋白质免疫印迹技术,分析羟基脲抑制细胞分裂情况下对盐酸胍解聚酵母朊病毒聚集体的影响。结果羟基脲抑制细胞分裂的情况下,表型分析的数据显示盐酸胍不能治愈酵母朊病毒[PSI+],蛋白水平的实验数据证实了这一结果,并发现羟基脲的存在使得盐酸胍解聚酵母朊病毒聚集体的能力明显下降。结论暗示着盐酸胍治愈朊病毒[PSI+]是需要细胞进行分裂的。

钩藤提取物对感染朊病毒酵母模型的治疗作用

通过已建立的抗朊病毒药物筛选模型,研究钩藤提物对酵母朊病毒细胞模型的治疗作用。通过在液体培养基中加入钩藤提取物的方式,利用酵母朊病毒[PSI+]表型分析方法和蛋白水平的半变性琼脂糖凝胶电泳技术分析钩藤提取物抗朊病毒的效果。结果显示,钩藤醇提取物对感染朊病毒酵母[PSI+]作用5d后的治愈率为5%,而水提取物没有治疗效果。蛋白水平检测进一步说明钩藤醇提取物具有抗酵母朊病毒的作用。

定量研究菲啶对酵母朊病毒[PSI^+]的治愈作用

为系统研究菲啶对酵母朊病毒的治愈效果,借助表达融合蛋白GFP-Sup35p的酵母朊病毒模型(NGMC),引入半变性琼脂糖凝胶电泳技术和荧光漂白后恢复技术在蛋白和细胞水平定量分析了菲啶对酵母朊病毒的治愈效果。结果表明,蛋白和细胞水平采用的定量分析方法能够精确定量菲啶对酵母朊病毒的治愈作用,菲啶作用酵母朊病毒[PSI+]1~5 d的治愈率分别为0%、0%、51.7%、87.5%和94.4%。另外,菲啶作用酵母朊病毒[PSI+]细胞1~2 d后出现的粉色菌落中朊病毒的聚集状态与[PSI+]相似,而3~5 d后出现的粉色菌落中朊病毒的状态与[psi-]相似。

酵母抗朊病毒药物筛选模型细胞培养条件优选

目的探讨基于酵母的抗朊病毒药物筛选模型在初级筛选时的细胞培养最佳条件。方法通过表型分析的方法探讨了培养基pH值、初始菌液浓度、细胞生长时期3个因素对基于酵母的抗朊病毒药物筛选模型灵敏度的影响。结果培养基pH值能够影响酵母朊病毒[psi-]细胞的颜色表型,pH>7.46时,[psi-]酵母菌落变为白色,但对[PSI+]的聚集状态不造成影响;菌液初始浓度为A600nm=0.02时,相对于A600nm=0.5、A600nm=0.2时的药物治愈率要高几倍到几十倍;处于对数生长期的[PSI+]酵母细胞对药物的敏感性较差,而处于延滞期和稳定期的[PSI+]酵母细胞对药物的敏感性较强。结论酵母抗朊病毒药物筛选模型在初级筛选时的细胞培养最佳条件为pH<6,菌液初始浓度为A600nm=0.02,处于稳定期的酵母细胞。

朊病毒中朊蛋白及朊蛋白现象

朊病毒病是一种由朊病毒侵染动物神经系统并引发神经退行性症状的传染性疾病。朊病毒是由正常朊蛋白PrP^C通过构象转化形成具蛋白酶抗性的异常朊蛋白PrP^Se的病原微生物。最新研究表明，朊蛋白通过构象转变形成新的功能分子的现象在生物界中普遍存在，并与正常生物功能密切相关。通过研究类朊蛋白现象可以有助于揭示朊病毒感染机制以及深化对生物遗传多样性的了解。