尖吻蝮蛇小分子多肽对U251荷瘤鼠体内抑制实验研究

目的:研究尖吻蝮蛇小分子多肽对U251荷瘤鼠的体内抑制作用及瘤细胞增殖活性变化,并初步探讨其作用机制。方法:取生长状态良好的U251胶质瘤细胞悬液按1×106个细胞/50μl接种于荷瘤鼠腹腔皮下,待其成瘤后将肿瘤组织块接种于只实验鼠,造模成功的60只大鼠随机分为实验组、顺铂组及空白对照组,于治疗7d后计算瘤体变化,通过光镜、电镜等方法,观察小分子多肽对胶质瘤作用的形态学变化,并应用免疫组织化学方法,检测增殖细胞核抗原(PCNA)的表达,观察瘤细胞增殖变化情况。结果:实验组蛇毒小分子多肽在30μg/kg剂量时对U251胶质瘤细胞有显著抑制作用,60μg/kg剂量抑瘤率可达53.37%。实验组肿瘤内PCNA阳性细胞数量较对照组显著下降。结论:蛇毒小分子多肽能够抑制体内U251胶质瘤细胞的生长;其作用机制可能与诱导脑胶质瘤细胞发生凋亡及抑制肿瘤细胞增殖有关。

广西尖吻蝮蛇毒小分子多肽组分对A2780细胞抑制作用的研究

目的探讨广西尖吻蝮蛇毒小分子多肽组分(K组分)对人卵巢癌细胞株A2780的增殖抑制作用以及作用机制。方法采用MTT法检测K组分对癌细胞株的生长抑制情况;黏附实验观察K组分抗细胞黏附作用;采用AO-EB双荧光染色和流式细胞术检测凋亡的发生。结果 K组分对人卵巢癌细胞株A2780的增殖有抑制作用并呈明显的时-效及量-效关系,能够对抗细胞和FN的黏附。AO-EB双荧光染色和流式细胞术都检测到细胞凋亡。结论 K组分对体外培养的人卵巢癌细胞株A2780的增殖有显著的抑制作用,作用机制可能与抗细胞黏附,诱导细胞凋亡有关。

广西尖吻蝮蛇毒K组分抗血管生成活性研究

目的探讨广西尖吻蝮蛇毒小分子多肽组分(K组分)对血管生成的抑制作用。方法采用噻唑蓝法检测K组分对培养的人脐静脉内皮细胞株ECV304的生长抑制情况,结晶紫法测定K组分对ECV304细胞的黏附抑制作用,鸡胚尿囊实验观察K组分对血管生成的影响。结果 K组分对人脐静脉内皮细胞株ECV304的增殖有抑制作用并呈明显的时-效及量-效关系,能够抑制ECV304细胞与纤维连接蛋白的黏附和鸡胚尿囊血管生成。结论广西尖吻蝮蛇毒K组分对血管生成有抑制作用。

抗尖吻蝮蛇蛇毒金属酶类共同基序IgY抗体的制备与研究

[目的]制备针对尖吻蝮蛇蛇毒金属蛋白酶类共同基序的Ig Y抗体,并对其中和蛇毒活性的作用进行研究。[方法]通过分析尖吻蝮蛇蛇毒各类金属蛋白酶类共有序列,设计合成与其酶活性密切相关且高度保守的抗原肽PT1和PT2;偶联复合物KLH-PT1、KLH-PT2免疫母鸡获得Ig Y抗体。采用ELISA和Western blot等方法对Ig Y效价及与尖吻蝮蛇蛇毒和短尾蝮蛇蛇毒的交叉反应特性进行初步研究;最后通过抗小鼠皮下出血实验对Ig Y中和活性进行评价。[结果]ELISA、Western blot结果表明,抗KLH-PT1、抗尖吻蝮蛇蛇毒Ig Y均可与尖吻蝮蛇蛇毒、短尾蝮蛇蛇毒发生交叉反应且后者显著强于前者;抗KLH-PT2 Ig Y在体外与尖吻蝮蛇蛇毒、短尾蝮蛇蛇毒无明显交叉反应,在体内抗出血实验中却表现出很强的中和毒性作用,并且显著优于前两者。[结论]通过设计金属蛋白酶共有序列抗原肽,制备了能与多种血循型蛇毒交叉反应的Ig Y抗体,这为制备特异、高效、低毒性且广谱的抗出血型蛇毒抗体奠定了基础。

尖吻蝮蛇小分子多肽对人神经胶质瘤细胞系U251的凋亡及bcl-2/bax基因表达和氧化应激的影响

目的:探讨尖吻蝮蛇小分子多肽对人神经胶质瘤细胞系U251的增殖抑制作用及其机制。方法:MTT法检测2.5、5.0和10.0mg/L尖吻蝮蛇小分子多肽对人神经胶质瘤细胞系U251的增殖抑制作用;RT-PCR法检测尖吻蝮蛇小分子多肽对人神经胶质瘤细胞bcl-2和bax基因表达的影响;分光光度法检测胶质瘤细胞中丙二醛(MDA)的含量和超氧化物歧化酶(SOD)的活性。结果:2.5、5.0和10.0 mg/L尖吻蝮蛇小分子多肽对人神经胶质瘤细胞生长抑制率(49.77%、67.65%和76.42%)高于对照组(P<0.001)。当小分子多肽的剂量增加时,bcl-2 mRNA的表达呈逐渐下降趋势,而bax mRNA的表达则呈逐渐升高趋势,bcl-2/bax亦逐渐减小。2.5、5.0和10.0 mg/L组MDA含量高于对照组(P<0.01),且SOD活性低于对照组(P<0.01);5.0和10.0 mg/L组MDA含量高于2.5mg/L组和对照组(P<0.001),10.0 mg/L组SOD活性低于2.5mg/L组和对照组(P<0.001);10.0 mg/L组SOD活性低于5.0、2.5mg/L组和对照组(P<0.01)。结论:尖吻蝮蛇小分子多肽通过氧化应激使bcl-2/bax mRNA表达降低可能是抑制人神经胶质瘤细胞系U251增殖的重要原因之一。

尖吻蝮蛇毒不同蛋白酶水解物的制备及抗氧化活性研究

【目的】研究尖吻蝮(Deinagkistrodon acutus)蛇毒的不同蛋白酶水解产物的制备及抗氧化活性。【方法】分别用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶水解尖吻蝮蛇毒,以水解物的水解度、清除自由基活性、金属离子螯合能力和总还原力作为抗氧化活性比较指标来选出最佳水解蛋白酶,并比较该蛋白酶水解物在超滤后得到的不同分子量组分的抗氧化活性大小。【结果】碱性蛋白酶水解物的清除DPPH自由基活性、亚铁离子螯合能力和总还原力均为最佳;该酶解物经超滤得到的3个组分中,分子量为3~10kDa的组分对DPPH自由基和羟基自由基清除能力最强,分子量大于10kDa的组分的亚铁离子螯合能力和总还原力最强。【结论】尖吻蝮蛇毒的不同蛋白酶水解物均具有抗氧化活性,其中用碱性蛋白酶水解物抗氧化活性较强。

药物引起过敏性休克5例

5例患者分别在使用注射用尖吻蝮蛇血凝酶、注射用骨瓜提取物和鹿瓜多肽注射液几分钟后,出现呼吸困难、胸闷、脸色苍白等一系列症状,停用相关药物,给予对症、支持治疗后,5例患者症状缓解。后5例患者均未再使用可疑药物,也未再出现上述症状。

聚合物纳米粒子对毒素蛋白的抑制性能研究

采用乳液聚合法制备了一系列基于N-异丙基丙烯酰胺(NIPAm)含有不同功能性单体的纳米凝胶粒子(NPs),使用透射电子显微镜和动态光散射仪表征其形貌和分散性能。通过蛋白酶实验和SDS-PAGE电泳实验,筛选对尖吻蝮蛇毒蛋白有抑制作用的功能性纳米粒子。在血清存在的环境中进一步探索了NPs对蛇毒的抑制作用,并采用MTT细胞实验,探究NPs的生物相容性。结果表明,合成的多种NPs分散性良好(PDI<0.1);蛋白酶实验发现,含有N-丙烯酰基苯丙氨酸(Aphe)的poly(NIPAm-Aphe)NPs对尖吻蝮蛇毒的抑制作用较好,可以达到80%;且电泳实验进一步证明了NPs对蛇毒的吸附作用。在血清存在的环境中(<40 mg/mL时),NPs对尖吻蝮蛇毒的抑制作用仍然维持可观水平(50%)。细胞活性实验证明,NPs生物相容性良好,细胞存活率均可达到95%以上,具备作为人工合成抗体的应用潜力。

中草药徐长卿(Cynanchum paniculatum)治疗毒蛇咬伤的分子机制研究

徐长卿(Cynanchum paniculatum)作为一种传统中草药,被广泛应用于毒蛇咬伤治疗,然而其疗效的科学实验证据缺乏,治疗的分子机制也不清楚.本文采用有机溶剂萃取、柱层析及高效液相色谱法(HPLC)相结合,从徐长卿中筛选出和分离得到一个功效组分,经质谱和核磁共振鉴定为丹皮酚原苷.动物活体实验与组织病理切片观察表明,该组分显著地抑制尖吻蝮(Deinagkistrodon acutus)蛇毒引起的出血、水肿及肌肉组织坏死等活性.体外酶活检测显示,丹皮酚原苷可以抑制尖吻蝮蛇毒水解纤维蛋白原活性和PLA2活性.进一步采用分子模拟软件技术,揭示出丹皮酚原苷是通过与蛇毒中主要成分金属蛋白酶和PLA2发生相互作用,从而抑制尖吻蝮蛇毒发挥致伤作用.本研究首次揭示了中草药徐长卿治疗蛇伤的分子机制,为中医治疗毒蛇咬伤使用徐长卿找到了科学实验证据,也为蛇伤药物的研发提供了新的思路.

降纤酶关键质量属性研究

目的:通过对降纤酶鉴别、纯度、分子量、等电点、N端序列、比活性6个方面关键质量属性的表征,为后续标准提高提供依据。方法:采用SDS-PAGE电泳法分析不同来源的蛇毒原料;采用紫外-可见分光光度法、SDS-PAGE电泳法、体积排阻色谱和反相超高效液相色谱法、基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱法、等电聚焦电泳法、“edman”N端测序法以及凝固法和生色底物法对不同企业提供的降纤酶进行测定和分析。结果:不同来源的尖吻蝮蛇蛇毒蛋白组成基本一致,尖吻蝮蛇蛇毒和白眉蝮蛇蛇毒蛋白质组成差异较大。降纤酶对苯甲酰-L-精氨酸甲酯盐酸盐最大吸收波长为247 nm,对苯甲酰-L-精氨酸乙酯盐酸盐最大吸收波长为254 nm,但对苯甲酰-DL-精氨酰对硝基苯胺无水解作用。降纤酶能完全水解纤维蛋白原α肽链,活性受到苯甲基磺酰氟、二硫苏糖醇和对氨基苯甲醚的抑制。尺寸排阻高效液相色谱法降纤酶纯度测定结果高于反向超高效液相色谱法,前者为99.9%,后者为95.4%。SDS-PAGE电泳法测降纤酶完整分子量受标准品线性范围的影响,采用10~250 kDa范围的标准品点拟合,降纤酶完整分子量为(42.1±1.6)kDa;采用10~100 kDa范围的标准品点拟合,降纤酶分子量为(38.4±1.3)kDa。MALDI-TOF-MS法测得降纤酶完整分子量为(33.3±0.5)kDa,脱糖基分子量为(28.8±0.02)kDa。降纤酶pI值在3.0~4.0之间,N端序列为VIGGVECDINEHRFL。凝固法和生色底物法测比活性相关性显著(P<0.01),但凝固法结果高于生色底物法。结论:不同企业提供的降纤酶的6个方面的关键质量属性基本一致。现行降纤酶药品国家标准中鉴别、纯度、分子量等项目有待进一步增修订。