一种基于HDR-CRISPR/Cas9技术快速构建重组鸭肠炎病毒的方法的建立

[目的]本研究通过优化试验条件,建立基于HDR-CRISPR/Cas9基因编辑技术快速、准确地将外源基因定向插入鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus, DEV)基因组的方法,为以DEV为载体的重组疫苗的研制奠定基础。[方法]分离并扩繁DEV疫苗株,测定其病毒滴度。根据DEV疫苗株UL26、UL27基因间非编码区序列,设计合成向导RNA(gRNA),经双链退火获得目的片段,通过基因克隆技术将其插入PX459-V2.0载体获得gRNA-Cas9质粒。同时,通过常规基因克隆技术将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因插入PVAX-1载体,构建含有真核表达盒P_(CMV)-EGFP-BGH pA的重组表达质粒。以DEV疫苗株基因组为模板,扩增gRNA上、下游同源臂序列,通过融合PCR将同源臂序列与真核表达盒P_(CMV)-EGFP-BGH pA进行连接并克隆至PUC19载体获得供体质粒PUC19-UP-EGFP-DOWN。采用先转染质粒后感染亲本DEV的策略构建重组病毒rDEV-EGFP,通过控制单一变量法优化重组病毒构建的试验条件,根据不同条件下绿色荧光蚀斑数量确定最佳条件。利用有限稀释法筛选并纯化表达绿色荧光的蚀斑,获得重组病毒rDEV-EGFP,并对其进行遗传稳定性及体外复制能力的评估。[结果]PCR扩增及测序结果显示,成功构建靶向DEV基因组UL27与UL26基因间非编码区序列的gRNA-Cas9质粒及包含EGFP真核表达盒的供体质粒。鸡胚成纤维细胞(chick embryo fibroblast, CEF)中转染gRNA-Cas9及供体质粒后感染DEV,在荧光显微镜下可观察到绿色荧光蚀斑,表明成功利用HDR-CRISPR/Cas9基因编辑技术将EGFP报告基因敲入DEV基因组。优化后的最佳试验条件为:DEV感染复数(MOI)为0.2、gRNA-Cas9质粒与供体DNA转染比例为1∶2、供体DNA的转染形式为DNA片段、转染与感染时间间隔为6 h、重组病毒收取时间为DEV感染后48 h,优化后EGFP报告基因的敲入效率显著提高(P<0.05)。重组病毒rDEV-EGFP在CEF中连续传代15次,EGFP真核表达盒仍稳定整合在UL26与UL27基因之间的非编码区,具有良好的遗传稳定性。生长曲线结果显示,重组病毒rDEV-EGFP在CEF中的复制能力与DEV疫苗株无明显差异,生长趋势一致,具有良好的体外复制能力。[结论]本研究建立了一种基于HDR-CRISPR/Cas9基因编辑技术快速构建重组DEV的方法,成功构建了具有良好遗传稳定性及体外复制能力的重组病毒rDEV-EGFP,为重组DEV载体疫苗候选株的研制提供了理论依据及技术平台。

低频超声辅助静态腌制对鸭肉水分分布及品质特性的影响

为明确不同超声波辅助腌制工艺对鸭肉水分分布及品质特性的影响,该研究通过固定超声频率28 kHz,改变超声波功率(40、120 W)和超声时间(10、20、30 min)来辅助腌制鸭胸肉,并分析其色泽、保水性能、质构特性、水分迁移规律、微观结构、蛋白质氧化、滋味特征和感官品质的变化。结果表明,适当强度的超声波处理有利于改善腌制鸭胸肉的色泽和质地,并提升其保水能力,其中经120 W超声辅助腌制10 min的鸭肉色差值(ΔE)最高(6.46),其蒸煮损失率(17.6%)和离心损失率(15.7%)均为较低值,而硬度和弹性较传统静态腌制组分别降低和升高约42%和39%,并获得最高的感官得分。此外,低场核磁共振结果进一步证实超声辅助腌制(40 W超声10~30 min、120 W超声10 min)提高了鸭肉中不易流动水含量,并降低了自由水含量,但将120 W超声的处理时间增加至20~30 min会导致肌纤维严重收缩,自由水占比增加,并更易诱导蛋白质氧化,降低其食用品质。电子舌结果显示适当强度超声辅助腌制(40 W超声30 min、120 W超声10 min)的鸭肉样品具有相似的滋味特征。综上所述,低频超声处理(28 kHz,120 W,10 min)可较好地提升腌制鸭胸肉的理化品质与感官特性。

山区“稻+鱼+鸭”生态养殖技术

通过稻田的选择、稻田的改造、水稻的种植、稻田养鱼、养鸭形成综合种养模式,该种养模式通过多年的实践形成山区“稻+鱼+鸭”生态养殖技术,该技术能多途径开发食物资源,从而更好地保障国家的食物安全,提供更加丰富多样、营养健康的食物供应,有效提高山区稻田的综合效益。

海南东寨港集约化海鸭养殖对红树植物生长及底栖动物的影响

为探究红树林区集约化海鸭养殖对红树植物生长及底栖动物生存的影响,在海南东寨港集约化海鸭养殖区选取以海莲和角果木为优势种的两个调查区域,并分别对以海莲为优势种的海鸭养殖区内圈养地、圈养地外围、弃养2 a、弃养5 a和未圈养地的海莲幼苗存活率、呼吸根密度、成年植株生长状况和底栖动物以及以角果木为优势种的海鸭养殖区内离圈养地不同距离处角果木成年植株死亡率、幼苗存活率、底栖动物进行了调查。结果表明:集约化海鸭养殖阻碍了红树植物幼苗和呼吸根的更新,严重干扰了红树植物的生存,圈养地底栖动物密度和生物量显著低于其他林地。海南东寨港集约化海鸭养殖对红树林造成了显著的负面影响。

真空低温蒸煮鸭胸肉的水分迁移及风味物质变化规律

为探究鸭胸肉在真空低温蒸煮过程中水分迁移及挥发性风味物质的变化规律,分别将鸭胸肉的中心温度加热至60、65、70、75、80℃,并以100℃加热的鸭胸肉为空白对照,测定不同中心温度下鸭胸肉的水分自由度及挥发性风味物质。结果表明:真空低温蒸煮鸭胸肉烹饪失水率较低,不易流动水占比和感官评分较高。从鸭胸肉中共检出59种挥发性风味物质,低温组中的挥发性风味成分的种类及含量均远高于对照组。利用气味活性值筛选出20种特征挥发性风味物质,对20种特征风味物质进行主成分分析,得到真空低温蒸煮鸭胸肉风味强度评价模型为:F=0.49F_1+0.24F_2+0.13F_3,模型特征性风味强度评价结果与感官评分相关系数为0.89(P<0.05),该模型可应用于真空低温蒸煮鸭胸肉的风味评价。

鸭TLR2在免疫组织和血液中的表达分析及多克隆抗体制备

为研究Toll样受体2(TLR2)在水禽如鸭先天免疫中的作用,利用荧光定量PCR分析dTLR2 mRNA在1~10周龄鸭免疫器官中表达水平以及大肠杆菌、沙门氏菌感染后血液中dTLR2 mRNA表达变化,初步解析dTLR2在鸭抗感染中的可能作用;通过体外表达鸭dTLR2胞外段,并免疫家兔获得特异性抗体以期为鸭dTLR2免疫应答研究提供生物素材。结果表明,dTLR2 mRNA在不同周龄鸭免疫器官中都有表达,脾脏和胸腺组织中,表达量在不同周龄有显著或极显著变化,但在法氏囊组织中,各周龄间表达变化差异不显著;鸭感染大肠杆菌或者沙门氏菌后,第1天及第2天感染组表达量显著高于对照组,但在第3天时,感染组和对照组表达量差异不显著。研究分析dTLR2编码基因,预测胞外区段并设计引物,构建pET28a-TLR2重组表达质粒,重组表达dTLR2-His融合蛋白。经SDS-PAGE检测表明,重组蛋白成功高效表达,分子质量约29 ku。重组蛋白经镍柱纯化并透析后免疫家兔制备抗血清;所获家兔免疫抗血清能特异性的识别重组TLR2蛋白和组织中内源性TLR2蛋白。鸭dTLR2 mRNA组织中表达分析及多克隆抗体的成功制备将为进一步研究dTLR2的生物学功能提供生物素材。

粤北地区鸭源沙门菌分离鉴定及生物学特性研究

为了解粤北地区鸭源沙门菌流行菌株生物学特性,本研究对鉴定的鸭源沙门菌菌株进行了血清型鉴定、毒力基因检测、药敏试验及致病性初步试验。结果显示,病死鸭组织沙门菌分离率为57.14%(16/28);鉴定为鼠伤寒沙门菌占62.5%(10/16),肠炎沙门菌占31.25%(5/16)。分离菌株最少携带了12个毒力基因,最多携带了19个毒力基因。分离菌株对阿莫西林、青霉素、罗红霉素等耐药率超过90%,对多西环素、大观霉素、环丙沙星、阿米卡星等较为敏感,所有菌株呈多重耐药。分离菌株可导致小鼠发病和部分死亡。研究结果表明,沙门菌在粤北地区发病肉鸭中有较高感染率,流行的优势血清型为鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌,流行菌株普遍存在多重耐药性且具有一定的致病性。

SNPs分子标记在地方品种鸭鉴定中的应用

为建立利用分子标记鉴定高邮鸭等优异地方品种资源的方法,研究在全基因组范围内比较分析高邮鸭、绍兴鸭、建昌鸭、北京鸭等多个地方品种鸭遗传变异信息,筛选高邮鸭、绍兴鸭、建昌鸭品种特异性SNPs分子标记组合,基于贝叶斯定理计算SNPs分子标记组合鉴定概率,建立地方鸭品种鉴定方法。结果显示:获得高邮鸭、绍兴鸭、建昌鸭品种特异性SNPs分子标记数分别为7个、8个和6个,针对上述SNPs位点分别设计引物,共21对引物,选用不同引物组合,经PCR反应和测序鉴别鸭品种,鉴定准确率100%,利用贝叶斯公式计算品种内任意基因型及其组合的鉴定准确概率,其中任意对基因型鉴定准确概率最低为71.94%。综上所述,研究成功筛选到高邮鸭、绍兴鸭、建昌鸭特异性分子标记,并建立操作简便、准确性高的品种鉴定方法,为地方鸭种质资源鉴定提供可靠的分子鉴定手段。

鸭疫里默氏菌感染对鸭生长发育及肠黏膜屏障功能的影响

为了为鸭疫里默氏菌与机体的相互作用及作用机制研究提供基础数据,以雏鸭为研究对象,开展鸭人工感染鸭疫里默氏菌试验,分别测定感染组和对照组1、2、3、5、9、14 d等不同时间段的体质量、小肠各肠段的长度以及血浆中内毒素和血清中乳酸脱氢酶含量;荧光定量PCR法检测肠黏膜屏障功能相关基因MUC2和MYLK的表达量,探讨鸭疫里默氏菌感染对鸭生长发育和肠黏膜屏障功能的影响。结果表明,与对照组相比,感染组5、9 d体质量显著降低;感染鸭疫里默氏菌5 d十二指肠和空肠的长度显著降低;感染鸭疫里默氏菌1 d血浆中内毒素和血清中乳酸脱氢酶的含量均显著增加;鸭人工感染鸭疫里默氏菌的MUC2和MYLK表达量在十二指肠和空肠主要表现为下调,而在回肠MUC2的表达量表现为先下降再上调,MYLK的表达量表现为先下调再恢复至对照水平。综上,鸭人工感染鸭疫里默氏菌会减缓鸭的体质量增长和小肠生长,引起鸭的肠黏膜屏障功能相关基因的表达发生变化。

鸭疫里默氏菌噬菌体宿主谱的拓宽

为建立一种拓宽鸭疫里默氏菌噬菌体噬菌谱的方法,将6株噬菌体混合液分别与6株宿主菌、18株多重耐药鸭疫里默氏菌(不能被6株噬菌体中的任何1株裂解)培养,收获培养液中的噬菌体,混合后同样进行30次传代。噬斑分析法测定30代混合液及混合液中单一噬菌体的噬菌谱。结果表明,30代噬菌体混合液可裂解79.2%(19/24)的鸭疫里默氏菌试验菌株;30代噬菌体混合液中分离出的单一噬菌体能裂解的试验菌株数量为2~9株;裂解数最多的5株单一噬菌体,以各自宿主菌传代10次,噬菌谱没有发生变化;将裂解谱互补的单一噬菌体混合,4株噬菌体即可裂解19株试验菌株,与30代噬菌体混合液相同。说明建立的方法可以拓宽噬菌体混合液、单一噬菌体的噬菌谱,为噬菌体鸡尾酒制剂的毒株选择奠定了基础。

娄门鸭胸肌性状相关指标的全基因组关联分析

为寻找与鸭胸肌性状相关的候选基因,鉴定鸭胸肌性状相关分子标记,试验以199只娄门鸭为试验材料,采集血液提取DNA,用基因组重测序方法进行基因分型,利用PLINK 1.90对分型结果进行质控后,采用rMVP软件中的FarmCPU模型对SNPs(Single nucleo⁃tide polymorphisims)与胸宽、胸深、胸肌重和胸肌率4个性状指标做GWAS分析,定位出显著位点。结果显示:与胸宽相关的SNPs位点有4个,位于1、11、18号染色体上;与胸肌重相关的SNPs位点有2个,位于2、3号染色体上;与胸肌率相关的SNPs位点有2个,位于2号染色体上。通过基因功能注释,这些位点对应的胸肌性状候选基因有8个,分别是LOC119715526、RLBP1、ABHD2、KYAT1、SPOUT1、LOC101800569、EVA1A和NOL4。研究表明,在不同染色体上共鉴定到8个与胸肌性状显著相关的SNPs位点,这些位点共涉及8个候选基因。

鸭坦布苏病毒非结构蛋白亚细胞定位及其在IFN-β信号通路中的作用

【目的】探究鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)非结构蛋白的亚细胞定位及其在β-干扰素(IFN-β)信号通路中的作用。【方法】通过RT-PCR法扩增DTMUV的7个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)基因,将其克隆至真核表达载体pCAGGS-HA,构建重组真核表达质粒,并分别转染至HEK-293T细胞,通过Western blotting检测蛋白表达;利用间接免疫荧光试验检测非结构蛋白的亚细胞定位情况,通过双荧光素酶报告试验研究DTMUV的非结构蛋白对鸭源IFN-β启动子活性的影响。【结果】试验成功构建DTMUV的7个非结构蛋白带HA标签的真核表达质粒。Western blotting结果显示,真核表达非结构蛋白均正常表达,NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5蛋白分子质量大小分别为38、25、14.4、68、13.9、28和100 ku。间接免疫荧光试验结果显示,7个非结构蛋白在细胞内的表达形态不一,主要定位在细胞浆中。双荧光素酶报告试验结果表明,与对照组相比,过表达NS2B和NS4B蛋白后,鸭源IFN-β启动子活性极显著降低(P<0.01)。【结论】本研究成功构建了DTMUV的7个非结构蛋白的真核表达质粒,非结构蛋白主要表达于细胞浆中,其中NS2B和NS4B蛋白具有颉颃IFN-β活性的功能。试验结果为DTMUV的免疫逃逸研究提供了一定的理论依据,并为深入探究DTMUV在宿主天然免疫信号通路中的作用机制提供了试验材料。

安徽地区新型鸭呼肠孤病毒的分离鉴定及其σC基因序列分析

为掌握新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)的最新流行特征,本研究收集安徽某地区鸭场出现肝组织肿胀、出血等临床症状的25份雏鸭肝脏及脾脏样品,利用RT-PCR方法检测NDRV。将RT-PCR检测为阳性的病料样品接种SPF鸡胚分离病毒,收获第3代尿囊液进行PCR检测及病毒纯净性鉴定;同时对NDRV分离株的全长σC基因进行克隆并测序,将测序所得的分离株σC基因序列与GenBank中登录的21株禽源呼肠孤病毒参考株的相应基因序列及推导氨基酸序列进行相似性比对分析,利用Mega 7.0软件构建分离株基于σC基因的系统进化树,并进行σC基因编码氨基酸序列的突变分析。将分离株接种Vero细胞观察其体外培养特性,感染雏鸭进行致病性试验。结果显示,25份病料样品中检出3份NDRV阳性样品,将阳性病料样品接种鸡胚3 d内,鸡胚全部死亡,并伴有水肿、严重充血等现象;病毒纯净性试验结果显示,病料样品仅NDRV呈阳性,其他病原如鸭甲型肝炎病毒(DHV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)、禽呼肠孤病毒(ARV)、番鸭呼肠孤病毒(MDRV)、H9亚型禽流感病毒(H9N2 AIV)及禽腺病毒(FAdV)均为阴性。将3株分离株经测序分析,结果显示,其目的基因序列完全一致,为同一株病毒,并将其命名为NDRV AH株。对NDRV AH株σC基因进行序列相似性分析发现,NDRV AH株与其他NDRV参考株σC核苷酸序列的相似性为89.5%~99.0%,氨基酸序列的相似性为85.3%~98.9%。σC基因的遗传演化结果显示,NDRV AH株属于基因2型。σC氨基酸比对分析结果显示,与灭活疫苗TH11株(KC493571.1)相比,NDRV AH株aa67、aa93、aa100、aa132、aa151、aa158、aa212、aa253和aa298均发生了突变。将该分离株接种Vero细胞,可观察到细胞出现形态圆缩、细胞核聚集等细胞病变。致病性试验结果显示,感染雏鸭死亡率为40%,剖检发现雏鸭肾脏、肝脏出血,脾脏肿大,有轻微坏死灶或大面积坏死灶,有些脾脏质地较硬。可见大面积坏死灶。本研究揭示了NDRV在我国安徽地区的分子流行病学特征,为变异株疫苗研发奠定了基础,对NDRV感染的防治具有重要意义。

鸭源A型鹦鹉热衣原体的分离鉴定

目的对疑似鹦鹉热衣原体感染鸭进行检测、病原分离培养和基因型鉴定。方法从山东某鸭场采集病鸭肺脏,进行衣原体荧光PCR检测;将阳性样本匀浆和无菌处理后,接种L929细胞,连续传代培养,通过Giemsa染色和电子显微镜观察细胞内衣原体包涵体的形成;提取分离株DNA并测序,分析16S rRNA、16-23S IGS和ompA基因序列进行种属鉴定和基因分型。结果成功分离到1株鸭源鹦鹉热衣原体,基因型鉴定为A型。结论鸭源A型鹦鹉热衣原体的分离鉴定扩大了对A型菌株感染宿主范围的认识,为其生物学特性、致病性和防控技术及公共卫生等相关研究提供基础资料。

鸭精液细管法冷冻保存及解冻程序的建立

试验以BPSE为鸭精液稀释液,探讨细管法冷冻、保存及解冻技术对鸭精液冷冻、解冻后活力、活率及受精率等的影响。比较不同体积分数的甘油(GL)、二甲基亚砜(DMSO)、二甲基乙酰胺(DMA)3种冷冻保护剂在4℃平衡不同时间对鸭精液活力的影响以及不同解冻条件和不同保存时间(1、30、365 d)对鸭精液活力和活率的影响,且评价冷冻后鸭精液与新鲜鸭精液(CK)的受精率和孵化率差异。结果表明,在6%DMA中平衡45 min和8%DMA中平衡30 min冷冻,解冻后的鸭精子活力较好,分别为0.416和0.415,二者间无显著差异;采用37℃30 s解冻后的鸭精液活率为57.18%,显著高于4℃3 min解冻后的精液活率(45.28%);在液氮中保存1、30、365 d,解冻后鸭精液的活力和活率差异均不显著;冷冻精液解冻后的受精率为37.73%,显著低于对照组的受精率(93.24%);冷冻鸭精液解冻后的孵化率为84.79%,显著低于对照组的孵化率(92.19%)。研究建立的在8%DMA中平衡30 min的细管法可用于鸭精液的冷冻保存,37℃解冻30 s可用于鸭精液的解冻。

响应面法优化芷江鸭美拉德风味增益工艺

为优化芷江鸭休闲产品的风味,以芷江鸭鸭胸肉为原料,耦合原位美拉德反应,在工艺耦合位点、美拉德反应体系基料种类及添加量的单因素试验的基础上采用响应面设计,以反应体系吸光度为指标,对其工艺参数进行优化。结果表明原位美拉德风味增益的最佳工艺条件为:蛋氨酸0.06%,半胱氨酸0.07%,木糖0.4%,最佳耦合位点为炒制。此条件下美拉德反应体系吸光值为0.783,验证实际吸光值为0.780,感官综合评分可达89.65分。

鸭甲型肝炎病毒3型信阳株的分离鉴定及遗传演化分析

为了解信阳地区鸭甲型肝炎病毒3型的遗传变异特性,对信阳市发生疑似肝炎的金定雏鸭进行9种常见病毒PCR/RT-PCR检测,同时采集病鸭肝脏组织无菌处理后,尿囊腔接种10日龄SPF鸭胚进行病毒分离,并对分离毒株进行全基因组和VP1基因序列分析。结果:成功分离到1株鸭甲型肝炎病毒3型(DHAV3),命名为HNXY23;接种病毒的鸭胚发育不良,死亡胚体全身呈出血水肿;序列比对和系统发育树表明,分离株HNXY23属于DHAV3 GⅠ基因型,与2022年分离株HB-1、HZ-1、HZ-2和HZ-3亲缘关系较近;利用DNAMAN软件比对31株DHAV3 VP1氨基酸位点变异情况,发现在184、187、195、206和209位这5个氨基酸位点有较为明显的变化差异。本研究结果丰富了信阳地区DHAV3的分子流行病学资料,为进一步研究DHAV3的致病机制奠定了基础。

鸭短喙侏儒综合征亚单位疫苗安全性及免疫效果评价

旨在评价鸭短喙侏儒综合征(SBDS)亚单位疫苗(rBac-JS01 VP2株)的免疫效果。将40只产蛋母鸭和4只成年公鸭随机分成2组,每组产蛋母鸭20只和成年公鸭2只,试验组母鸭经颈背侧皮下注射疫苗0.5 mL,阴性对照组母鸭经颈背侧皮下注射PBS 0.5 mL。免疫后2、4和6个月,分别收集各组种鸭鸭蛋并人工孵化,每个阶段任意选择1日龄健康的公、母雏鸭各20只进行SBDS-JS01毒株攻毒,记录攻毒后雏鸭体重和发病情况,并在攻毒后第3、5、7、14、21天采集雏鸭肛拭子检测排毒情况,每组随机剖检2只雏鸭,观察组织病理变化,PCR检测各组病毒分布情况;免疫后2、4、6个月,采集产蛋鸭血液并分离血清,收集鸭蛋并提取、纯化卵黄抗体,采用SBDS-JS01株测定病毒中和抗体效价。结果显示:种鸭免疫后2、4、6个月,所孵雏鸭对SBDS-JS01攻毒保护率分别为100%、95%、90%,观察期各时间段内免疫攻毒组与对照组相比,试验鸭的体重无显著性差异(P>0.05),而非免疫攻毒组试验鸭的体重极显著低于其他各组(P<0.01);雏鸭攻毒后,免疫攻毒组在免疫后2个月所孵雏鸭肛拭子检测均呈阴性,观察期内各时间段组织器官病毒分布均低于非免疫攻毒组;疫苗免疫组在免疫后2、4、6个月血清的SBDSJS01中和抗体效价分别为(10.51±1.59)log_(2)、(9.46±1.27)log_(2)、(8.83±1.15)log_(2),卵黄中和抗体效价分别为(10.12±1.46)log_(2)、(9.37±1.06)log_(2)、(8.49±1.21)log_(2);不同时期的血清中和抗体效价和卵黄中和抗体效价基本一致,升降趋势相同,且与被动免疫攻毒保护水平变化具有很好的相关性。提示:制备的SBDS亚单位疫苗安全性高,免疫效果较好,对SBDS病毒可提供持续有效的保护力。

鸭短喙矮小综合征病毒的致弱及免疫效果的评估

为培育出鸭短喙矮小综合征病毒(SBDSV)弱毒株并评价其免疫效果,本研究将强毒SBDSV M15株在番鸭胚成纤维细胞(MDEF)中连续传95代(C95),每代均观察细胞病变(CPE)。结果显示,C1~C4代病毒接种的细胞均无CPE,从C5代开始出现CPE;自C50代以后,每代细胞出现CPE达80%的时间由接种后7 d逐渐缩短为5 d。采用《中国兽药典》附录中方法检测每隔10代病毒的纯净性;将每隔10代的病毒感染MDEF,通过间接免疫荧光试验(IFA)鉴定各代次病毒及测定各代次的病毒滴度(TCID_(50));将各代次病毒分别以不同剂量接种2日龄易感半番鸭,在21 d观察期内观察并记录各组半番鸭的临床症状、计算发病率及死亡率,于观察期结束后,对各组半番鸭称重并测量其喙长、喙宽,计算其喙长宽比等生长发育指标,评估各代次病毒对半番鸭的致病性。纯净性检测结果显示:检测的各代次病毒均无细菌、霉菌、支原体和外源病毒污染;IFA结果显示,感染不同代次SBDSV的MDEF均能被鹅细小病毒单克隆抗体(GPV MAb)识别,出现亮绿色特异性荧光,而阴性对照和其他相关病毒MAb作为一抗的MDEF中均无绿色荧光;病毒滴度测定及致病性试验结果显示,随着传代次数的增加,SBDSV的滴度逐渐升高(10^(2.5)TCID_(50)/0.1 mL~10^(5.5)TCID_(50)/0.1 mL)且趋于稳定的10^(5.5)TCID_(50)/0.1 mL;C10、C30和C50代病毒对雏鸭的致病性均较强,雏鸭均出现了一定的临床症状,生长发育受到影响,且雏鸭的发病率分别为87.5%(7/8)、37.5%(3/8)和25%(2/8),但均无死亡;C70代病毒组仅一只鸭出现体重略轻的症状,至C80代已失去对雏鸭的致病性,将致弱病毒命名为SBDSV MA株,将C80代致弱病毒命名为MA0株。将不同代次的致弱病毒MA0~MA15株均以5×10^(5.5)TCID_(50)分别接种2日龄半番鸭和樱桃谷鸭,观察21 d,评估致弱病毒的安全性。将上述不同代次的致弱病毒均以4×10^(3)TCID_(50)接种2日龄半番鸭,7 d后采血测定各组鸭血清中的中和抗体效价;同时各免疫组以5×10^(4)TCID_(50)的强毒SBDSV M15株攻毒,观察14 d,评估致弱病毒的免疫保护效果。将MA5代病毒在雏半番鸭体内连续盲传5代,评估该病毒的遗传稳定性。结果显示,不同代次致弱病毒(MA0、MA5、MA10、MA15)接种的两种雏鸭均无临床症状且生长发育均良好;各代次致弱病毒接种后7 d全部鸭血清均出现中和抗体,平均抗体效价在3.0Log2以上;攻毒后14 d,各免疫组鸭均无任何临床症状且生长发育良好,与阴性对照组鸭基本一致,且致弱病毒对雏鸭的免疫保护率均达100%;MA5代致弱病毒在雏鸭体内连续盲传5代,每代雏鸭均无任何临床症状,生长发育均正常,且各组实验鸭各器官均未出现剖检病变。上述结果表明,不同代次的SBDSV致弱株均纯净、安全性好、免疫原性和遗传稳定性较强,可作为SBDS弱毒疫苗的候选株,本研究为SBDS活疫苗的研制奠定了良好实验基础。

基于RPA-LFD的鸭星状病毒2型核酸快速可视化检测技术

为建立一种鸭星状病毒2型(DAstV-2)核酸的快速可视化检测方法,本试验基于重组酶聚合酶扩增结合横向侧流层析试纸条(RPA-LFD)技术,以DAstV-2的ORF2基因为检测靶标,设计和筛选适用于DAstV-2核酸检测的RPA引物和匹配探针,并优化反应条件;进一步验证该方法的灵敏性、特异性和准确性。结果显示,筛选获得1对引物和匹配探针适用于DAstV-2核酸的RPA-LFD检测,探针的最佳工作浓度为5μmol/L;建立的RPA-LFD检测方法对DAstV-2核酸的最低检测限为3×10^(1)copies/μL;可特异性检测DAstV-2核酸,对鸭肝炎病毒(DHV)、鹅星状病毒(GAstV)、鸭圆环病毒(DuCV)和鸭瘟病毒(DPV)的检测结果均为阴性;对疑似DAstV-2感染病鸭肝脏组织病毒核酸样本的检测结果显示,建立的RPA-LFD与实时荧光定量PCR检测结果的符合率为100%,且该检测方法更加便捷。本试验结果表明,利用RPA-LFD检测DAstV-2核酸灵敏度高、特异性强、准确性高,操作简单、检测快速,可在38℃恒温条件下15 min内实现DAstV-2核酸的快速可视化检测。