电针联合阿仑膦酸钠对骨质疏松大鼠Integrinα2/FAK/Runx2通路的影响

目的探讨电针联合阿仑膦酸钠对去卵巢大鼠骨质疏松症的改善作用及对Integrinα2/FAK/Runx2通路调节作用。方法选取30只大鼠随机分为假手术组(6只)及造模组(24只),采用手术切除卵巢法建立骨质疏松症大鼠模型。将造模后的大鼠随机分为骨质疏松模型组、电针治疗组、阿仑膦酸钠组及联合治疗组,每组6只。电针治疗组、阿仑膦酸钠组及联合治疗组分别按照相应干预方法干预8周。通过酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒测定大鼠血清碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(BGP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)-5b、Ⅰ型胶原羧基末端肽(ICIP)、I型胶原氨基端延长肽(PINP)水平;双能X射线测定大鼠股骨骨密度及骨矿物含量;骨生物力学测定仪测定大鼠骨生物力学指标;苏木精-伊红(HE)染色法检查股骨组织病理学变化;实时定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)测定股骨组织Integrinα2、FAK及Runx2 mRNA水平;免疫印记法(Western blot)测定股骨组织Integrinα2、FAK及Runx2蛋白水平。结果与假手术组比较,骨质疏松模型组血清ALP、BGP、TRACP-5b、ICIP、PINP水平显著升高(P<0.05),骨密度、骨矿物含量、最大载荷、最大应力、刚度,股骨组织Integrinα2、FAK及Runx2 mRNA及蛋白水平显著降低(P<0.05);与骨质疏松模型组比较,电针治疗组、阿仑膦酸钠组及联合治疗组血清ALP、BGP、TRACP-5b、ICIP、PINP水平显著降低(P<0.05),骨密度、骨矿物含量、最大载荷、最大应力、刚度,股骨组织Integrinα2、FAK及Runx2 mRNA及蛋白水平显著升高(P<0.05);与电针治疗组及阿仑膦酸钠组比较,联合治疗组血清ALP、BGP、TRACP-5b、ICIP、PINP水平显著降低(P<0.05),骨密度、骨矿物含量、最大载荷、最大应力、刚度,股骨组织Integrinα2、FAK及Runx2 mRNA及蛋白水平显著升高(P<0.05)。结论电针联合阿仑膦酸钠能够显著提高绝经后骨质疏松症大鼠骨密度,抑制骨质疏松病理进展,改善大鼠骨代谢及骨生物力学改变,其机制可能与调节Integrinα2/FAK/Runx2通路有关。

DCLK1激活FAK/PI3K/AKT/mTOR信号通路促进A549细胞的恶性行为

目的探讨双肾上腺素皮质样激酶1(DCLK1)对A549细胞增殖、迁移、侵袭等恶性生物学行为的影响,并探究可能涉及的相关分子机制。方法慢病毒感染法建立稳定表达DCLK1分子的A549细胞系,反转录-聚合酶链技术和蛋白质印记法进行鉴定。CCK-8与平板克隆实验检测过表达DCLK1后细胞增殖能力变化。Transwell实验观察过表达DCLK1对细胞迁移与侵袭能力的影响。癌症基因组图谱(TCGA)数据库分析DCLK1对肺腺癌细胞的调控富集通路,蛋白质印记法进行验证。结果DCLK1在A549细胞中过表达可增加细胞的增殖、迁移与侵袭等能力,而抑制FAK/PI3K/AKT/mTOR信号通路可削弱DCLK1对A549细胞的恶性调控。结论DCLK1通过激活FAK/PI3K/AKT/mTOR信号通路,促进A549细胞的恶性生物学行为。

ABI家族成员3结合蛋白在血管紧张素Ⅱ诱导内皮祖细胞功能障碍中的作用及机制研究

目的探讨ABI家族成员3结合蛋白(ABI family member 3-binding protein,ABI3BP)在血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)诱导内皮祖细胞功能障碍中的作用及机制。方法为探讨ABI3BP在AngⅡ诱导内皮祖细胞功能障碍中的作用,将细胞分为4组,sh-NC组[转染阴性对照短发夹RNA(LV-scramble-shRNA)+磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)]、sh-ABI3BP组[转染ABI3BP shRNA(LV-ABI3BP-shRNA)+PBS]、sh-NC+AngⅡ组(LV-scramble-shRNA+AngⅡ)和sh-ABI3BP+AngⅡ组(LV-ABI3BP-shRNA+AngⅡ)。采用Transwell实验检测细胞迁移能力,黏附实验检测细胞黏附能力,Matrigel检测细胞成管能力,原位末端标记法检测细胞凋亡。Western blot检测整合素β1-黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)-P53信号通路变化情况。结果与sh-NC组比较,sh-NC+AngⅡ组迁移细胞数量、黏附细胞数量、小管形成数量显著降低,细胞凋亡率、整合素β1、磷酸化FAK(p-FAK)/FAK及P53蛋白表达显著增高,差异有统计学意义(P<0.05)。与sh-NC+AngⅡ组比较,sh-ABI3BP+AngⅡ组迁移细胞数量[(88.67±8.33)个vs(62.33±7.37)个]、黏附细胞数量[(104.33±6.03)个vs(68.33±10.05)个]、小管形成数量[(36.33±3.21)个vs(19.33±3.06)个]显著增高,细胞凋亡率、整合素β1、p-FAK/FAK及P53蛋白表达水平显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论AngⅡ可上调ABI3BP表达,敲低ABI3BP基因表达可改善AngⅡ诱导的内皮祖细胞功能障碍,其机制可能与抑制整合素β1-FAK-P53信号通路有关。

PIEZO1影响HaCaT细胞的趋电性迁移

目的伤口中心产生的内源性电场是指导细胞定向迁移促进伤口愈合的重要因子。PIEZO1是机械门控阳离子通道家族成员之一,它参与细胞迁移,影响细胞的趋化迁移,并且受到电压的调节,在伤口愈合过程中发挥重要作用。但PIEZO1是否参与影响电场指导的细胞定向迁移过程尚不清晰,本文以HaCaT细胞为模型探讨PIEZO1及其下游相关蛋白质对细胞趋电性迁移的影响。方法应用活细胞工作站追踪HaCaT细胞在微直流电场中的迁移,使用抑制剂及RNAi技术调控PIEZO1功能和表达,研究PIEZO1对于细胞趋电性迁移的影响;用蛋白质印迹(Western blot)检验细胞的整合素(integrin)β1与FAK磷酸化水平在电场作用下的变化情况,探讨PIEZO1与integrinβ1及FAK等对电场信号的响应及细胞趋电性迁移的影响。结果PIEZO1广谱抑制剂钌红、GsMTx4和RNAi处理显著抑制了HaCaT细胞向正极趋电性迁移的能力;电场和GsMTx4单独作用升高FAK磷酸化和integrinβ1表达,GsMTx4阻止电场进一步升高FAK的磷酸化水平和integrinβ1表达;siRNA干扰PIEZO1表达后显著下调FAK的磷酸化水平,并且电场对FAK磷酸化和integrinβ1表达的促进作用受到抑制;Integrinβ1和FAK的抑制剂使HaCaT细胞的趋电性迁移能力均显著降低。结论PIEZO1参与HaCaT细胞的趋电性迁移,是影响HaCaT细胞趋电性迁移的重要分子之一;抑制integrinβ1和FAK会影响HaCaT细胞的电性迁移;电场信号可能通过PIEZO1介导的信号通路调控integrinβ1的表达和FAK的活化进而影响细胞趋电性迁移。

咖啡因通过FAK/AKT/ROCK通路调控人脑胶质瘤U-373MG细胞的恶性生物学行为

目的:探讨咖啡因通过调节FAK/AKT/ROCK信号通路来影响人脑胶质瘤U-373MG细胞的增殖、迁移和侵袭能力。方法:常规培养U-373MG细胞,将其分为对照组、咖啡因低剂量(1 mmol/L)组、咖啡因高剂量(2 mmol/L)组、PF573228组(FAK抑制剂,1μmol/L)、咖啡因高剂量+SC79组(AKT激活剂,8mg/L)。用CCK-8法、Transwell小室实验、流式细胞术和WB法分别检测各组U-373MG细胞的增殖、迁移、侵袭及凋亡,以及U-373MG细胞中p-FAK、p-AKT、p-ROCK、Ki67、MMP-9蛋白表达水平。建立U-373MG细胞裸鼠移植瘤模型,观察咖啡因对移植瘤生长的影响,WB法检测移植瘤组织中相关蛋白的表达。结果:咖啡因、PF573228可显著抑制U-373MG细胞的增殖、迁移、侵袭能力,促进U-373MG细胞凋亡,抑制p-FAK、p-AKT、p-ROCK、Ki67、MMP-9蛋白的表达(均P<0.05),SC79则可部分逆转咖啡因对U-373MG细胞的作用(均P<0.05)。咖啡因可显著抑制移植瘤的生长及移植瘤组织中上述相关蛋白的表达(均P<0.05)。结论:咖啡因可通过抑制FAK/AKT/ROCK信号通路抑制U-373MG细胞的增殖、迁移和侵袭能力,并促进其凋亡。

FAK抑制剂PF-562271减轻老化血小板诱导的人脐静脉内皮细胞损伤

目的探究FAK抑制剂对老化血小板诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)损伤的保护作用。方法实验分为空白对照组、脂多糖(LPS)组、造模组(LPS+Plt)和FAK抑制剂PF-562271组(LPS+Plt+PF-562271)。通过Western blot和免疫荧光检测FAK、pFAK和PECAM-1的蛋白表达。流式细胞术检测HUVEC活性氧(ROS)含量。细胞通透性和跨内皮细胞电阻实验,检测HUVEC屏障功能的变化。RT-qPCR检测炎性因子mRNA表达,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测细胞上清液中,炎性因子的分泌情况。免疫荧光检测加入ROS抑制剂维生素C(Vit.C)后,PECAM-1的表达。结果脂多糖和老化血小板处理后,FAK、pFAK和PECAM-1的蛋白表达增高,加入PF-562271后,FAK、pFAK和PECAM-1的蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01)。流式细胞术结果显示,脂多糖和老化血小板可促进ROS的释放,而加入PF-562271后,ROS释放减少(P<0.001)。脂多糖和老化血小板导致内皮细胞屏障受损,PF-562271可缓解内皮细胞屏障功能的损伤(P<0.01)。脂多糖和老化血小板促进内皮细胞炎症因子TNF-α、IL-6、IL-8的表达,PF-562271可降低炎症因子的表达(P<0.05)。加入维生素C后,PECAM-1蛋白表达降低(P<0.01)。结论FAK抑制剂PF-562271可通过改善氧化应激水平和降低炎症反应,缓解脂多糖和老化血小板诱导的内皮细胞损伤。

南蛇藤提取物通过DJ-1/PTEN/FAK轴抑制非小细胞肺癌侵袭转移

目的研究南蛇藤提取物(Celastrus orbiculatus Thunb.Extract,COE)抑制非小细胞肺癌侵袭转移的具体机制。方法通过CCK-8法测定COE抑制H1299细胞的生物活性,并依此选取低毒浓度进行细胞侵袭转移的功能研究。使用伤口愈合实验和高内涵成像追踪细胞轨迹对细胞运动功能进行测定。通过Western bolt实验进行分子层面的研究,探究COE抑制肺癌侵袭转移的具体分子机制。实验的分组采用剂量梯度进行设置,分别为Control组(0.05%DMSO),COE组:20,40,80μg/mL。结果COE以剂量依赖的形式明显抑制了H1299的细胞活性。伤口愈合实验结果显示,COE显著抑制了H1299细胞的迁徙能力,统计分析显示差异有显著统计学意义。高内涵成像实时动态追踪细胞轨迹显示,80μg/mL浓度的COE显著抑制了H1299细胞的迁徙能力,表现在运动速度的降低和均方位移量的下降。Western bolt实验结果表明,COE通过DJ-1/PTEN/FAK轴抑制非小细胞侵袭转移。蛋白质印迹的归一化分析均具有统计学意义。结论南蛇藤提取物能在低细胞毒浓度下通过DJ-1/PTEN/FAK轴抑制非小细胞侵袭转移。

EGFR^(T790M)和FAK双靶点抑制剂的分子动力学模拟研究

EGFR和FAK在癌症细胞中均呈现出过度表达的现象,虽然目前已有多个针对这两个靶点的抑制剂出现,但仍存在选择性较弱,活性较差等现状,于是本文试着从分子动力学模拟的角度来对目前已经出现较好效果的双靶点抑制剂9a、9f进行研究,并选取单靶点抑制剂TAE-226为对照。运用模拟的方法来计算蛋白与各个小分子抑制剂之间的RMSD、RMSF、Rg以及氢键的数目来进行分析和研究。通过运用绘图工具更直观的得出了小分子抑制剂与蛋白之间的相互作用。

人黏着斑激酶(FAK)原核表达及多克隆抗体制备与鉴定

目的克隆、表达与纯化黏着斑激酶(FAK)基因C端黏着斑定位序列(第798~1041位氨基酸),制备兔抗FAK多克隆抗体并鉴定。方法PCR法体外扩增FAK基因C端序列(2671~3402 bp),克隆至pCZN1,构建pCZN1-FAK重组表达载体,将重组表达载体转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)感受态细胞,用异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达;利用镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)金属鳌合亲和层析树脂进行蛋白纯化,并免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体;通过间接ELISA和Western blot法进行效价和特异性鉴定。结果成功构建pCZN1-FAK重组表达载体,FAK蛋白主要以包涵体形式表达。目的蛋白纯化后,制备的兔抗FAK多克隆抗体效价达1∶512000,且与外源和内源FAK蛋白发生特异性反应。结论成功克隆、表达与纯化FAK蛋白,制备兔抗FAK多克隆抗体,可用于内源FAK蛋白特异性检测。

LASP1基因对人结直肠癌LOVO细胞增殖、迁移和凋亡的影响及其机制

目的探讨LASP1基因表达对人结肠癌(LOVO)细胞增殖、迁移以及侵袭能力的影响及其作用机制。方法分别构建LASP1过表达质粒和LASP1干扰质粒转染LOVO细胞,qRT-PCR验证LASP1mRNA转染结果。MTT法、Tunel染色分别检测细胞增殖活性和细胞的凋亡情况,细胞划痕和Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力。Westernblot测定细胞LASP1、p-FAK/FAK、p-AKT/AKT蛋白表达。结果质粒转染成功。LASP1过表达的LOVO细胞的增殖、迁移和侵袭能力增加,细胞凋亡率降低,细胞中LASP1、p-FAK/FAK、p-AKT/AKT蛋白表达升高(P<0.01)。而敲减LOVO细胞中LASP1的表达后,细胞增殖、迁移和侵袭能力减弱,细胞凋亡率增加,细胞中LASP1、p-FAK/FAK、p-AKT/AKT蛋白表达降低(P<0.01)。结论LASP1可正向调控FAK/AKT信号通路,促进LOVO细胞的增殖、迁移以及侵袭能力。

FAK/Twist1信号通路在颅缝闭合过程中的作用机制研究

目的探究FAK/Twist1信号通路在颅缝闭合过程中的作用。方法将10 d大鼠分为对照组(50只)和颅缝旋转组(50只),以大鼠人字缝中点为中心,直径约0.5 cm做一骨窗,将骨瓣在不损伤硬脑膜的情况下游离,对照组骨瓣原位复位,旋转组骨瓣旋转180°后复位,两组大鼠3周后进行实验。旷场试验测试行为学,测量两组体质量、头围、骨瓣面积、骨瓣厚度等生理学指标,显微镜及HE染色观察颅缝闭合情况,Western blot、Real time PCR、免疫组化染色测定骨瓣及骨瓣下硬脑膜FAK/Twist1通过表达情况。结果旋转组骨瓣厚度大于对照组,差异有统计学意义(P<0.01),头围、体质量、骨瓣面积、术区面积无明显差异;显微镜下及HE染色中结果显示:旋转组颅缝完全闭合,对照组颅缝保持正常形态;行为学试验结果显示,颅缝闭合后大鼠行动能力下降且出现抑郁倾向;Western blot、Real time PCR、免疫组化染色显示:旋转组FAK在颅骨和硬脑膜中表达量均高于对照组且差异有统计学意义(P<0.05),旋转组Twist1在硬脑膜中表达量低于对照组且差异有统计学意义(P<0.05),在颅骨中两组Twist1表达量相近,差异无统计学意义。结论颅缝旋转后可以导致颅缝早闭,并会出现行动能力下降等行为学异常,FAK/Twist1可能在颅缝闭合过程中发挥着重要作用。

FAK-PI3K/AKT信号通路在新生大鼠颅盖骨生长发育过程中作用机制的研究

目的通过对不同时期的SD大鼠颅盖骨进行检测,探究大鼠颅盖骨的生长特点。方法选取同窝1、4、7、10、12周SD大鼠颅盖骨(每周3只),使用Real-time PCR和Western blot技术检测颅盖骨中局部粘着斑激酶(FAK)-磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路的表达情况,并通过相关性分析FAK-PI3K/AKT在颅盖骨生长发育过程中的作用情况。结果大鼠脑容积的增长与颅盖骨厚度的变化是同步增长;FAK的表达变化与大鼠各经线的变化呈正相关;FAK的表达变化与PI3K/AKT的表达变化呈正相关。结论FAK的表达变化与大鼠头颅的生长发育规律具有相关性,FAK通过激活PI3K/AKT信号通路在颅盖骨中发挥作用,FAK可能作为颅骨快速生长发育期的标志物,为临床上的颅骨缺损修复治疗中时机的选择提供基础理论依据。

低强度脉冲聚焦超声上调Vimentin蛋白表达抑制软骨细胞凋亡

目的探讨低强度脉冲聚焦超声(focused low-intensity pulsed ultrasound,FLIPUS)通过机械效应抑制软骨细胞凋亡的分子机制。方法用胰蛋白酶联合Ⅱ型胶原酶提取C57BL/6J乳鼠膝关节原代软骨细胞进行体外实验,IL-1β处理细胞模拟骨关节炎样软骨细胞损伤并进行验证,同时检测不同处理时间下相关蛋白表达变化。细胞分为Control组、IL-1β组和IL-1β+FLIPUS组,流式细胞术检测各组软骨细胞凋亡率,细胞免疫荧光检测各组细胞中Vimentin的结构分布。Western blot检测各组Col2α1、MMP13、Bcl-2、Vimentin及p-Tyr397表达。结果提取软骨细胞并模拟了骨关节炎样软骨细胞损伤模型。与Control组相比,随着IL-1β处理时间的延长,Col2α1、Vimentin、p-Tyr397、Bcl-2和p-AKT蛋白表达降低(P<0.05),MMP13、Bax和cleaved-Caspase3蛋白表达升高(P<0.05)。与IL-1β组相比,IL-1β+FLIPUS组软骨细胞凋亡水平降低(P<0.001),MMP13表达下降(P<0.05);Col2α1(P<0.01)、Bcl-2、Vimentin及p-Tyr397表达上升(P<0.05);Vimentin排列分布发生重塑,荧光强度增加。结论FLIPUS上调软骨细胞Vimentin表达,促进FAK的Tyr397位点磷酸化,抑制软骨细胞凋亡。

炙马钱子胶囊抑制BIPN的临床疗效及基于lncRNA ZFAS1(XIST)活化FAK信号通路抑制神经炎症的机制

[目的]评估炙马钱子胶囊医治硼替佐米相关性周围神经病(bortezomib induced peripheral neuropathy,BIPN)的有效性,初步探究其基于长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)X失活特异性转录本(X inactive specific transcript,XIST)/锌指结构反义转录本1(ZNFX1 antisense RNA 1,ZFAS1)干预BIPN的机制。[方法]通过前瞻性非随机对照的研究方法,共收集20例符合多发性骨髓瘤中西医诊断并接受硼替佐米(bortezomib,BTZ)治疗而且发生BIPN接受炙马钱子胶囊治疗的患者,与未接受马钱子治疗的患者进行中医症候积分、神经毒性评分、周围神经病变(peripheral neuropathy,PN)分级、部分周围神经传导速度的比较。通过自身对照,采集治疗组患者的外周血液样本,使用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测炎症相关因子表达。培养DRG 50B11细胞,通过细胞增殖毒性检测筛选马钱子最佳作用浓度和时间及BTZ最佳作用时间,随机分为正常对照组、BTZ组、马钱子+BTZ组,以实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time quantitative polymerase chain reaction,Real-time qPCR)检测炎症相关因子及细胞总RNA相关指标表达,分析差异性及相关性。[结果]临床研究显示,与对照组比较,患者治疗后PN、中医证候积分、神经毒性评分降低,周围神经传导速度增加(P<0.05),无明显不良反应。实验研究显示,与治疗前比较,白细胞介素-17(interleukin-17,IL-17)、IL-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、神经生长因子(nerve growth factor,NGF)、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)表达均降低(P<0.05),且与时间存在显著负相关性(P<0.01)。与BTZ组比较,马钱子+BTZ组IL-17、TNF-α、IL-1β、IL-6、NGF、BDNF、lncRNA XIST、纤维粘连蛋白1(fibronectin 1,FN1)、磷酸化局部黏着斑激酶(phospho-focal adhesion kinase,p-FAK)表达降低(P<0.05),miR-96-5P、miR-1271-5P表达升高(P<0.05),lncRNA ZFAS1表达量差异无统计学意义(P>0.05);lncRNA XIST表达与IL-17、TNF-α、IL-1β、IL-6、NGF、BDNF、FN1、p-FAK表达显著正相关(P<0.01),与miR-96-5P存在中等负相关性(P<0.05),与miR-1271-5P存在极弱相关或无相关性(P>0.05)。[结论]炙马钱子胶囊在一定程度上可缓解BIPN且较为安全,其机制可能与调控lncRNA XIST,促进miR-96-5P/FN1表达,抑制p-FAK介导的神经炎症有关。

MC3T3-E1细胞成骨模型的建立及局部黏着斑激酶表达的研究

目的:通过化学诱导手段建立MC3T3-E1细胞成骨模型,探讨局部黏着斑激酶(FAK)基因表达与成骨细胞形成的关系,了解FAK对成骨分化的影响。方法:观察MC3T3-E1细胞成骨诱导前后细胞形态,茜素红化学染色检测矿化情况,实时荧光定量PCR检测成骨标志物Runx2、ALP的表达,同时分析FAK在成骨过程中的表达情况。结果:MC3T3-E1细胞成骨诱导3 d后细胞呈长梭形或多角形;第21、28 d时,茜素红染色可见矿化结节;成骨标志物Runx2、ALP的表达呈持续升高的趋势,FAK的表达总体呈升高趋势,在第7 d时略有下降。结论:FAK的表达与成骨相关基因的表达趋势基本一致,提示FAK可能在MC3T3-E1细胞成骨过程中发挥一定作用。

基于ITGB4/FAK/p38信号通路蒙药蓝盆花总黄酮提取物体内外抗肝纤维化的作用研究

目的探讨蒙药蓝盆花总黄酮提取物(total flavonoid extract of Scabiosa comosa,TFS)对肝纤维化体内外的影响,以及通过对ITGB4/FAK/p38信号通路的调控对肝纤维化的作用。方法体内实验:选取50只Wistar大鼠随机分为空白组,模型组,TFS高(200mg/kg)、中(100mg/kg)、低(50mg/kg)剂量组,除对照组外均给予2ml/kg CCl_(4)灌胃。期间对TFS各剂量组给药,而对照组和模型组不做处理,灌胃10周。检测血清丙氨酸氨基转移酶(glutamic-pyruvic transaminase,ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(glutamic-oxaloacetic transaminase,AST)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)含量及肝组织羟脯氨酸(hydroxyproline,HYP)含量;苏木精-伊红(hematoxylin eosin,HE)染色、Masson染色观察肝组织病理学改变;肝组织经转录组测序筛选与肝纤维化相关的通路;实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)与Western blot法分别检测肝组织中α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、collagenⅠ及ITGB4/FAK/p38信号通路相关mRNA及蛋白表达情况。体外实验:MTT法检测TFS对HSC-T6细胞的抑制率;RT-qPCR与Western blot法分别检测HSC-T6细胞中α-SMA、collagenⅠ及ITGB4/FAK/p38信号通路相关mRNA及蛋白表达;流式细胞术检测不同浓度TFS对HSC-T6细胞凋亡的影响。结果与空白组比较,TFS显著增加了模型组中ALT、AST、ALP及HYP的含量(P<0.01);与模型组比较,TFS显著降低了TFS剂量组中ALT、AST、ALP、HYP的含量(P<0.01);肝组织病理变化显示,肝纤维化增生明显改善;GO、KEGG富集分析表明,ITGB4/FAK/p38信号通路在模型组相关性显著。不同剂量的TFS对HSC-T6细胞均有抑制作用;体内外RT-qPCR与Western blot法检测结果显示,TFS各剂量组α-SMA、collagenⅠ、ITGB4/FAK/p38信号通路相关的mRNA及蛋白表达显著下降(P<0.05);凋亡结果亦显示,TFS各剂量组细胞凋亡数明显增加(P<0.01)。结论蒙药蓝盆花总黄酮提取物可显著抑制肝纤维化进展,其调控机制可能与ITGB4/FAK/p38信号通路有关。

淫羊藿素通过调控黏着斑激酶及下游细胞外信号调节激酶/细胞周期蛋白D1和蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素蛋白信号通路抑制肝癌细胞增殖的作用机制研究

目的探究淫羊藿素(icaritin,ICA)抑制肝癌细胞增殖的作用机制。方法以Huh7肝癌细胞为研究对象并在体外培养;设置200、100、50、20、10、5、2、1、0.5μmol/L不同浓度的ICA给药干预72小时之后,采用0.5%结晶紫染色分析ICA对Huh7肝癌细胞生存的影响;将Huh7肝癌细胞给与ICA高(10μmol/L)、中(5μmol/L)、低(2.5μmol/L)三个浓度,每个浓度设置三个复孔,通过克隆形成实验检测ICA对Huh7肝癌细胞增殖能力的影响;Huh7肝癌细胞给与ICA IC 50值浓度,对照孔及ICA给药孔分别在0、6、12、24小时在倒置显微镜下拍照,通过细胞划痕分析ICA对肝癌细胞迁移能力的影响;并且用流式细胞术对细胞周期进行分析。另外,通过蛋白印迹对增殖相关蛋白,如增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、磷酸化黏着斑激酶(phosphorylated focal adhesion kinase,p-FAK)、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、磷酸化细胞外信号调节激酶(phosphorylated extracellular signal-regulated protein kinase,p-ERK)、磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B,p-Akt)和磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(phosphorylated mammalian target of rapamycin,p-mTOR)等蛋白的表达水平进行分析。结果ICA可以明显抑制肝癌细胞的增殖及迁移能力,并且使肝癌细胞的细胞周期在G1期发生阻滞(P<0.05)。另外,研究发现ICA可以下调p-FAK及其下游调节蛋白p-ERK、cyclin D1以及p-Akt、p-mTOR、p-S6的表达水平。结论ICA可能通过调控FAK及下游ERK/cyclin D1和Akt/mTOR信号通路从而抑制肝癌细胞的增殖生长。

不同剂量利塞膦酸钠对正畸大鼠牙根组织中FAK、MMP-2、RANK蛋白表达及牙移动、牙根吸收的影响

目的探讨不同剂量利塞膦酸钠对正畸大鼠牙根组织中FAK、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、RANK蛋白表达及牙移动、牙根吸收的影响。方法选择120只SPF级的Wistar雄性大鼠,将120只大鼠按随机数字表法分为4组,包括模型组、利塞膦酸钠低剂量组、中剂量组、高剂量组,每组30只大鼠。高、中、低利塞膦酸钠的每日给药剂量为1、0.5、0.25 mg·kg^(-1)·d^(-1),模型组大鼠在相同时间给予0.9%氯化钠溶液灌胃。分析4组大鼠不同时间点的正畸牙移动距离、4组大鼠牙根组织形态、牙根组织中破骨细胞的数量、牙根组织中MMP-2、RANK及FAK蛋白表达。结果实验第7、14、21天,高剂量组的正畸牙移动距离、破骨细胞数量、明显较中、低剂量组、模型组大鼠低,中剂量明显较低剂量组、模型组低,低剂量组明显较模型组低,差异均有统计学意义(P<0.05)。苏木素和伊红染色后,实验第7天,模型组根分叉压力侧表面的牙骨质不连续,存在骨吸收陷窝,低、中剂量组也出现骨吸收陷窝,高剂量组骨吸收陷窝较浅;实验第14天,模型组的根分叉处、根尖处均有一定吸收,低、中剂量组牙根吸收多出现在受压力侧的根中1/3处,高剂量组大鼠根尖、根分叉形态基本完整,无明显的吸收;实验第21天,模型组的根尖受压力侧出现轻度吸收,低、中、高剂量组未出现根尖形态明显变化。实验第7、14、21天,高剂量组的牙根组织中MMP-2、RANK蛋白表达明显较中、低剂量组、模型组大鼠低,FAK蛋白明显高,中剂量组正畸牙根组织中MMP-2、RANK蛋白表达明显较低剂量组、模型组低,FAK蛋白明显高,低剂量组MMP-2、RANK蛋白表达明显较模型组低,FAK蛋白明显高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论利塞膦酸钠可抑制正畸大鼠的牙根吸收的影响,可能与抑制牙根组织中MMP-2、RANK蛋白表达,诱导FAK蛋白升高,抑制破骨细胞数量有关,且利塞膦酸钠剂量越高,抑制牙根吸收作用越明显。

FAK、uPA在胃癌原发灶及转移淋巴结中的表达及临床意义

目的:探讨FAK、uPA在胃癌原发灶和转移淋巴结中表达及临床意义。方法:应用免疫组织化学SP法检测FAK、uPA在60例胃癌组织和转移淋巴结中的表达。结果:FAK、uPA均在胃癌组织细胞胞浆内表达,阳性表达率分别为65.8%,73.3%;FAK、uPA表达与胃癌淋巴结转移(P<0.05)及浆膜浸润相关(P<0.05);FAK在转移淋巴结中的阳性表达率为(39.1%)较相应胃癌原发灶中FAK阳性表达率(87.9%)显著降低(P<0.05);转移淋巴结中uPA阳性表达率(97.8%)显著高于相应胃癌原发灶中uPA阳性表达率(84.8%),差异有统计学意义(P<0.05)。结论:FAK、uPA表达可作为判断胃癌恶性行为重要生物学指标;FAK低表达有助于癌细胞定位和繁殖,uPA在转移淋巴结中表达水平高于原发灶,在胃癌淋巴结转移过程中可能发挥了重要作用。

白藜芦醇对高转移卵巢癌细胞中FAK表达及磷酸化水平的影响

目的研究白藜芦醇对HO-8910PM细胞中FAK表达及FAK磷酸化水平的影响,探讨其抗肿瘤侵袭转移的作用机制。方法MTT法测定白藜芦醇的细胞毒作用;Westernblot分析FAK蛋白表达及FAK磷酸化水平;RT-PCR分析白藜芦醇对HO-8910PM细胞中FAKmRNA表达的影响。结果白藜芦醇作用HO-8910PM细胞24h后的IC50为(163.40±2.48)μmol·L-1;25、50、100μmol·L-1的白藜芦醇作用HO-8910PM细胞24h后,FAK蛋白和mRNA表达水平下降,FAK磷酸化水平也降低。结论白藜芦醇抗肿瘤侵袭转移机制与FAK表达以及FAK磷酸化水平有关。