实验性自身免疫性脑脊髓炎动物模型的改良

目的:提取并纯化正常人脑脊髓的髓磷脂碱性蛋白(MBP),鉴定其活性,并用其诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)大鼠模型。方法:以人脑脊髓为原料,通过去脂、酸溶解、CM-52柱层析等步骤提取人MBP,鉴定其纯度后在Wistar大鼠诱导EAE。结果:所提取的MBP具有纯度高、免疫活性好的特点,与抗MBP抗体能特异性结合,并可成功地诱导出EAE动物模型。病理学证实发病大鼠的脑脊髓具有典型的脱髓鞘改变和胶质结节形成。结论:用人MBP在不加百日咳杆菌的条件下,同样可以诱导出EAE,这种动物模型体内的病理学改变与人类的多发性硬化症(MS)更具有相似性,适用于对MS的研究。

灌服碱性髓鞘蛋白对实验性变态反应性脑脊髓炎的抑制作用

从牛脊髓白质中提取碱性髓鞘蛋白（ＭＢＰ）免疫豚鼠建立实验性变态反应性脑脊髓炎（ＥＡＥ）模型，并观察灌服ＭＢＰ对ＥＡＥ发病、临床症状、病理改变以及淋巴细胞体外增殖应答的影响。结果表明：用ＭＢＰ免疫豚鼠可产生典型的ＥＡＥ临床及病理表现；灌服ＭＢＰ组动物在发病、临床分级、病理改变等方面较对照组均有明显减轻，Ｔ－淋巴细胞对ＭＢＰ的反应受到明显的抑制。说明灌服ＭＢＰ可通过使Ｔ－淋巴细胞对ＭＢＰ产生特异性耐受而抑制ＥＡＥ的发生，提示灌服抗原诱导产生耐受的方法有可能作为免疫治疗自身免疫性疾病的途径之一。

补肾固髓片对实验性变态反应性脑脊髓炎动物发病和血中IL-2、IL-6、TNF和MBP的影响

目的 :观察中药补肾固髓片对实验性变态反应性脑脊髓炎 (EAE)的发病及血中 IL- 2、IL - 6、TNF和 MBP的影响。方法 :本实验采用兔脊髓匀浆和完全福氏佐剂制成的抗原 -佐剂乳化液诱导豚鼠 EAE动物模型 ,应用补肾固髓片作为治疗药物 ,以醋酸泼尼松作为对照药物 ,采用放射免疫分析法测定血中 IL-2、IL- 6、TNF和 MBP的水平。结果 :大剂量补肾固髓片能明显抑制 EAE发病 ,并且能减轻其病情 ,同时对血清 IL- 2、IL- 6、TNF和 MBP活性有明显抑制作用 ;醋酸泼尼松组、中剂量补肾固髓片组部分指标与模型组比较有统计学差异 ,小剂量补肾固髓片组各项指标与模型组比较无显著性差异。结论 :大剂量补肾固髓片能抑制 IL- 2、IL- 6、TNF和 MBP的活性 ,调节免疫功能 ,从而抑制 EAE发病 ,疗效与醋酸泼尼松组无显著性差异 ,提示中药补肾固髓片治疗 MS有临床应用价值。

牛MBP诱导BALB/c和C57BL/6小鼠实验性变态性脑脊髓炎样反应的研究

为了进一步研究实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)动物模型,采用从新鲜牛脊髓中提取的MBP免疫诱导非敏感品系BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠,通过对实验动物的症状、中枢神经系统的病理改变及细胞因子水平变化的检测,较成功地建立了C57BL/6、BALB/c小鼠的EAE模型,实验方法稳定可靠。

嗅鞘细胞移植实验性自身免疫性脑脊髓炎后髓鞘碱性蛋白的表达和小胶质细胞的捕获

目的:研究嗅鞘细胞(OECs)移植实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)后髓鞘碱性蛋白(Myelin basic protein,MBP)的表达及小胶质细胞捕获OECs情况。方法:用新生近交系Wistar大鼠嗅球培养出OECs,经荧光染料羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记后注入同系EAE Wistar大鼠侧脑室,免疫组化检测OECs髓鞘碱性蛋白(MBP)、单核巨噬细胞诱导分子1(ED1)和CFSE共表达情况。结果:培养OECs不表达MBP,经侧脑室移植后在EAE大鼠脑内出现多量MBP+CFSE+细胞,同时在大脑广泛区域及血管周围间隙出现多量ED1+CFSE+细胞,与对照组相比差异显著。结论:OECs在EAE环境下表达MBP分子,其抗原能被脑内小胶质细胞或巨噬细胞捕获。

雷公藤内酯醇对Wistar大鼠实验性变态反应性脑脊髓炎的治疗作用

目的:探讨雷公藤内酯醇对大鼠实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)的治疗作用。方法:模型组采用豚鼠髓鞘蛋白和福氏完全佐剂及左旋咪唑诱发大鼠EAE;治疗组在模型组的基础上予以不同剂量雷公藤内酯醇。观察各组的发病情况;HE染色观察病理变化;Loyez氏髓鞘染色法观察髓鞘改变。结果:低剂量组EAE临床症状较模型组轻;高剂量组未出现临床症状;脑和脊髓炎症细胞浸润明显减少。结论:雷公藤内酯醇对EAE有治疗作用并与剂量相关。

MBP刺激下IL-3和IL-4对树突状细胞前体定向分化的影响

目的观察在髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)刺激下,不同细胞因子对树突状细胞(dentriticcell,DC)前体定向分化的影响。方法分离实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)易感性BALB/c小鼠脾脏DC,在体外不同培养条件下与MBP共培养。用流式细胞仪检测DC荧光抗体标记的CD11c和CD8α表达。结果(1)在MBP和粒巨嗜细胞集落刺激因子(GM-CSF)培养条件下,白细胞介素-4(IL-4)能明显刺激DC CD11c表达,IL-4组其平均荧光强度为856.93±12.45,对照组为708.58±21.25,两组比较差异有统计学意义(P<0.01);(2)在GM-CSF和MBP培养条件下,IL-3能明显上调DC CD8α的表达,IL-3组平均荧光强度为7 751.70±296.63,对照组为7 279.17±176.77,两组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论IL-4可进一步促进BALB/c小鼠脾脏DC前体向DC1分化,而IL-3则促进DC前体向DC2分化。

MBP刺激下小鼠DC的定向分化对Th细胞亚型的诱导

目的探讨不同亚群树突状细胞(DC)对初始型T辅助细胞(Th0)分化的影响。方法分离实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)易感性BALB/c小鼠脾脏的DC前体细胞,与髓鞘碱性蛋白(MBP)及重组小鼠白细胞介素-4(IL-4)I、L-3共培养,然后取上述培养的DC与单个核细胞(mononuclear cell,MC)培养,测定培养液上清液中干扰素-γ(IFN-γ)和IL-4水平。结果DC与MC共培养经IL-4刺激后其上清液中IFN-γ水平[(23.8561±3.2675)pg/mL]较IL-3刺激组[(20.8422±3.5225)pg/mL]及对照组[(20.2845±3.1043)pg/mL]明显增高(P<0.05);经IL-3刺激后其上清液中IL-4水平[(10.9457±1.9180)pg/mL]较IL-4刺激组[(9.1826±1.5361)pg/mL]及对照组[(9.2046±1.3261)pg/mL]明显增高(P<0.05)。结论不同亚群DC对Th0细胞分化的影响不同,提示可通过调控DC的分化方向调控Th0细胞的分化。

MBP对PBMC产生IFN-γ和NO的影响

目的探讨T细胞非特异性活化在CNS脱髓鞘性疾病中的作用。方法分离实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)易感性BALB/c小鼠外周血单个核细胞(PBMC),采用体外细胞培养方法在体外与碱性髓鞘蛋白(MBP)共培养,测定培养上清液中IFN-γ、NO水平。结果经MBP刺激的PBMC产生IFN-γ[(43.83±6.06)pg/mL]和NO[(180.76±20.75)μmol/L]明显增加,与对照组产生的IFN-γ[(28.52±2.18)pg/mL]和NO[(95.61±13.09)μmol/L]相比差异有统计学意义(P<0.01)。结论在CNS脱髓鞘性疾病发病过程中,活化的T细胞、单核细胞等分泌致炎细胞因子和其他有害物质增多。

髓素碱性蛋白的提取及实验性过敏性脑脊髓炎动物模型的建立

我们从牛脊髓中提取髓素碱性蛋白(MBP)并进行电泳鉴定,证实与Sigma产品相似;然后用之作为免疫原免疫豚鼠,建立了实验性过敏性脑脊髓炎(EAE)动物模型,并对不同剂量MBP所致的EAE进行比较,选择出制备模型的合适剂量.

髓鞘碱性蛋白Ⅱ的纯化与鉴定

为研究实验性变态反应性神经炎（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌａｌｅｒｇｉｃｎｅｕｒｉｔｉｓ，ＥＮＡ）和格林－巴利综合征（ＧＢＳ）的发病机理，寻找ＧＢＳ的有效诊断、治疗方法，本实验采用反复超速离心、稀盐酸等电点沉淀、ＣＭ－２２弱酸性阳离子交换层析等方法，从牛硬脊膜内马尾神经根中提取到高纯度髓鞘碱性蛋白Ⅱ（ＭｙｅｌｉｎＢａｓｉｃＰｒｏｔｅｉｎⅡ，Ｐ２）。鉴定结果表明，该蛋白的分子量为１５０００，ｐｌ＝９．５，在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ垂直板电泳、ＰＡＧＥ圆盘电泳中显示一条蛋白区带，在双向免疫扩散、微量免疫电泳中，与进口标准抗牛Ｐ２血清之间形成一条沉淀线，ＨＰＬＣ测定氨基酸成份与Ｋａｄ－ｌｕｂｏｗｓｋｉ报告的国外四个实验室测定的结果大致相同，具有诱导ＥＡＮ的生物活性。

MBP的提取、鉴定及EAE模型的建立

本实验通过脱脂、抽滤、酸化等步骤，提取了髓鞘碱性蛋白，对其性质进行了鉴定，结果表明，提取的髓鞘碱性蛋白具有与文献报告结果大致相同的特性。我们应用获得的髓鞘碱性蛋白成功地在豚鼠建立了实验性变态反应性脑脊髓炎模型。

实验性变态反应性脑脊髓炎大鼠视神经内髓鞘碱性蛋白表达的变化

背景脱髓鞘性视神经炎是与多发性硬化（MS）密切相关的一种疾病，发病机制不详，目前相关的基础研究尚少。目的从分子水平揭示髓鞘碱性蛋白（MBP）在实验性变态反应性脑脊髓炎（EAE）大鼠视神经内的表达变化。方法采用随机数字表法将50只清洁级Wistar大鼠分为正常对照组，免疫后8、12、18和25d组。用5只豚鼠以过量麻醉法处死后收集脑脊髓制备匀浆并与完全弗氏佐剂（CFA）等体积混匀后于Wistar大鼠4只脚垫皮下分别一次性注射抗原乳化剂0．5ml，同时于即刻和48h足背皮下分别注射百日咳杆菌0．2ml诱导Wistar大鼠EAE模型，注射当天记为免疫后第0天。造模后观察模型鼠的行为，对各组大鼠进行神经功能评分。在上述相应时间点以过量麻醉法处死大鼠并制作视神经组织切片，经苏木精一伊红染色法观察各组大鼠视神经的组织病理学改变，采用免疫组织化学法和Western blot法观察各组大鼠视神经组织中MBP的表达情况。结果Wistar大鼠免疫后12d左右出现运动功能障碍，神经功能评分开始上升，免疫后18d神经功能评分最高，随后逐渐下降。视神经组织病理学检查结果显示，免疫后12d视神经组织的神经纤维排列不均匀，免疫后18d视神经组织细胞结构紊乱，神经纤维变细小，轴束明显肿胀并有脱髓鞘现象，免疫后25d，异常细胞大量减少。免疫组织化学法检测表明，MBP主要表达于视神经纤维的髓鞘中，免疫后12d视神经组织中MBP阳性染色细胞为（115．75±26．49）个／5个视野，明显低于正常对照组的（167．44±22．49）个／5个视野，差异有统计学意义（t=4．537，P〈0．05），免疫后18dMBP阳性细胞最低，为（75．57±34．54）个／5个视野，与正常对照组比较差异有统计学意义（t=6．362，P〈0．01），免疫后95dMBP阳性细胞数开始回升，但仍明显低于正常对照组，差异有统计学意义（t=4．068，P〈0．05）。Westernblot检测显示，随着免疫时间的延长，MBP／β-actin值在免疫组大鼠视神经组织中的表达逐渐减少，免疫后12d，MBP／β-actin值小于正常对照组，差异有统计学意义（t=4．639，P〈0．05），免疫后18dMBP／β-actin值最低，与正常对照组比较差异有统计学意义（t=8．427，P〈0．01）。结论EAE大鼠视神经组织存在MBP的降解，提示视神经炎是一种视神经的原发性脱髓鞘病变。