猪肺炎支原体地方毒株P97-R1基因序列分析及原核表达

为克隆和表达猪肺炎支原体(Myeoplasma hyopneumoniae)地方毒株Z株P97-R1基因,探索不同菌株P97-R1基因的差异及其蛋白作为诊断抗原的可能性。本研究根据GenBank登陆的猪肺炎支原体(Mhp)232株P97基因,使用Primer Permier 5.0和DNAman设计引物,以猪肺炎支原体地方毒株Z株基因组DNA为模板,用PCR方法扩增出了P97-R1基因片段,并将该基因片段连接到T-easy和pET-32a载体上分别进行测序和原核表达。测序结果表明:与参考株232株序列对比分析发现Z株P97-R1区发生了多处碱基突变;经DNAstar软件分析表明Z株包含11个5aa重复序列,232株P97-R1区包含15个5aa重复序列,推测Rl重复序列的差异与菌株毒力强弱有关。Z株P97-R1基因原核表达产物经SDS-PAGE分析,得到了分子量约为30KD的蛋白,经Western-blot鉴定表明该表达蛋白具有免疫原性。这为Mhp的诊断、预防及进一步深入研究奠定了基础。

猪肺炎支原体p97 R1区基因和大肠杆菌LTB基因的重组和表达

本研究从猪肺炎支原体的主要抗原蛋白及其免疫特点出发,将猪肺炎支原体纤毛粘附决定区R1区基因和具有黏膜免疫佐剂作用的大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(the B subunit of heat-labile enterotoxin LTB)基因重组表达,并且单独表达了R1区基因。将扩增的目的片段插入到表达载体pET-28a(+)中,分别构建了两个原核表达质粒pET28a(+)-rLTBR1和pET28a(+)-rR1,诱导表达了两个融合蛋白rLTBR1和rR1。对表达的目的蛋白进行了SDS-PAGE和Western blot检测,结果表明,表达的蛋白为特异的蛋白。本试验为进一步的研究rLTBR1融合蛋白在黏膜免疫方面的作用打下了基础。