Research on Protoplast Preparation and Regeneration Conditions of Tremella aurantialba

[Objective] This study aimed to explore the protoplast preparation and re- generation conditions of Tremella aurantialba. [Method] Optimal combination of five factors affecting the protoplast preparation and regeneration of Tremella aurantialba was selected by using orthogonal experiment, including enzyme system, culture age, enzymolysis temperature, enzymolysis duration and osmotic stabilizer. [Result] The results showed that there were three release modes of Tremella aurantialba proto- plasts： release from top in the early period of enzymolysis, release from the side and release in situ. The optimal protoplast preparation condition was selecting mycelium cultured in liquid medium for 3 d, for enzymolysis in mixed enzyme solu- tion containing 1% of cellulase ＋1% of snailase ＋1% of lywallzyme at 36 ℃; for 4 h, with 0.6 mol/L sucrose as osmotic stabilizer, and the obtained preparation rate had reached 1.76 ×10^7 protoplasts/ml. The optimal regeneration condition was using mycelium cultured in liquid medium for 5 d, for enzymolysis in enzyme solution con- taining 1.5% of lywallzyme at 33 ℃ for 3 h, with 0.6 mol/L sucrose as osmotic sta- bilizer, and the regeneration rate had reached 0.22%. [Conclusion] This study provid- ed valuable support for protoplast fusion, ultraviolet mutation breeding and genetic engineering research.

光果柱花草转基因毛状根及其原生质体制备体系的建立

光果柱花草(Stylosanthes leiocarpa)是柱花草属(Stylosanthes Sw.)中可用于林果园间作的一个野生种。截至目前,光果柱花草的转基因体系尚未建立。本研究以光果柱花草的子叶节为外植体,比较不同的发根农杆菌菌株与潮霉素B浓度对毛状根诱导率及转基因阳性率的影响。结果发现,以K599为诱导菌株且培养基添加8 mg·L^(-1)潮霉素B为筛选压,是最优的毛状根诱导条件,诱导率达23.33%,阳性率为100%。在此基础上,利用转基因毛状根制备原生质体,结果表明,添加2.5%纤维素酶和2%离析酶,以及8 h的酶解时间为最优条件,原生质体的产量达2.745×10^(5)个·g^(-1),活力为91.02%,制备的原生质体100%为转基因细胞。本研究成功建立了一种发根农杆菌介导的光果柱花草转基因毛状根诱导体系及原生质体制备体系,为后续光果柱花草的基因功能研究奠定了基础。

黑曲霉糖化酶工业菌株CBS 513.88原生质体制备条件的优化

【目的】优化黑曲霉糖化酶工业菌株CBS 513.88原生质体制备条件,促进其基础研究和分子改造。【方法】通过考察酶解液成分与比例、酶解条件、渗透压稳定剂和菌体生长条件对黑曲霉CBS 513.88原生质体制备的影响,优化其制备条件,并通过聚乙二醇介导的原生质体转化方法测试原生质体的转化效率。【结果】适合黑曲霉CBS 513.88原生质体制备的材料为改良ME培养基培养10 h的菌丝,酶解条件为在10 g·L^(-1)溶壁酶Glucanex和10 g·L^(-1)蛋清溶菌酶的破壁酶溶液(pH值5.8)33℃、110 r·min^(-1)酶解1.5 h,渗透压稳定剂为0.7 mol·L^(-1)KCl+0.27 mol·L^(-1)CaCl_(2)。在此制备条件下,原生质体悬液含量最高可达2×10^(7)个·mL^(-1);原生质体再生培养基为添加0.7 mol·L^(-1)KCl的ME培养基,其最大再生率为52%;转化率最高为206个·μg-1 DNA(质粒),阳性率为94.4%。【结论】通过对黑曲霉CBS 513.88原生质体制备条件的优化,建立短时高效的原生质体介导遗传转化体系。

巨大侧耳原生质体制备条件的优化

为优化巨大侧耳原生质体的制备条件,该研究以两株不同温型的巨大侧耳菌株PG46和PG79为材料,采用单因素和正交试验方法对原生质体制备的菌丝体菌龄、稳渗剂种类、溶壁酶浓度、酶解温度和酶解时间进行研究。结果表明:(1)在单因素实验中,巨大侧耳原生质体制备的适宜条件为菌龄5 d,溶壁酶浓度2.5%,0.6 mol·L^(-1)甘露醇,32℃(PG46)或27~35℃(PG79)酶解4 h。(2)正交试验验证并优化了单因素实验结果,组合2(菌龄5 d,溶壁酶浓度2.5%,0.6 mol·L^(-1)的甘露醇,32℃酶解4 h)可同时作为PG46和PG79原生质体制备的最适条件,原生质体产量分别为11.22×10^(6)CFU·mL^(-1)和7.28×10^(6)CFU·mL^(-1)。(3)F-test检验中,各因素对原生质体制备的影响程度依次为菌龄>溶壁酶浓度>酶解温度>酶解时间(PG46),菌龄>酶解时间>酶解温度>溶壁酶浓度(PG79)。综上所述,两株不同温型巨大侧耳菌株的原生质体制备条件基本一致,菌龄对两菌株原生质体得率的影响程度最显著。该研究结果可为后续巨大侧耳的杂交育种、遗传转化、全基因组测序等工作奠定基础,进一步推动巨大侧耳分子遗传学的发展。

油莎豆原生质体制备的组织筛选及条件优化

为高效获得油莎豆原生质体,采用单因素试验方法进行油莎豆原生质体制备的组织部位(幼芽、幼根、幼叶、幼叶鞘、分蘖节和匍匐茎)筛选以及酶解条件(酶组合用量、酶解时间、渗透压稳定剂用量和酶液pH值)优化。结果表明,油莎豆原生质体制备的最佳组织部位为幼嫩的分蘖节;最优酶解条件:酶组合用量为2.0%纤维素酶+0.9%离析酶、酶解时间为6h、渗透压稳定剂甘露醇用量为11%、酶液pH值为6.0。此条件下,0.2 g油莎豆幼嫩分蘖节加至4 mL酶液中,原生质体的产量可达22.91×10^(5)个/g,活力可达90.72%。综上,获得了高效制备油莎豆原生质体的方法,可为后续油莎豆原生质体融合、种质创新以及杂交育种奠定基础。

杏鲍菇原生质体制备、再生及其遗传转化体系的建立

为优化杏鲍菇GIM5.344原生质体的制备、再生条件及建立稳定有效的遗传转化体系,对裂解酶、酶解温度、酶解时间、再生培养基稳渗剂等原生质体制备、再生条件以及潮霉素浓度、聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)介导转化方法进行优化,探究不同原生质体制备、再生条件对原生质体产量和再生率的影响。结果表明:选用溶壁酶1进行酶解效果最佳,当酶解温度30℃、酶解时间2 h、再生培养基稳渗剂为甘露醇时,原生质体的产量可达到7×108CFU/mL,再生率达到0.40%。得到转化子最多的转化方法为固体预培养+双层培养法,即PEG介导转化后在无抗性再生培养基上28℃预培养48 h,然后再添加一层含有30μg/mL潮霉素的培养基进行拟转化子的筛选。所得转化子中的绿色荧光蛋白基因能稳定有效表达。

甘薯叶片原生质体快速制备方法的优化

原生质体由于没有细胞壁,在植物育种、遗传转化以及基础研究中都有极为广泛的用途。常用的酶解法制备原生质体需要的时间较长,缩短原生质体的制备时间对后续的瞬时表达、植物育种等相关实验具有重要意义。本文以甘薯[Dioscorea esculenta(Lour.)Burkill]叶片为材料,通过调整叶片处理方式、酶浓度、酶解时间、酶解温度等条件对原生质体的制备方法进行了优化,旨在建立一种快速制备甘薯原生质体的方法。结果表明:利用优化的原生质体制备方法可将20 h的酶解时间缩短到2 h;优化的条件为撕去甘薯叶片下表皮后再进行酶解,使用含1.8%纤维素酶R-10+0.9%离析酶R-10酶溶液,在28℃条件下酶解,350×g离心力离心。

一株橘绿木霉TR673原生质体的制备、再生及融合研究

从齐齐哈尔市大豆根围土壤中分离得到1株木霉菌株TR673,经分子生物学及形态学鉴定,确定其为橘绿木霉(Trichoderma citrinoviride)。采用崩溃酶对TR673的菌丝体进行裂解制备原生质体,分别采用50℃水浴5 min和紫外线照射(20 W、40 cm)90 s对原生质体进行灭活,再将灭活的原生质体用聚乙二醇融合法进行融合,并对TR673原生质体的制备和再生条件进行了优化。结果表明,用20 g·L^(-1)的崩溃酶对培养16 h的TR673菌丝体酶解(裂解)5 h时,原生质体产量最大,达到1.2×10^(6)个·mL^(-1)。用ZS1培养基对原生质体进行再生培养,其再生率可达12.3%。融合菌株TR673-3的哌珀霉素产量达1282.67 mg·L^(-1),较原始菌株TR673的哌珀霉素产量提高了18.11%。本研究为后续的橘绿木霉基因组的编辑、转化以及其它木霉菌原生质体的制备、再生与融合等实验提供了参考依据。

金线莲一促生真菌原生质体制备和再生研究

从药用植物内生真菌中筛选到对植物生长有显著促进作用的粘帚霉属的一种真菌（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍｓｐ.简称Ｙ菌），以它为出发菌株，进行原生质体制备与再生条件的研究。将培养４８ｈ的Ｙ菌菌丝体经过巯基乙醇处理３０ｍｉｎ，并用１％的纤维素酶和溶壁酶混合液于２８℃酶解３ｈ，原生质体得率可达２．１４Ｘ１０７个／ｍＬ，在含０.５Ｍ的甘露醇为稳渗剂的再生培养基上，其原生质体的再生率可达３．８６ｘ１０４。

细菌原生质体融合育种技术及其应用进展

原生质体融合技术是细菌遗传育种的有效方法之一,发展迅速,应用广泛。文中综述了亲本菌株选择性遗传标记方法、影响原生质体制备与再生因素、原生质体融合方法和条件。介绍了细菌原生质体融合技术在遗传育种中的应用,并展望了细菌原生质体融合技术的发展前景。

粉红粘帚霉67-1菌株原生质体的形成和再生

研究了多种细胞壁降解酶的种类和浓度、酶解时间、菌龄,以及渗透压稳定剂等因素对粉红粘帚霉67-1菌株原生质体形成和再生的影响。结果表明,粉红粘帚霉67-1菌株原生质体形成的适宜条件为:使用溶壁酶(3mg/ml)、蜗牛酶(3mg/ml)、纤维素酶(2mg/ml)的组合酶液酶解时间为2h,菌龄为14h,稳渗剂为NaCl(0·5mol/ml)。在上述条件下,原生质体产量达到9·25×106/ml。将原生质体涂布于含KCl(0·5mol/ml)的再生培养基上,再生率最高。显微观察表明,粉红粘帚霉67-1菌株主要通过顶端和侧位释放原生质体。

生防木霉菌原生质体的制备及再生研究

ACCC 30150是由本实验室筛选的一株对黄瓜枯萎病、青椒疫病等多种土传病害具有较好防治效果的生防木霉菌。为了建立该生防木霉菌的CaCl2/PEG转化体系,对其原生质体制备及再生条件进行了摸索。结果表明,以0.6 M NaCl作为渗透压稳定剂,用PDA平板上培养36 h的微小菌丝接种液体菌丝培养基,菌龄16 h,用20 mg/ml的纤维素酶和蜗牛酶以1∶1的比例混合,按照菌丝重量(g)∶酶液体积(ml)=1∶20的比例,36℃酶解2 h原生质体产量最高。同时,酶解2 h,以CMR1为再生培养基原生质体的再生率最高。

平菇原生质体的高效制备及再生优化条件

以杂优1号平菇为出发菌株,对其原生质体制备、再生的各关键因子及条件进行比较研究,结果表明,其原生质体制备的优化条件为:以0·6mol/LMgSO4为稳渗剂配制浓度为15mg/mL新鲜溶壁酶液,菌丝与酶液比w/V=1mg∶8μL,取培养6d的菌丝200mg,自然pH下28℃小平板酶解6h,原生质体得率可达2·80×107个/mL.原生质体再生实验结果表明,50U/mL链霉素能有效控制平菇原生质体再生的杂菌污染.孟加拉红对平菇原生质体再生具强抑制作用,抑制率达93%.进一步研究证实,0·6mol/L的MgSO4、KCl等无机盐稳渗剂对原生质体制备的得率较高,而0·6mol/L的蔗糖作为稳渗剂的平菇原生质体再生率较高.

原生质体法介导真菌遗传转化的研究进展

原生质体法介导真菌遗传转化体系是实现大规模随机、定点突变和菌种改良的方法之一,为研究真菌致病性和侵染机制奠定了基础。原生质体法构建转化体系的步骤包括原生质体的制备、转化与再生,其中关键是原生质体的制备,通常采用酶解法破除细胞壁获得原生质体,其获得率直接影响转化效率。转化通常借助于聚乙二醇(PEG)介导、电击或限制性内切酶法完成,其中PEG介导的原生质体转化法较传统,技术较成熟;电击法操作较简单;限制性内切酶(REMI)介导的整合转化,因其转化效率较高,可产生大量稳定的转化子,正被越来越多地应用于丝状真菌的遗传转化。

玉米大斑病菌原生质体的制备与再生

以玉米大斑病菌 (Exserohilumturcicum) 0 1 0 9 8为供试菌株 ,研究了菌龄、液体培养基、酶系统、酶解时间、稳渗剂对玉米大斑病菌原生质体制备的影响及稳渗剂对原生质体再生的影响。结果表明制备玉米大斑病菌原生质体适宜的条件为 :Fries液体培养基培养分生孢子 2 4h ,1 %Lywallzyme、 1 %Drislase和 1 %Snailase 3种酶溶液混合使用 ,酶解 5h ,0 7mol/LKCl为稳渗剂 ;原生质体再生以 0

碱性普鲁兰酶产生菌选育和发酵条件的研究

从儿童食品中分离筛选到 1株产碱性普鲁兰酶活性较高的菌株 ,编号为 SX- 1 2 ,初步鉴定为芽孢杆菌 Bacillussp.。研究了 SX- 1 2原生质体制备与再生最佳条件。其原生质体经紫外线诱变处理 ,选育出产碱性普鲁兰酶的高产菌株 SX- 1 2 C67,酶活由出发菌株的 2 .42 U/m L提高到 6.87U/m L ,提高了约 1 .8倍。在此基础上对产酶条件进行了优化 ,优化后的最佳发酵培养基为 :可溶性淀粉 3% ,蛋白胨 1 .0 % ,酵母膏 0 .5% ,K2 HPO40 .2 % ,Mg SO4.7H2 O0 .0 5% ,Mn Cl2 0 .0 0 0 1 % ,最适 p H9.5,最适温度 40℃。初步研究了酶的部分性质 ,酶反应的最适p H、温度分别为 1 0 .0～ 1 0 .5和 55℃。在 55℃反应条件下 ,酶在 p H6.0～ 1 1 .0的范围内都具有一定的活性。 Ca2 +、Mn2 +、Mg2 +等离子是酶的激活剂 ,Zn2 +、Hg2

轮梗霉原生质体的制备

本文比较了酶浓度、菌龄、渗透压稳定剂以及酶解温度和时间等因素对轮梗霉原生质体得率的影响。结果基本获得了制备原生质体的适宜条件:用0.6mol/L甘露醇稳渗剂配制成的4%纤维素酶和0.5%蜗牛酶混合酶,35℃酶解培养了30h的菌丝1.0h,即可得到较高产量的原生质体。对该原生质体进行了再生实验,其再生率约为23.8%。

提高酵母菌原生质体制备与再生的方法研究

研究了提高酵母菌原生质体制备与再生率的技术路线:选用酵母菌对数生长中期,约培养9～12h(A600为0.5～1.0)的细胞,采用1.5%蜗牛酶和1.0%纤维素酶的混合酶液水解去除细胞壁,经特定条件,可获得98%的原生质体制备率,通过分离到含有0.01mol/LCaCl2和15%蔗糖的YEPDS再生培养基上培养,再生率可达95%以上。

杏鲍菇原生质体制备技术的研究

本文详细地探讨了杏鲍菇原生质体制备条件。结果表明:用0.6mol/L的甘露醇配制成质量比为2.5%,pH值为4.5～5的溶壁酶酶液,在酶液量与菌丝体的比值为20:1(V/W),温度30℃,转速为50r/min条件下酶解3h,可得到最高的原生质体得率。其原生质体数可达15.35×107个/ml。本研究为今后进行杏鲍菇原生质体的诱变及融合育种奠定基础。

植物原生质体技术及其应用

原生质体技术是在原生质体分离基础上,进行一系列技术操作,包括原生质体融合、遗传转化、植株再生等。原生质体技术为细胞杂交,新品种培育,及其与有关的细胞、分子和遗传等学科的交叉渗透,提供一种使用范围广、可行性强的技术体系。阐述了植物原生质体的分离培养、遗传转化等关键技术及其应用,认为原生质体技术在高等植物遗传性状的改良及生产实践中有着广阔的应用前景。