BmNPV侵染对家蚕β-N-乙酰葡萄糖苷酶活性及其相关基因转录水平的影响

为了深入解析β-N-乙酰葡萄糖苷酶(GlcNAcases)在病毒感染过程中的作用机制,将家蚕核型多角体病毒(BmNPV)经口感染5龄起家蚕,在感染后3、6、9、12、24 h提取家蚕血淋巴、脂肪体和中肠,采用荧光定量PCR方法检测GlcNAcases基因的表达水平,同时利用GlcNAcases测试盒测定GlcNAcases活性变化情况。结果显示,经口感染BmNPV后,家蚕血淋巴、脂肪体和中肠组织中GlcNAcases活性整体呈现先逐渐升高后急剧降低的趋势;而家蚕机体4个GlcNAcases编码基因的转录水平在不同组织中存在一定差异。在感染BmNPV后3~12 h,血淋巴中BmGlcNAcase1和BmGlcNAcase2的表达量均明显上调,BmGlcNAcase3和BmGlcNAcase4表达量与对照组(未感染)无差异;在感染后24 h,血淋巴中4个GlcNAcases基因表达量均开始下调,且表达量明显低于对照组。脂肪体组织中BmGlcNAcase2和BmGlcNAcase3在感染BmNPV后其表达量呈现先上调后下调的趋势,其中BmGlcNAcase2的表达量在感染BmNPV后3 h就开始上调,BmGlcNAcase3的表达量在9 h才开始上调,BmGlcNAcase1和BmGlcNAcase4的表达量无明显变化。感染BmNPV后,中肠BmGlcNAcase2和BmGlcNAcase4的表达量整体先逐渐上调,增高至一个峰值,随后急剧减弱,表达受到明显抑制;而BmGlcNAcase1和BmGlcNAcase3在感染BmNPV后其表达量呈现下调趋势,表达量逐渐降低。综上,BmGlcNAcase2编码的GlcNAcases在家蚕抵御BmNPV的侵染过程中发挥了一定的免疫防御功能。

水环境和水产品中β-N-甲氨基-L-丙氨酸(BMAA)检测方法和检出情况的研究进展

本文对蓝藻毒素β-N-甲氨基-L-丙氨酸(β-N-methylamino-L-alanine,BMAA)的结构形态、检测方法、环境和食物中的检出情况等方面进行系统综述.研究结果表明,BMAA主要存在3种赋存形态(游离态、溶解结合态、沉淀结合态);环境和食物中的BMAA类目前主要采用经过AQC衍生的LCMS/MS法检测,样品需经形态分离后、采用MCX固相萃取小柱处理.水环境、水产品和藻类保健品中BMAA类的污染已被大量报道.亚洲、北美洲、欧洲的相关环境和食物中均有一定的检出(检出浓度:水样<0.01—25.3μg·L^(-1);藻类<0.01—300μg·g^(-1);非鲨鱼水产品中0.08—115.3μg·g^(-1);藻类保健品中0.04—0.73μg·g^(-1)).BMAA存在生物积累和生物放大的现象,水产品中营养级别越高的生物检出浓度就越高,如鲨鱼类产品中检出浓度高达34—2011μg·g^(-1),需要引起重视.我国目前对BMAA的相关研究还很有限,未来应加强检测方法、现场调查、风险评估等相关方面的研究,以全面了解我国人群对BMAA类物质的暴露风险.

基于模块优化强化大肠杆菌合成乳糖-N-新四糖的研究

乳糖-N-新四糖(lacto-N-neotetraose,LNnT)作为人乳寡糖核心组分之一,在婴幼儿成长发育过程中发挥着重要作用。为寻找高效的LNnT生物合成方法,探究模块优化对大肠杆菌合成LNnT产量的影响,以大肠杆菌BL21(DE3)ΔlacZ为出发菌株,根据合成路径中的关键代谢物质将LNnT合成路径划分为:外源酶所在路径的模块A,UDP-半乳糖合成路径的模块B和UDP-N-乙酰氨基葡萄糖合成路径的模块C。利用不同拷贝数质粒初步优化模块A、B和C的表达强度,当大肠杆菌BL21(DE3)ΔlacZ共表达重组质粒pRSF-lgtA-A.act和pET-galE时,LNnT产量最高,达0.87 g/L。通过CRISPR/Cas9技术敲除setA和ugd强化模块A和模块B,获得的重组菌株E20合成LNnT产量达1.16 g/L。摇瓶发酵条件优化后,重组菌株E20合成LNnT产量达1.28 g/L。在5 L发酵罐中,LNnT分批补料发酵产量达15.53 g/L,发酵过程最高生产强度为0.43 g/(L·h)。模块优化强化大肠杆菌高效合成LNnT有望为人乳寡糖的高效生物合成提供理论基础,进而推进婴幼儿配方食品产业的革新。

朱砂叶螨β-N-乙酰己糖胺酶基因TecHEX3的克隆及在蜕皮发育中的作用

【目的】本研究旨在探明朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus几丁质降解通路中的关键酶β-N-乙酰己糖胺酶基因(TecHEX3)在螨蜕皮发育中的功能,为开发新型安全的防治害螨生物农药奠定基础。【方法】利用PCR克隆朱砂叶螨TecHEX3,并进行生物信息学分析。利用RT-qPCR检测TecHEX3在朱砂叶螨不同发育阶段(卵、幼螨、若螨和成螨)以及饲喂蜕皮激素20-羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone,20E)的若螨中的表达量。通过饲喂法进行朱砂叶螨雌成螨和若螨TecHEX3的RNAi,分析沉默效率,统计并观察朱砂叶螨若螨的死亡率和致死表型。【结果】成功克隆了朱砂叶螨TecHEX3(GenBank登录号:OR413561),其编码蛋白具有典型的20糖苷水解酶家族结构特征;系统发育树表明TecHEX3与二斑叶螨T.urticae TuHEX3的亲缘性最高且均属于β-N-乙酰己糖胺酶Ⅳ型。TecHEX3在朱砂叶螨不同发育阶段都有表达,在成螨期表达量最高;饲喂500 ng/μL的20E对TecHEX3的表达有最好的诱导效果。RNAi结果表明饲喂ds TecHEX3时朱砂叶螨若螨TecHEX3表达量较对照组(饲喂ds EGFP)显著下调81%;沉默TecHEX3导致朱砂叶螨蜕皮困难或蜕皮后形态异常,致死率达40.58%。【结论】TecHEX3参与朱砂叶螨几丁质降解过程,并在朱砂叶螨的蜕皮发育过程中发挥重要作用。

乙二胺-N-丙基改性硅胶的可控键合制备及其在银杏酸脱除中的应用研究

优化了乙二胺-N-丙基键合硅胶(PSA)键合量可控的制备工艺,考察了PSA制备的批次重复性,并进行PSA制备的中试放大实验。采用红外光谱、元素分析及电位滴定法对所制备的PSA进行性能评价,结果表明:在3460 cm^(-1)处出现了N—H伸缩振动峰,在2960 cm^(-1)和2860 cm^(-1)处出现了—CH的不对称和对称伸缩振动峰,708 cm^(-1)处出现了—NH2的变形振动吸收峰,表明乙二胺-N-丙基成功接枝到硅胶表面;随着制备体系中硅烷化试剂比例的增加,碳、氮和氢元素的含量以及电位滴定法得到的离子交换容量均呈现上升趋势,说明乙二胺-N-丙基官能团的键合量逐渐增加。将制备的PSA填充成分离纯化小柱,考察了不同键合量PSA对银杏叶提取物中银杏酸的脱除效率,结果表明:PSA对银杏酸有强吸附能力,可应用于银杏叶提取物中银杏酸的脱除,2^(#)、3^(#)、4^(#)和5^(#)PSA分离纯化柱的最大上样体积分别为21、22、23、24 mL,且脱除效率随乙二胺-N-丙基键合量的增加而升高。

婴配乳粉中2'-岩藻糖基乳糖和乳糖-N-新四糖含量离子色谱法检测

研究了离子色谱法同时测定婴配乳粉中2′-岩藻糖基乳糖和乳糖-N-新四糖的含量及影响因素。采用离子色谱柱分离,脉冲安培检测器检测和外标法定量分析等方法。通过对不同净化方式、酶解处理和洗脱条件等过程进行考察和优化,比较确定色谱条件和前处理条件对分离的影响,并就线性范围进行探讨。结果表明,优化后的方法线性关系良好,R^(2)>0.999;方法精密度好,相对标准偏差(n=7)<2.7%;方法准确度好,2′-岩藻糖基乳糖回收率为95.97%~103.38%,乳糖-N-新四糖回收率为100.09%~104.01%。该方法能对婴配乳粉中的2′-岩藻糖基乳糖和乳糖-N-新四糖同时测定,操作简单,具有良好的准确度和精密度,可为婴配乳粉质量监控方法提供参考。

基于超高效液相色谱-串联质谱同时测定婴幼儿配方乳粉中2′-岩藻糖基乳糖和乳糖-N-新四糖

建立超高效液相色谱-串联质谱法(ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)同时测定婴幼儿配方乳粉中2′-岩藻糖基乳糖(2′-fucosyllactose,2′-FL)和乳糖-N-新四糖(lacto-N-neotetraose,LNnT)。样品经水提取,沉淀法除蛋白、针式水系滤膜净化,以乙腈和10 mmol/L甲酸铵水溶液(含0.1%甲酸,体积分数)为流动相,采用酰胺柱进行梯度洗脱,采用选择反应检测扫描模式(selective reaction monitoring,SRM)测定,外标法定量,稀释法评估溶剂效应、提取后添加法评估基质效应。结果表明,正离子模式下2′-FL和LNnT分别采用加合离子峰[M+NH+4]和[M+H+]较好,梯度条件、流速优化后使得2′-FL和LNnT均能在8 min内完成洗脱,溶剂效应考察发现2′-FL和LNnT存在严重的溶剂效应,但在消除试验中发现在稀释20倍的情形下,50%乙腈甲酸铵水溶液作为净化样液的稀释溶剂可消除影响,线性范围考察发现2′-FL和LNnT线性范围分别为5.0~150.0 ng/mL和2.5~75.0 ng/mL,基质效应考察发现2′-FL和LNnT均不存在基质效应。方法验证表明,2′-FL和LNnT各项精密度正确度参数均满足国标要求,该方法适用于婴幼儿配方乳粉中2′-FL和LNnT的同时测定。

N-甲基-N-芳基丙烯酰胺的合成研究

目的:研究一种高效合成N-甲基-N-芳基丙烯酰胺的方法。方法:2-甲基丙烯酰氯与含各种取代基的芳香胺发生亲核加成反应生成相应的丙烯酰胺,丙烯酰胺在氢化钠存在下与碘甲烷发生取代反应生成N-甲基-N-芳基丙烯酰胺。结果:以中等到良好的产率合成了一系列含各种不同取代基的N-甲基-N-芳基丙烯酰胺。结论:该方法操作简单,产率较高,底物适用范围广。

蛋白质O-连接-N-乙酰葡萄糖胺修饰在心力衰竭中的作用的研究进展

蛋白质O-连接-N-乙酰葡萄糖胺(O-GlcNAc)修饰是细胞内普遍存在的重要蛋白质翻译后修饰,对于细胞生物学功能至关重要。这种翻译后修饰可影响细胞的翻译与转运,对维持和促进正常细胞发挥功能有重要意义。蛋白质O-GlcNAc修饰对心脏组织有重要作用,短期内增加的蛋白质O-GlcNAc对心脏有保护作用,而长期增加的蛋白质O-GlcNAc导致心脏功能障碍。蛋白质O-GlcNAc修饰在心血管疾病中的辅助治疗作用已成为当前研究热点。现就蛋白质O-GlcNAc修饰在心力衰竭中的作用的研究进展进行综述。

基于DMC法的α-氨基酸-N-环内酸酐的绿色合成

针对传统方法合成α-氨基酸-N-环内酸酐(NCAs)毒性大、对环境不友好的问题,以氨基酸为原料,以乙酸锌为催化剂,以碳酸二甲酯(DMC)为环化剂,通过“一锅法”高效环保地合成了L-苯丙氨酸-N-羧基环内酸酐(Phe-NCA)、L-天冬氨酸-4-苄酯-羧基环内酸酐(H-Asp-Obzl-NCA)和Nε-苄氧羰基-L-赖氨酸环内酸酐(Cbz-Lys-NCA)等3种新型NCAs。通过GC-MS、NMR、FT-IR等对其进行定性表征;讨论了反应温度、反应物比例等因素对氨基酸转化率与NCAs产率的影响;并通过对比催化剂乙酸锌在反应前后的XPS和XRD等表征,分析乙酸锌的催化机理。结果表明:反应中氨基酸∶去质子碱∶催化剂的摩尔比为1:1.5:0.2,反应分别在160、120、140℃进行8 h后,去质子氨基酸与DMC在乙酸锌的作用下发生甲氧羰基化反应,进一步关环,Phe-NCA、H-Asp-Obzl-NCA和Cbz-Lys-NCA最佳产率可分别达到55.22%、56.30%和46.46%;乙酸锌的催化机理为Zn^(2+)与DMC中的羰基氧进行配位络合后实现氨基酸靶向甲氧羰基化,促进邻近COO-与羰基碳发生亲核取代,从而实现精准关环,得到NCAs。

以精神症状起病的抗-N-甲基-D-天冬氨酸受体脑炎的临床特征分析

目的分析总结以精神症状起病的抗-N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartate receptor,NMDAR)脑炎的临床特征为临床识别提供策略。方法回顾2018年1月至2020年2月以精神症状起病且疑似自身免疫性脑炎在首都医科大学附属北京安定医院急诊留观及住院的患者62例,经过随访后其中确诊抗NMDAR脑炎18例,精神障碍患者为44例。回顾性统计患者的人口学因素、临床资料、脑脊液及血清抗体、颅脑MRI检查等资料,先后以单因素分析、logistic回归分析研究以精神症状起病的抗NMDAR脑炎患者的临床特征。结果单因素分析结果显示:两组患者在癫痫发作、意识水平下降、不自主运动、言语障碍、自主神经紊乱等5类临床症状中差异有显著性(P<0.05)。二元logistic回归分析结果显示:癫痫发作、不自主运动、自主神经功能紊乱是以精神症状起病的抗NMDAR脑炎相较于急性精神障碍的特征性症状(P<0.05)。结论癫痫发作、不自主运动、自主神经功能紊乱是以精神症状起病的抗NMDAR脑炎患者的特征性临床症状。

N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍复合法构建胃癌前病变气虚血瘀证大鼠模型

目的建立胃癌前病变(PLGC)气虚血瘀证病证结合大鼠模型。方法将30只SD大鼠分为正常对照组(14只)和模型组(16只),模型组采用N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)联合饥饱失常、乙醇灌胃、氨水自由饮用、雷尼替丁饲料喂养五因素复合造模法建立PLGC大鼠模型。观察大鼠表征进行证候判定,检测大鼠体质量、24 h进食量和24 h饮水量,HE染色观察胃组织病理变化。结果与正常对照组比较,模型组大鼠出现活动度减少、倦怠嗜卧、眼球黯红、毛枯黄无泽、大便不成形、唇青紫、舌黯红、尾部瘀点等表征;第6周开始体质量明显下降(P<0.01),24 h进食量和饮水量明显减少(P<0.05,P<0.01);胃黏膜腺体排列紊乱,可见大量杯状细胞,细胞浆嗜碱性,细胞核大、深染、不规则,黏膜肌层浸润破坏。结论MNNG复合造模法可成功复制PLGC气虚血瘀证大鼠模型,本研究可为构建PLGC中医证候模型提供新方法。

乳酰-N-新四糖的生物合成菌株构建及发酵条件研究

乳酰-N-新四糖(lacto-N-neotetraose,LNnT)是人乳寡糖(human milk oligosaccharides,HMOs)中的重要成分之一,已被美国和欧盟的食品药品监督管理局批准作为新资源食品配料添加到食品中。为实现乳酰-N-新四糖底盘菌株的构建和产物的高效合成,构建了含有关键酶基因lgtA、NmlgtB、glmS和galE过表达的重组菌株。将重组菌在(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导下摇瓶发酵培养,利用不同拷贝数的质粒对模块化LNnT合成通路进行组合筛选,结果表明,最佳质粒组合为pET-glmS-galE和pRSF-lgtA-NmlgtB,菌株SA1生产LNnT的产量达到1.168 g/L。进一步地,通过改变培养基种类、诱导温度、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷浓度及诱导时刻来优化发酵条件,结果表明,重组菌株的最佳发酵培养基为DM培养基,诱导温度25℃,IPTG浓度0.2 mmol/L,诱导时间8 h,优化后工程菌SA1摇瓶发酵LNnT的产量为2.50 g/L,比优化前提高了114%。通过3-L发酵罐发酵,LNnT的产量达到了14.25 g/L,是目前报道的最高产量。该研究为LNnT工业化生产提供了方法学思路,为微生物发酵制备人乳寡糖提供了重要的参考价值。

1-羟基-N-(1H-1,2,4-三唑-5-基)-1H-四唑-5-甲酰胺的合成和性能

为制备新型富氮杂环含能化合物,以5-氰基-1-(1H-1,2,4-三唑-3-基)-1H-四唑(1)为原料,经偕胺肟化、重氮化、取代及亲电加成等步骤,合成一种以酰胺键桥联的富氮含能化合物1-羟基-N-(1H-1,2,4-三唑-5-基)-1H-四唑-5-甲酰胺(3);利用核磁共振(NMR)、傅里叶红外光谱(FT-IR)、元素分析(EA)等方法对化合物3进行了结构表征,并通过单晶X-射线衍射分析(SC-XRD)进一步确定了其结构;利用差示扫描量热(DSC)和热重(TG)方法研究了化合物3的热分解过程。结果表明,化合物3初始分解温度为265℃,爆速为8017 m·s^(-1),爆压为23.1 GPa,撞击感度为20 J,摩擦感度为288 N。

3,4,5-三(甲氧基乙氧基乙氧基)-N-炔丙基苯甲酰胺的合成及温度响应性能研究

通过3,4,5-三(甲氧基乙氧基乙氧基)苯甲酸与炔丙基胺的反应,合成了3,4,5-三(甲氧基乙氧基乙氧基)-N-炔丙基苯甲酰胺,用1H NMR谱和ESI-MS确定了产物结构;并研究了三种溶剂(N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃和二氯甲烷)对目标产物产率的影响;用紫外-可见分光光度计研究了产物的温度响应性能。结果表明,采用二氯甲烷为溶剂时,产物的产率最高,为81.36%;产物具有温度响应性,其低临界溶液温度(LCST)随产物浓度的增加而降低。

肠源性毒素三甲胺-N-氧化物在慢性肾脏疾病中的研究进展

肠源性毒素三甲胺-N-氧化物(TMAO)作为人类肠道菌群的重要代谢产物之一,被认为与心脑血管疾病、阿尔茨海默病、慢性肾病和2型糖尿病等疾病相关。其通过促进内皮细胞损伤、炎症反应、氧化应激、斑块形成等参与疾病的发生与发展。该文主要就TMAO与肾损伤相关疾病发生、发展关系的研究进展作一综述,旨在为临床医师及肾病患者探寻更多预防及治疗的可能性。

三甲胺-N-氧化物协同RAS诱导动脉粥样硬化发展机制研究

目的 探究三甲胺-N-氧化物(TMAO)与肾素-血管紧张素系统(RAS)在人脐静脉内皮细胞(HUVECs)炎症中的关系及作用机制。方法 采用分子克隆技术,构建血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)过表达和敲减的HUVECs;TMAO干预上述HUVECs后,检测细胞中炎症因子及细胞增殖、迁移、血管形成能力,并分析细胞中RAS重要组分的表达水平。结果 成功构建了AngⅡ过表达和敲减的HUVECs;AngⅡ过表达促进TMAO调节HUVECs炎症,抑制HUVECs增殖,抑制HUVECs迁移能力,抑制HUVECs血管形成,促进细胞中RAS组分AGT、ACE、AngⅡ、ATR的表达;敲减AngⅡ抑制TMAO调节HUVECs炎症,促进HUVECs增殖,促进HUVECs迁移能力,促进HUVECs细胞的血管形成,抑制细胞中RAS组分AGT、ACE、AngⅡ、ATR的表达。结论 TMAO能够协同RAS诱导HUVECs炎症。

药物中间体5-溴-2-氯-N-环戊胺嘧啶-4-胺的有关物质含量分析方法

建立了5-溴-2-氯-N-环戊胺嘧啶-4-胺高效液相色谱法测定有关物质含量的分析方法。以自身对照,按外标法加校正因子计算有关物质含量。使用Agilent HC-C18色谱柱,流动相为0.1%磷酸和乙腈,梯度洗脱;检测波长240 nm。各杂质在0.025~1.000μg/mL浓度范围内线性关系良好,平均加样回收率在90%~110%,其RSD小于5%。该方法快速、准确,适用于5-溴-2-氯-N-环戊胺嘧啶-4-胺有关物质含量分析方法的检测。

反相超高效液相色谱测定阻聚剂510废液中三(N-亚硝基-N-苯基羟胺)铝盐方法研究

建立一种利用液相色谱法检测阻聚剂510生产废液中主成分三(N-亚硝基-N-苯基羟胺)铝盐含量的方法。通过实验筛选确定了液相色谱最佳工作条件为:C 18色谱柱,流动相为100%乙腈,流速为0.100 mL/min,进样体积1μL,紫外检测波长280 nm,柱温30℃。该方法线性范围为1.2~24.0 mg/L,线性相关系数为0.9999,检出限3.1×10^(-3)mg/L。不同浓度加标回收率在96.2%~103.1%,相对标准偏差0.09%~0.3%。

环保型染料中间体N-氰乙基-N-苄基苯胺的合成研究

近些年,人们的生活水平有了跳跃式的提升,对健康方面的关注度也越来越高。作为与人体长期接触的生活用品,纺织品的环保安全问题逐渐引起各界人士的关注,各个国家对纺织品的有害物质含量的限定也变得越发明确和科学。为了遵循可持续发展战略的要求,生产环保型绿色的燃料产品,本文针对环保型中间体N-氰乙基-N-苄基苯胺的合成进行了多角度分析,希望可以降低该工艺的安全风险等级,提高产品质量,为人们提供更加优质安全的产品。