yigP——大肠杆菌生长所必需的基因

yigP基因在大肠杆菌基因组上位于辅酶Q生物合成相关基因ubiE和ubiB之间,3者构成一个操纵子。利用温敏质粒pMAK705系统敲除大肠杆菌基因组上的yigP基因后,发现二次重组子内的温敏质粒无法通过高温培养丢失,即染色体上的yigP基因被敲除后,必须依靠质粒上完整的yigP基因才能存活;通过功能回补yigP基因的表达质粒pLac-yigP后,温敏质粒可以丢失;而将yigP基因分段获得的亚克隆回补yigP基因缺陷株,发现其下游367 bp的yigP-P4P2片段足以回补染色体上yigP基因的功能缺陷,从而表明yigP是大肠杆菌生长所必需的基因,且最小功能片段等于甚至小于367 bp。

大肠杆菌yigP基因启动子的定位

在已知大肠杆菌yigP基因的最小功能片段为yigP-P4P2基础上,将该片段装载于无外源启动子的载体质粒上,通过功能回补yigP基因缺陷株JDP14,发现其可以代替温敏质粒,保证大肠杆菌正常生长,推断其包含完整转录单元。RT-PCR结果显示该片段内部有转录产物,即yigP-P4P2片段具有转录独立性。将不同长度的yigP-P4P2亚片段克隆到启动子探针质粒pSP-Z上,通过对重组菌进行蓝白斑筛选及β-半乳糖苷酶活性测定,结果显示pP40V3-Z/JM83和pP40V4-Z/JM83可观测到蓝色菌斑,并检测到较弱的β-半乳糖苷酶活性,由此表明大肠杆菌yigP基因启动子位于该片段上游,下游边界位于引物V4区域内。

大肠杆菌yigP基因转录调控序列的鉴定

【目的】调查yigP基因启动子的活性,并对该转录调控序列进行分析。【方法】以lacZ为报告基因,克隆启动子片段至启动子探针质粒中,通过检测β-半乳糖苷酶活性判断启动子活性,并通过克隆一系列逐步缩短的启动子片段来确定启动子所在区域。利用定点突变技术,对启动子的重要序列进行定点突变,调查其对启动子活性的影响。【结果】确定了yigP基因启动子的区域,鉴定了启动子的-10区和-35区,并发现了启动子上游存在一个负调控序列,对该序列进行了初步的研究显示其中部分序列是这种负调控作用的核心序列。【结论】对yigP基因的转录调控序列进行了鉴定,丰富了我们对基因转录调控的认识。