稻米中蛋白体的分离纯化及表征

以糙米为原料,建立利用低浓度氢氧化钠从稻米胚乳中分离蛋白体的方法。以蛋白体体积分数为指标,得到蛋白体分离条件为:碱液浓度14 mmol/L、液料比12 mL/g、搅拌时间90 min、超声功率90 W、超声温度35℃和超声时间40 min,蛋白体体积分数达20.10%。再经0.1、5.0μm滤膜过滤及4.0 mol/L氯化钙去除残余淀粉,获得纯化的蛋白体。所得蛋白体呈微球形,有荧光;具有16、22、33、57 ku的蛋白亚基;X-衍射19.9°处显示β-折叠峰;红外1464、1534 cm^(-1)属于AmideⅡ带;拉曼1303、1651 cm^(-1)属于AmideⅢ和AmideⅠ带,均为蛋白质的特征吸收。因此,以低浓度氢氧化钠分离并经微孔滤膜和氯化钙纯化从稻米中获取蛋白体是可行的,这为研究稻米胚乳中蛋白体的结构和性质提供了方法学参考。

棉花黄萎病拮抗蛋白的分离与纯化

从棉花叶组织中分离到的类芽孢杆菌(Paenibacillus)LC105菌株对棉花黄萎病病原菌大丽轮枝菌具有明显的拮抗作用。该菌株发酵液分别用过滤、高压灭菌及有机溶剂处理,初步证明对大丽轮枝菌产生拮抗作用的物质为蛋白质。LC105菌株发酵液经硫酸铵沉淀、DEAE-Sephadex A-50离子交换层析及Sephacryl S-100凝胶层析分离纯化,得到了分子量为27 kDa的抗菌蛋白。

水稻中一种抗真菌蛋白的分离与特性分析

从萌发的水稻种子中分离并纯化了一种能抑制多种病原真菌生长的蛋白（简称为ＲＡＦＰＩ），在马铃薯葡糖琼脂培养基上，２０μｇＲＡＦＰＩ可明显抑制木霉（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）菌丝的生长，此蛋白还具有较广的抗真菌菌谱，其分子量为１６．５９ＫＤ，等电点为８．７，组成成分中富含Ｐｒｏ、ＧｌＸ和Ａｓｘ，经测序得到了其Ｎ端２０个氨基酸序列。

海洋假单胞菌GY-1菌株的抗菌作用及其胞外抗菌蛋白的分离纯化

采用对峙培养法和牛津杯法测定海洋假单胞杆菌(Pseudomonas)GY-1菌株和发酵液的抑菌作用。结果表明:GY-1菌株和发酵液对小麦根腐病菌(Bipolaris sorokiniana)、禾谷镰刀病菌(Fusarium graminearum)、菠菜早疫病菌(Alternaria solania)、斑点落叶病菌(Alternaria alternata)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)和小麦叶枯病菌(Alternaria tenuis Nees)等植物病原真菌有较强的抑制作用。发酵液采用硫酸铵分级沉淀、DEAE Sepharose Fast Flow柱层析、Sephadex G-75凝胶层析,以小麦根腐病菌为指示菌进行活性追踪和SDS-PAGE电泳纯度跟踪检测,纯化出一种对小麦根腐病菌具有明显抗菌作用的抗菌蛋白,其分子质量约为70.9kD。

红树内生细菌AiL3抗菌蛋白的纯化及其防治芒果炭疽病机理研究

本文对红树内生细菌AiL3菌株的抑菌蛋白及其防治芒果炭疽病的效果与防病机理进行了研究。结果表明,AiL3菌株产生的抑菌物质主要为分子量28 kD的抑菌蛋白;60 g.mL 1抑菌蛋白处理芒果9 d后对炭疽病的防治效果达45.1%,与施保克的防治效果(43.6%)相当;抑菌蛋白抑制病原菌菌丝生长,导致菌丝现肿胀、膨大、畸形、细胞膜透性增加、细胞内含物外渗;抑菌蛋白处理后诱导芒果体内过氧化物酶(POD)活性下降,而苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性上升。

高纯度大米蛋白和淀粉的分离提取

高纯度的大米蛋白和大米淀粉可以作为大米综合利用的两个主产品 ,本研究采用碱法将大米蛋白和淀粉分离 ,研究表明最适提取条件是 :NaOH浓度 0 .0 5N、提取 2h。此条件下分离体系不受破坏 ,且大米蛋白的蛋白含量可达94 .0 3% (干基 ) ,蛋白得率 6 3.37% ;大米淀粉中蛋白含量0 .39% (干基 ) ,淀粉得率 4 7.87%。

源于银杏叶片中一个抗真菌蛋白(GAFP-1)的分离、纯化和鉴定

经过 8 0 %饱和度硫酸铵沉淀、几丁质亲和层析和SephadexG 75的凝胶过滤层析 3个步骤 ,从银杏(GinkgoBilobaL )的叶片中纯化获得 1个抗真菌蛋白 ,把它命名为GAFP 1。以SDS PAGE胶为基础进行电泳分析 ,GAFP 1的分子量约为 30kD。氨基酸组分分析显示 ,1mlGAFP 1的甘氨酸、谷氨酸和天冬氨酸残基较其它氨基酸残基多。抑菌分析表明 :1μg或 2 μg的GAFP 1能够抑制水稻纹枯病菌和棉花炭疽病菌菌丝的生长 ,但对水稻稻瘟病菌和小麦纹枯病菌菌丝的生长没有抑制效果。GAFP 1的N 端 10个氨基酸残基为Asp Pro Gly Cys Asn Val Leu Glu Asp Ile ,以这 10个氨基酸残基为基础进行同源性比较发现 ,它与蛋白质数据库中已知的蛋白质没有同源性 ,表明GAFP 1可能是

水稻几丁质酶的原核表达、复性及体外抑菌活性的研究

利用RT-PCR反应,从纹枯菌诱导的水稻叶片cDNA中克隆了1个水稻几丁质酶基因RC7的全长编码序列(ORF)。通过亚克隆方法,RC7与原核表达载体pGEX-4T-1上的GST融合,构建成GST-RC7重组蛋白的原核表达载体pGST-RC7,然后,将其转化到大肠杆菌细胞中。经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,获得了以包涵体形式高效表达的GST-RC7。经过洗涤、溶解(变性)、复性及纯化等处理,包涵体中GST-RC7蛋白得到溶解、复性和纯化。纯化的复性GST-RC7蛋白具有几丁质酶活性。对6种重要作物病原真菌进行体外抑菌活性分析的结果表明,RC7可显著抑制水稻纹枯病菌、小麦纹枯菌、小麦赤霉菌、棉花黄萎菌、烟草赤星菌的菌丝生长,说明RC7可作为上述植物病害抗性基因育种的重要基因。

小红豆抗菌蛋白的分离纯化及其功能活性

研究旨在从小红豆中分离纯化得到一种具有抗菌活性的蛋白,对其部分生物活性进行表征和研究。通过缓冲液抽提(NaAc-HAc,20 mmol/L,pH5.4)、硫酸铵分级沉降、Affi-gel blue gel亲和色谱、Sephadex SP C-25离子交换色谱及Sephadex G-50凝胶过滤色谱进行分离纯化,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析鉴定其相对分子质量,并对其抗真菌活性进行表征。结果表明,从小红豆中分离纯化出的一种抗菌蛋白,经SDS-PAGE鉴定达到电泳纯,且其相对分子质量约为4 kDa,通过纯化的抗菌蛋白对来自茄子、甜瓜及苦瓜的尖孢镰刀菌的抑制实验,证明此抗菌蛋白具有较强的抗真菌活性。从小红豆中分离纯化出的一种分子质量约为4 kDa的抗菌蛋白,其对真菌具有抑制作用,且其抑制率对浓度的依赖性较高。

洋葱伯克氏菌Burkholderia contaminans抗菌蛋白分离纯化及生物学特性分析

洋葱伯克氏菌(Burkholderia contaminans)从杏果实表面分离,实验证明其对果蔬采后多种病原真菌具有较强的抑制作用。为了进一步揭示其抑菌机理,通过菌体裂解、硫酸铵分级盐析、纤维素DE-52阴离子交换柱层析及Sephadex G-100凝胶过滤柱层析,得到一种具有抗菌活性的蛋白。经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)检测结果表明,该蛋白呈单一条带,其分子质量约为17.6kDa。粗提蛋白溶液具有一定热稳定性,在不同pH值条件下稳定,对有机试剂、紫外照射、蛋白酶不敏感。50mg/mL的Tween-80处理粗提液,活性比对照增加了12.5%,对还原剂SDS和二硫苏糖醇敏感。

苹果树腐烂病菌拮抗枯草芽孢杆菌E1R-j抗菌蛋白的分离纯化

【目的】从枯草芽孢杆菌E1R-j菌株的发酵液中分离纯化抗菌蛋白,分析确其对苹果树腐烂病菌菌丝的抑制作用,为更好地利用该菌株防治植物病害和研制生物农药奠定基础。【方法】采用盐酸沉淀法从E1R-j发酵液中提取粗蛋白,并筛选酸沉淀的最佳pH值,然后通过反相柱RESOURCETMRPC、凝胶柱Superdex-75、阴离子交换柱DEAE-Sepharose和脱盐柱层析技术,提取并分离纯化粗蛋白;在粗蛋白分离纯化过程中,以皿内对峙试验测定蛋白的抗菌活性;通过扫描电镜技术,观察抗菌蛋白对病原菌菌丝的抑制作用。【结果】以pH 4.0盐酸沉淀获得的粗蛋白活性最强,抑菌效果最佳。反相柱RESOURCETMRPC获得的活性峰收集物经凝胶柱Superdex-75、阴离子交换柱DEAE-Sepharose和脱盐柱层析后,得到1个对称的活性峰,其收集物经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)检测为单一条带,变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)图谱中显示有2个分子质量相近的条带,表明该抗菌蛋白可能含有2个亚基,2个亚基的分子质量分别为55和60ku,将该活性蛋白命名为EP-1。扫描电镜结果显示,抗菌蛋白EP-1可使苹果树腐烂病菌菌丝出现膨大、弯曲以及原生质外渗等现象。【结论】通过盐酸沉淀及柱层析技术,从枯草芽孢杆菌E1R-j发酵液中分离纯化出一种分子质量为115ku的抗菌蛋白EP-1,其对苹果树腐烂病菌菌丝生长具有明显的抑制和破坏作用。

芝麻菜种子抗菌蛋白的纯化及其抗菌活性

本文旨在从芝麻菜种子中分离纯化得到一种具有抗菌活性的蛋白,并对其抗菌活性进行研究。通过SPSepharose离子交换色谱、Mono S^(TM)5/50GL和Superdex^(TM)75 10/300GL快速蛋白液相色谱进行分离纯化,经Tricine-SDS-PAGE电泳分析;采用纸片扩散法、荧光染色法,对其抗菌活性和稳定性进行研究。结果表明,从芝麻菜种子中纯化一种抗菌蛋白ZSU2,经Tricine-SDS-PAGE电泳鉴定达到电泳纯,相对分子质量约为12 kDa; ZSU2蛋白对小白菜炭疽病菌等12种真菌具有较强的抑制作用,抗菌活性在pH1~13、温度0~100℃稳定,且具有较强的金属阳离子耐受能力;此外,ZSU2蛋白能引起菌丝尖端几丁质积累和细胞膜选择透过性的改变。

米糠蛋白抗氧化肽的制备及初步分离

试验以米糠蛋白为原料,制备米糠蛋白抗氧化肽。以DPPH自由基清除率为指标,采用正交试验,优化碱性蛋白酶酶解米糠蛋白制备抗氧化肽的工艺条件;采用超滤、Sephades G-25柱层析分离纯化米糠蛋白抗氧化肽。试验结果表明,制备米糠蛋白抗氧化肽的最优工艺条件为:酶解温度45℃,pH 9.0,时间60 min,米糠蛋白底物浓度3%,碱性蛋白酶加酶量3 000 U.g-1。在米糠蛋白酶解产物中,Mr≤5 KDa组分的抗氧化活性最强,其对DPPH自由基清除率为68.7%。通过Sephadex G-25凝胶层析柱进一步分离得到4个混合组分,混合组分Ⅱ活性最强,其DPPH自由基清除率为75.83%。

水稻内生枯草芽孢杆菌G87抗菌蛋白的分离纯化及理化特性

【目的】为得到枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)G87的抗菌蛋白,明确其蛋白理化特性。【方法】采用硫酸铵沉淀和柱层析法进行分离纯化。【结果】获得单一抗菌活性蛋白(峰6-2-1),此抗菌蛋白分子量为50.8 kDa,等电点为5.90。经初步分析,抗菌蛋白不含脂,而含有少量(0.62%)糖;其蛋白部分具有脯氨酸或羟脯氨酸,但不含芳香族氨基酸。抗菌蛋白在高温(≥60℃)和较碱(pH>8)环境下活性明显下降,但较抗紫外线、氯仿和胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶。【结论】枯草芽孢杆菌G87的抗菌蛋白为不含芳烃的糖蛋白,对高温和碱性条件敏感,而对蛋白酶类和紫外线等不敏感。

解淀粉芽胞杆菌HRH317抗菌蛋白的分离纯化及其抗菌作用

为探究解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens HRH317菌株所产抗菌蛋白物质对禾谷镰孢菌Fusarium graminearum的抑制机理,采用硫酸铵分级沉淀菌株发酵液,DEAE Sepharose Fast Flow柱和Sephadex G-200柱层析分离纯化抗菌蛋白,聚丙烯酰胺凝胶电泳检测抗菌蛋白分子量;并采用平板计数法和扫描电子显微镜观察病原菌孢子萌发和菌丝生长情况。结果表明,硫酸铵饱和度为50%时HRH317菌株发酵液的抑菌活性最大,抑菌圈直径可达2.02 cm,显著大于其它饱和度处理;2次柱层析可纯化出抗菌蛋白,分子量约为36.0 k D。禾谷镰孢菌经该抗菌蛋白处理后12h,病原菌孢子萌发率为55.8%,显著低于对照,且2-12 h间其孢子萌发率平均下降了57.3%;该抗菌蛋白还可造成病原菌菌丝变细、畸形与扭曲,且末端膨大等现象。表明解淀粉芽胞杆菌HRH317菌株产生的抗菌蛋白对禾谷镰孢菌孢子萌发和菌丝发育具有较强的抑制作用。

吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007抗菌蛋白的分离纯化

对拮抗细菌吡咯伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pyrrocinia)JK-SH007菌株抗菌蛋白进行了初步研究。研究发现,JK-SH007菌株的抗菌粗蛋白对热和蛋白酶K不敏感,碱性环境不利于抑菌蛋白活性的发挥。JK-SH007菌株的无菌发酵滤液经硫酸铵沉淀、透析(3.5kD)、冷丙酮沉淀(-20℃)、Sephadex G-50葡聚糖凝胶分子筛层析及DEAE-Sephadex A-25离子交换层析分离纯化,得到了蛋白组分A-Ⅱ-2,经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测不是单一组分,该复合组分具有明显抑制3种杨树溃疡病病原真菌金黄壳囊孢(Cytospora chrysosperma)、拟茎点霉(Phomopsis macrospore)、七叶树壳梭孢(Fusicoccum aesculi)生长的作用。

桑氏链霉菌KJ07抗菌蛋白的分离纯化及部分特性

【目的】桑氏链霉菌(Streptomyces sampsonii)KJ07对无性阶段的杨树紫纹羽病菌(Rhizoctonia violacea)有较强的拮抗作用。为研究其抗菌物质,对其发酵液中主要抗菌物质进行分离纯化并明确其部分性质。【方法】采用硫酸铵分级沉淀、DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephadex G-50分子筛层析等方法进行分离纯化。【结果】获得单一抗菌活性蛋白,分子量约为28.4 k D。该抗菌蛋白抑菌谱较广,能使R.violacea菌丝畸形,菌丝隔膜不明显,细胞壁及胞内原生质开始降解,并产生黑色物质。稳定性试验显示抗菌蛋白最适温度为25°C,最佳p H为6.0,当温度≥60°C时,抑菌活性下降大于20%,当p H<4.0或≥8.0时,抑菌活性下降大于12%。其活性还受金属阳离子影响,但对蛋白酶K不敏感。利用自动Edman降解法测得抗菌蛋白N端10个氨基酸序列,但通过NCBI BLAST程序未检索到与其相似性较高的已知抗菌蛋白。【结论】推测该抗菌蛋白可能是一种新的蛋白质。

地衣芽孢杆菌SDYT-79抗病物质分离纯化及理化性质分析

[目的]从1株生防细菌地衣芽孢杆菌SDYT-79中分离纯化出抑菌蛋白,并分析其理化性质。[方法]以地衣芽孢杆菌为材料,以不同硫酸铵饱和度确定最佳饱和度,然后通过Sephadex G-75凝胶层析柱分离出抗菌蛋白,经SDS-PAGE测定抗菌蛋白的分子质量,最后通过不同温度、酸碱度、保存时间、蛋白酶分析其稳定性。[结果]确定最佳饱和度为50%,经SephadexG-75层析柱洗脱出2个洗脱峰,峰Ⅰ具有抗菌活性,分子质量为107.931 KD。抗菌蛋白对温度、保存时间蛋白酶均不敏感,同时抗菌蛋白在中性和弱碱性条件下稳定性良好。[结论]抑菌蛋白具有较高的稳定性。

绛红褐链霉菌YSSPG3的鉴定及其抗菌蛋白纯化

从四川碧峰峡撑×绿杂交竹健康植株根际分离到对杂交竹梢枯病菌(Arthrinium phaeospermum)有强拮抗作用的放线菌菌株YSSPG3,该菌株的无菌发酵液对多种真菌和细菌具有抗菌活性。通过对菌株YSSPG3的形态特征、培养特性、生理生化特性、细胞壁组分与16S rDNA序列分析,确定为绛红褐链霉菌(Streptomyces purpeofuscus)。采用硫酸铵沉淀和柱层析法对发酵液中起主要抑菌作用的抗菌物质进行分离纯化,获得单一的抗菌蛋白AMP,分子量为5 075.619 Da,等电点为6.77。抗菌蛋白在温度≥60℃和pH<7,以及紫外线照射时间≥12 h的环境下抑菌活性均明显下降,但受蛋白酶K、胰蛋白酶和氯仿影响不大,无几丁质酶、葡聚糖酶等水解酶活性。利用Edman降解法测定抗菌蛋白N末端25个氨基酸序列,与来自Streptomyces tendae Tü901的chitin-binding protein AFP1的同源性较高,为81.00%。

米糠抗氧化肽的提取和纯化工艺研究

研究了米糠抗氧化肽的提取、分离纯化工艺及氨基酸组成。研究结果显示,米糠抗氧化肽的最佳提取工艺条件为:在pH7.0、温度为55℃、[E]/[S]=12%、底物浓度为8%时,米糠蛋白经AS1.398中性蛋白酶酶解6 h,可获得对超氧阴离子氧化作用的抑制率最高的混合肽;经分子筛层析和离子交换层析,获得含3个肽段的米糠抗氧化混合肽;通过氨基酸组成和含量分析可知该米糠抗氧化混合肽由16种氨基酸组成,人体必需氨基酸含量丰富。