经圆窗膜导入ADNF-9基因防治卡那霉素耳毒性的实验研究

目的:探讨腺伴随病毒(AAV)介导活性依赖性神经营养因子-9(ADNF-9)基因转染对卡那霉素致豚鼠耳毒性的拮抗作用。方法:选用80只白色红目豚鼠,听功能正常,随机分为四组,每组20只,A组(ADNF-9保护组):左耳经圆窗注入ADNF-9后肌注卡那霉素;B组(空载体组):左耳经圆窗注入AAV,后肌注卡那霉素;C组(人工淋巴液组):左耳经圆窗注入人工淋巴液后肌注卡那霉素;D组(空白对照组):仅肌注卡那霉素。卡那霉素均经大腿内侧注射400 mg/(kg·d),共给药6d;停药后6、14d各组均行听性脑干反应(ABR)检测,停药14d后各组处死动物,行耳蜗石蜡病理切片及耳蜗基底膜铺片观察各组豚鼠耳蜗基底膜毛细胞形态学。结果:实验前所有豚鼠的听功能均正常;停药后6、14d的ABR阈值A组为(32.54±5.28)dB和(33.52±2.26)dB;B组为(77.56±4.18)dB和(78.00±5.48)dB;C组为(75.24±6.72)dB和(77.25±4.65)dB;D组为(78.00±3.32)dB和(78.25±3.26)dB。A组停药后6、14d与B组、C组及D组比较有统计学差异(P<0.05)。耳蜗病理切片及基底膜铺片均提示:A组耳蜗螺旋器细胞损害较轻,基底膜板基本完整;其余三组,耳蜗螺旋器毛细胞损害严重,基底膜有不同程度的损害。结论:ADNF-9基因转染可以有效拮抗氨基糖苷类所致豚鼠耳毒性。

NT4-ADNF-9融合基因原核表达载体的构建

目的 构建神经营养素 (NT4 )与活性依赖性神经营养因子 9(ADNF 9)融合基因的原核表达载体pBV2 2 0 /NT4 ADNF 9,为进一步对神经系统退行性疾病基因治疗的研究奠定基础。方法 采用非对称互补引物 /模板法 ,制备两端含有酶切位点的ADNF 9的cDNA ,将其连接到NT的信号肽和前导序列的 3′端 ,组成融合基因NT4 ADNF 9,再将该融合基因亚克隆于原核表达载体pBV2 2 0 ,构建为pBV2 2 0 /NT4 ADNF 9。结果 经DNA测序 ,限制性内切酶酶切等方法证实已成功地将ADNF 9重组到NT4信号肽和前导序列的 3′端 ,并将融合基因亚克隆于pBV2 2 0内。结论 成功构建了NT4与ADNF 9融合基因的原核表达载体pBV2 2 0 /NT4 ADNF 9。

腺伴随病毒介导ADNF-9基因转染对豚鼠卡那霉素致聋的治疗作用

目的:观察包装重组的腺伴随病毒(adeno-associated virus,AAV)r AAV-NT4-ADNF-9对卡拉霉素致聋豚鼠的治疗作用。方法:选用耳廓反射和听性脑干反应(auditory brainstem response,ABR)正常的白色红目豚鼠,在大腿内侧肌肉注射卡那霉素400 mg/(kg·d),连续注射6 d,制备耳聋模型。在全身麻醉的条件下,从豚鼠右耳背侧进路,打开听泡,用微量注射器由圆窗注入r AAV-NT4-ADNF-9 10μL,14 d后取术侧听泡。进行耳蜗毛细胞计数和耳蜗毛细胞的硬铺片,通过相差显微镜观察内耳毛细胞的结构。结果:r AAV-NT4-ADNF-9组治疗后ABR阈值较治疗前明显下降(P<0.05),相差显微镜观察到耳蜗基膜完整,外毛细胞呈点状缺失。而其余3组治疗前后ABR阈值无明显变化,人工淋巴液组与空载体组治疗后毛细胞呈片状缺失,空白对照组则无毛细胞缺失。ADNF组取景框内毛细胞平均数明显高于人工淋巴液对照组及空载体组(P<0.05)。结论:用r AAV-NT4-ADNF-9转染卡那霉素致聋豚鼠耳蜗组织,可促进耳蜗毛细胞修复和再生。

重组腺相关病毒rAAV-NT4-ADNF-9的构建及其对体外培养的大鼠耳蜗组织的转染

目的:包装携载神经营养素(NT4)与活性依赖性神经营养因子-9(ADNF-9)融合基因的重组腺相关病毒rAAV-NT4-ADNF-9,并观察该重组病毒对体外培养的耳蜗组织的转染。方法:使用pSSHG-CMV-NT4-ADNF-9,pGF140和pAAV/Ad 3种质粒共转染293包装细胞,制备ADNF-9重组腺相关病毒(recomb inate adeno-assoc iated virus,rAAV),应用斑点杂交实验检测重组病毒滴度;体外分离培养新生SD大鼠的耳蜗毛细胞;将重组病毒感染体外培养的新生SD大鼠耳蜗毛细胞,于24 h后提取组织行反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)以检测rAAV-NT4-ADNF-9对耳蜗的转染。结果:应用斑点杂交实验检测重组病毒滴度为2×1013cfu/m l,表明成功地构建了重组AAV载体。成功分离培养新生SD大鼠的耳蜗毛细胞后,经RT-PCR反应,琼脂糖凝胶电泳检测结果显示NT4-ADNF-9在耳蜗组织得到了表达。结论:构建的重组病毒rAAV-NT4-ADNF-9,在体外可成功转染耳蜗组织,用于基因治疗的研究。

腺伴随病毒介导的NT4-ADNF-9对Corti器损伤保护的体外研究

目的将携载神经营养素(NT4)与活性依赖性神经营养因子-9(activity-dependent neurotrophicfactor-9,ADNF-9)融合基因的重组腺伴随病毒rAAV-NT4-ADNF-9转染体外培养的耳蜗Corti器,并观察该重组病毒对Corti器损伤的保护作用。方法体外分离培养新生SD大鼠的耳蜗基底膜,应用氨基糖苷类毒性蛋白G-418建立体外Corti器损伤模型,将rAAV-NT4-ADNF-9转染体外培养的新生SD大鼠耳蜗细胞(Corti器),RT-PCR检测NT4-ADNF-9在Corti器的表达,并观察其对体外毛细胞的保护作用。结果成功分离培养了新生SD大鼠的耳蜗基底膜后,经重组腺伴随病毒转染,琼脂糖凝胶电泳检测结果显示NT4-ADNF-9在Corti器得到了表达;rAAV-NT4-ADNF-9保护组毛细胞损伤程度较G-418损伤组明显为轻,而G-418损伤组可见毛细胞大量缺失,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论构建的重组病毒rAAV-NT4-ADNF-9在体外可成功转染Corti器,并对Corti器具有保护作用,可用于基因治疗的研究。

重组腺相关病毒rAAV-NT4-ADNF-9转染大鼠耳蜗组织的体外研究

目的:包装携载神经营养素(NT4)与活性依赖性神经营养因子-9(ADNF-9)融合基因的重组腺相关病毒rAAV-NT4-ADNF-9,并观察该重组病毒对体外培养的耳蜗组织的转染。方法:使用pSSHG-CMV-NT4-ADNF-9、pFG140和pAAV/Ad三种质粒共转染293包装细胞,制备ADNF-9重组腺相关病毒(AAV),应用斑点杂交实验检测重组病毒滴度;体外分离培养新生SD大鼠的耳蜗毛细胞;将重组病毒感染体外培养的新生SD大鼠耳蜗毛细胞,于24h后提取组织行RT-PCR以检测rAAV-NT4-ADNF-9对耳蜗的转染。结果:应用斑点杂交实验检测重组病毒滴度为2×1016cfu/L,表明成功构建了重组AAV载体。成功分离培养新生SD大鼠的耳蜗毛细胞后,经RT-PCR反应,琼脂糖凝胶电泳检测结果显示NT4-ADNF-9在耳蜗组织中得到表达。结论:构建的重组病毒rAAV-NT4-ADNF-9在体外可成功转染耳蜗组织,用于基因治疗的研究。