在BEP2D细胞恶性转化过程中TGF-β1对Smad7表达的调节

背景与目的:细胞逃避转化生长因子-β(TGF-β)诱导的对细胞生长、增殖的抑制是许多肿瘤发生的一个重要机制。Smad7是TGF-β信号转导通路的抑制型Smads,它可阻断TGF-β信号在胞浆内的传导,其紊乱是TGF-β信号转导通路紊乱的机制之一。本研究旨在分析在细胞恶性转化过程中,Smad7基因表达是否发生紊乱,TGF-β1对Smad7基因的调控功能有无发生变化,以探索细胞发生恶性转化的原因。方法:培养BEP2D细胞及BERP35T-2细胞,于收获前60min和90min加入不同剂量的TGF-β1,提取细胞总RNA,分别以未加TGF-β1的细胞组作为对照,用Northernblot杂交比较两组细胞Smad7mRNA表达的差异以及细胞对TGF-β1细胞因子刺激的反应性。同时提取BEP2D及BERP35T-2细胞蛋白,用Westernblot方法比较两组细胞内源性TGF-β1表达的差异。结果:Smad7mRNA表达水平恶性转化细胞高于永生化细胞;加了TGF-β1细胞因子后,BEP2D细胞Smad7mRNA表达增高,BERP35T-2细胞表达水平改变不明显。而内源性TGF-β1的表达水平,BERP35T-2细胞稍高于BEP2D细胞。结论:Smad7在辐射致肺癌细胞系中的过表达及对TGF-β1应答的降低可能是辐射诱发肺癌发生的机制之一。

BEP2D细胞恶性转化过程中Smad7基因对MAPK信号通路的调控

背景与目的:Smad7基因是转化生长因子(transforminggrouthfactor-茁,TGF-β)信号通路的抑制分子,有研究表明TGF-β通过活化SMAD通路和ras/MEK/ERK通路来诱导某些基因的表达。本研究旨在探讨在人永生化支气管上皮细胞BEP2D经辐射诱发恶性转化过程中,作为SMAD蛋白家族的抑制分子Smad7是否参与TGF-β对MAPK信号通路的调控。方法:将人工合成的Smad7siRNA及Smad7真核表达载体与pTet-Elk,pTet-Jun反式激活载体、报告基因荧光素酶共转染BEP2D细胞,TGF-β刺激,通过报告基因荧光素酶的表达丰度来检测Smad7对MAPK信号通路的调控。结果:永生化BEP2D细胞中,TGF-β刺激之后,Elk和Jun磷酸化活性升高(PElk=0.033,PJun=0.016);Elk或Jun同Smad7真核表达载体共转染之后,Elk磷酸化活性升高,Jun磷酸化活性降低(PElk=0.017,PJun=0.028);Elk或Jun同Smad7-siRNA共转染之后,Elk磷酸化活性降低,Jun磷酸化活性升高(PElk=0.018,PJun=0.005)。恶性化BERP35T2细胞中,TGF-β刺激之后,Elk磷酸化活性增强(P=0.006),Elk同Smad7siRNA共转染之后,Elk磷酸化活性降低(P=0.000);恶性化细胞中几乎检测不到Jun的活性。结论:在BEP2D细胞发生恶性转化过程中,Smad7基因干预MAPK信号通路,使ERK和JNK磷酸化活性的平衡失调,导致促增殖作用强于生长抑制作用,从而有助于细胞向恶性方向发展。

α粒子诱发BEP2D细胞转化过程中肺癌相关基因表达的cDNA Microarray研究

目的：探讨辐射诱发人支气管上皮细胞(BEP2D)转化过程中肺癌相关基因的表达。方法：用Cartesian PixSys5500 cDNA Microarray点样仪将60个肺癌相关基因以微阵列形式点布于醛基化的玻璃片上。提取α离子辐射前BEP2D细胞（原代）和α粒子辐射后20代、35代细胞总RNA，经长片段反转录和线性扩增标记成荧光探针后与微阵列中cDNA进行杂交。结果：原代细胞中检测到40个基因表达；20代检测到47个基因表达；35代检测到20个基因表达。所检测的基因中，抑癌基因的mRNA丰度在原代和20代后细胞中急剧下降；大多数癌基因的表达丰度在20代以后细胞中仅轻微下降；生长因子类基因大都在20代细胞表达。结论：在辐射诱发的人支气管上皮转化细胞中，抑癌基因的失活可能与细胞恶化有关；癌基因及生长因子类基因可能促进了细胞的转化。

SAGE方法分析永生化BEP2D细胞及α粒子诱发恶性转化BEP2D细胞的基因表达

目的：采用基因表达系列分析（ｓｅｒｉａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＳＡＧＥ）方法，分析永生化ＢＥＰ２Ｄ细胞及α粒子诱发恶性转化ＢＥＰ２Ｄ细胞的基因表达。方法：细胞培养，收获永生化ＢＥＰ２Ｄ细胞及α粒子诱发恶性转化ＢＥＰ２Ｄ细胞；提取细胞总ＲＮＡ，分离ｍＲＮＡ，合成生物素标记的双链ｃＤＮＡ；采用ＳＡＧＥ方法获取标签序列，结合ＵｎｉＧｅｎｅ文库分析标签代表的转录本，最终通过ＳＡＧＥ软件分析标签丰度，比较两组细胞基因表达差异。选取ＳＡＧＥ实验得到的在两组细胞中表达的已知基因Ｓｍａｄ７和 ＣＣＲ１１，以 ＲＴ－ＰＣＲ方法制备探针，用两组细胞等量总ＲＮＡ为样本，做 Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ杂交。结果：建立了２个独立的 ＳＡＧＥ文库。一个是１．５ Ｇｙα粒子照射诱发恶性转化ＢＥＰ２Ｄ细胞的ＳＡＧＥ文库，一个是永生化ＢＥＰ２Ｄ细胞ＳＡＧＥ文库。从２个文库中分别挑取克隆５３个、５０个，进行测序，测序一共得到总标签２３３１个，代表单一转录本 ２５２个，有 ７０％的 ＳＡＧＥ标签可找到与之一一对应的基因，有８４个核糖体蛋白基因，约占３３％；有１２个转录本（４．８％）找不到与之理想匹配的已知基因；

α粒子照射诱发BEP2D细胞恶性转化模型的建立

目的:建立α粒子照射诱发BEP2D细胞恶性转化模型。方法:α粒子照射永生化BEP2D细胞,通过细胞传代培养,最终经裸鼠成瘤实验,病理切片鉴定,瘤组织培养获取肿瘤细胞系,角蛋白多克隆抗体免疫组化鉴定细胞上皮来源。结果:(1)α粒子照射BEP2D细胞后,培养35代,54代细胞接种裸鼠成瘤,照后20代BEP2D细胞及未照射永生化BEP2D细胞接种裸鼠不成瘤;(2)瘤体病理切片鉴定为鳞状上皮癌;(3)瘤组织培养得到肿瘤细胞系2个,角蛋白多抗免疫组化实验,细胞胞浆强阳性,证实为上皮来源。结论:1.5Gyα粒子照射诱发BEP2D细胞恶性转化,成功建立α粒子照射诱发肺癌的细胞研究模型。

NNK诱发BEP2D细胞产生活性氧及其对DNA的损伤

通过测定细胞内和细胞上清中活性氧（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ，ＲＯＳ）水平，以及ＤＮＡ 加合物——８－羟基脱氧鸟嘌呤核苷（８－ｈｙｄｒｏｘｙｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅ，ＯＨ８ｄＧ）含量，对烟草特异亚硝胺类化合物４－甲基亚硝胺－１（３－吡啶基）－１－丁酮（４－（ｍ ｅｔｈｙｌｎｉｔｒｏｓａｍ ｉｎｏ）－１－（３－ｐｙｒｉｄｙｌ）－１－ｂｕｔａｎｏｎｅ，ＮＮＫ）诱发人乳头状病毒永生化的人支气管上皮细胞（ｈｕｍ ａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍ ａｖｉｒｕｓ－ｉｍ ｍ ｏｒｔａｌｉｚｅｄ ｈｕｍ ａｎｂｒｏｎｃｈｉａｌｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｌｉｎｅ，ＢＥＰ２Ｄ）产生的ＲＯＳ及其对ＤＮＡ 的氧化损伤进行研究，并观察纳米硒的保护作用．结果表明，ＢＥＰ２Ｄ 细胞经不同浓度的ＮＮＫ 作用后，细胞内和细胞上清中ＲＯＳ以及ＯＨ８ｄＧ含量均显著增加，并有较好的剂量效应关系．１ μｍ ｏｌ·Ｌ－ １纳米硒（ｎａｎｏｓｅｌｅｎｕｉｍ ，ＮＳ）能明显抑制ＮＮＫ 诱发ＢＥＰ２Ｄ细胞产生的ＲＯＳ及ＯＨ８ｄＧ 水平．揭示ＮＮＫ 能造成细胞的氧化损伤，而ＮＳ对ＮＮＫ 所致细胞的氧化损伤有保护作用．

^(238)Puα粒子诱发人支气管上皮细胞BEP2D转化的初步研究

目的 建立氡及其子体诱发细胞转化的模型 ,模拟氡致肺癌的过程。方法 利用2 3 8PuO2 释放的α粒子 ,照射体外培养的人支气管上皮细胞系BEP2D ,诱发转化。结果 1.5Gy单次照射的R15H细胞在连续培养 2 2周后获得了转化 ,转化细胞逐步发生生长动力学和形态学的改变 ,生长失去接触抑制 ,ConA凝集现象明显 ,获得对血清诱导末端分化的抗性和锚着独立性生长能力 ,与对照细胞相比均有统计学意义上的增强。结论 从BEP2D到α粒子转化的R15H细胞能够在一定程度上模拟体内肿瘤的发生发展过程 ,可以为深入了解肺支气管肿瘤发生多阶段过程中的细胞和分子机理提供研究模型。

α粒子诱发转化人支气管上皮细胞系BEP2D中XRCC5等基因的突变检测

目的与方法 :用聚合酶链式反应 单链构象多态性分析 (PCR SSCP)方法观察α粒子诱发人支气管上皮细胞系BEP2D细胞转化过程中相关基因的改变。结果 :细胞转化过程中 ,双链断裂修复基因XRCC5发生碱基突变 ,改变从转化早期过程就持续存在 ;而p16基因exon2和hMSH2基因exon12未见变化。结论 :XRCC5基因在α粒子照射后早期发生突变 ,使细胞丧失修复双链断裂损伤的能力 ,是α粒子诱发支气管上皮细胞转化过程中的启动事件之一。

α-粒子诱发人BEP2D恶性转化细胞的亚克隆及DNA链断裂修复研究

目的 :建立α 粒子诱发人支气管上皮细胞 (BEP2D)恶性转化细胞的克隆细胞系 ,研究其核型和DNA链断裂修复能力。方法 :1.5Gyα 粒子照射的BEP2D细胞传 35代后接种裸鼠成瘤 ,取出瘤细胞进行亚克隆 ,挑出单个克隆扩大培养 ,G带显示分析细胞核型 ,脉冲电场凝胶电泳法检测DNA双链断裂。结果 :亚克隆了 5个恶性转化细胞系 (RP35T 1, 2 , 4 , 5 , 6 ) ,核型基本与BEP2D细胞相近 ,但有着不同的染色体缺失 ,其中 2株细胞 (RP35T 2和RP35T 4 )多倍体高达 40 %,明显高于BEP2D细胞。恶性转化细胞RP35T 1和RP35T 4的DNA双链断裂重接修复缺陷。结论 :建立了α 粒子诱发人BEP2D恶性转化细胞的克隆细胞系 ,DNA链断裂修复缺陷可能是α 粒子致癌的一个重要特点。

BEP2D细胞和R15Hp35T-2细胞中60个肺癌相关基因的表达研究

目的 研究永生化人支气管上皮细胞 (BEP2D)和α粒子辐射诱发BEP2D细胞后形成的恶性转化细胞 (R15Hp35T 2 )中 6 0个肺癌相关基因的表达谱。 方法 首先搜集了 6 0个肺癌相关的基因 ,经扩增和纯化后 ,用CartesianPixSys5 5 0 0cDNAMicroarray点样仪将 6 0个肺癌相关基因以微阵列形式点布于醛基化的玻璃片上。然后提取BEP2D细胞和R15Hp35T 2细胞的RNA ,经长片段反转录和线性扩增标记成荧光探针后与微阵列中的cDNA进行杂交。结果 与BEP2D细胞相比 ,R15Hp35T 2细胞中上调表达的基因有 2 7个 ,下调表达的基因有 7个。大部分抑癌基因的mRNA丰度在 2种细胞中表达相似 ;而大多数癌基因和生长因子类基因的mRNA丰度在R15Hp35T 2细胞中高表达。结论 在辐射诱发的人支气管上皮恶性转化细胞中 。

支气管上皮细胞系BEP2D恶性转化过程中p16基因甲基化改变研究

目的 研究人支气管上皮细胞系BEP2D恶性转化过程中p16基因甲基化改变以及 p16基因mRNA转录情况。方法 选取正常人支气管上皮细胞系BEP2D及其经α粒子照射 2 0周 (R 2 0 )、2 1周 (R 2 1)、3 5周 (T 3 5 )和 5 4周 (T 5 4)的BEP2D细胞株作为研究对象 (其中R 2 0、R 2 1未发生恶性转化 ,而T 3 5、T 5 4已发生恶性转化 ) ,采用甲基化特异性PCR(methylation specificPCR ,MSP)检测各细胞株中 p16基因的甲基化改变情况 ,再运用半定量反转录PCR (retro translationPCR ,RT PCR)检测 p16基因mRNA在各细胞株中的表达情况。结果 ①正常BEP2D细胞株 p16基因未发生甲基化 ,而R 2 0、R 2 1、T 3 5和T 5 4细胞的p16基因均发生了甲基化改变。②与正常BEP2D细胞相比 ,R 2 0、R 2 1、T 3 5和T 5 4细胞 p16基因mRNA转录水平均降低。结论 p16基因甲基化改变发生在肺癌形成的早期阶段。p16基因甲基化可导致

BEP2D细胞受照前后蛋白质组学研究

本研究利用蛋白质组学技术对受1.5Gy、3Gy γ射线照射的人支气管上皮(BEP2D)细胞和未经照射的人支气管上皮细胞蛋白差异表达谱进行了分析与鉴定。研究结果表明:2-D电泳后在分子量14.4～94kD,等电点3～10范围内分离出约1000多个不同蛋白质斑点。凝胶图象显示1.5Gy的γ射线照射后与对照组相比有15个蛋白点上调,104个下调;3Gy的γ射线照射后有26个蛋白点上调,144个下调;二个不同照射剂量共同表达的差异蛋白点有18个,其中上调的有3个,下调的有15个。通过对选取的10个蛋白点进行质谱分析,有2个蛋白点(样品D和样品660)经检索鉴定为肌球蛋白轻链(MLC)。这些蛋白表达量的改变可能与辐射诱发肺部肿瘤的发生有关,为进一步研究肺癌的发病机理提供了一定的基础。

SO_2衍生物对人BEP2D细胞哮喘基因表达影响

目的研究二氧化硫(SO2)衍生物染毒后人支气管上皮细胞(BEP2D)哮喘相关基因黏蛋白5AC(MUC5AC)和白介素-13(IL-13)表达的变化。方法以不同浓度SO2衍生物(0.000 1,0.001,0.01,0.1,1 mmol/L)对BEP2D细胞染毒,采用荧光实时定量RT-PCR、免疫细胞化学和酶联免疫吸附法(ELISA)等方法测定基因的表达。结果不同浓度SO2衍生物处理的BEP2D细胞中MUC5AC和IL-13 mRNA和蛋白表达比对照组明显增加;经0.1 mmol/L SO2衍生物处理后换新鲜培养基再孵育不同的时间,MUC5AC和IL-13 mRNA水平均显著增高,在更换新鲜培养基孵育4 h时达到峰值,24 h时虽然有所降低,但仍比对照组显著增高。结论SO2衍生物能增加EBP2D细胞MUC5AC和IL-13在转录和翻译水平上的表达,提示这可能是SO2加重哮喘疾病的原因之一。

α—粒子辐射诱BEP2D细胞系的差异蛋白质组研究

目的：建立一个全面的肺癌细胞系蛋白质组表达谱。方法：利用固相PH梯度等电聚焦双向电泳、最新生物质谱肽质量指纹谱和源后衰变技术以及生物信息学技术，对RH细胞系原代、20代、35代细胞进行功能蛋白组分析。结果：获得了RH细胞系原代、20代和35代蛋白表达谱。凝胶图象分析显示3个蛋白质点只在原代中表达。原代到20代细胞共43个蛋白质表达量发生变化。其中21个蛋白质表达量上升，22个下降，20个到35代细胞共66个蛋白质发生表达量变化，其中13个蛋白质的表达量上升，53个下降，质谱鉴定出40个蛋白质点，共获得7个差异表达蛋白质信息，其中HMG－1在RHO细胞内表达，而RH20和RH35细胞内不表达，Maspin在癌前阶段表达量下降，来源于肿瘤抑制基因区的氨酰酶1和5′甲硫酰苷磷酸化酶也在不同时期表达下降，结论：这些差异表达的，有或无的蛋白质，可能与肺癌的发生，发展和恶变存在一定关系。

ANXⅠ在原发性肺癌及BEP2D转化细胞系中的表达(英文)

[目的]体内、外的许多感染模型证实 ,ANXⅠ介导糖皮质激素的抗炎症效应 ,被认为是糖皮质激素抗炎症效应中的第二信使。然而 ,ANXⅠ与原发性肺癌之间的相关性尚未知晓。本文对此进行研究。[方法]采用免疫组化方法检测60例原发性肺癌标本中ANXⅠ的表达分布 ;蛋白组学方法描绘ANXⅠ在永生化、转化与恶性转化中的表达状况。[结果]ANXⅠ的表达分布与原发性肺癌的组织学分型相关 (P<0.05) ;在永生化细胞中表达丰度低 ,转化细胞较高 ,恶性转化细胞中最高。[结论]ANXⅠ可能参与原发性肺鳞癌形成的启动或促进阶段 ,对人支气管上皮细胞恶性转化具有较为重要的作用。

γ射线辐照对BEP2D细胞蛋白质组的影响

目的:利用蛋白质组学方法,研究与人永生化支气管上皮细胞(BEP2D细胞)辐照相关的差异蛋白质,寻找辐射致肺癌早期诊断和治疗的新指标。方法:分别培养并收集了0、1.5和3.0 Gyγ射线辐照24 h后的BEP2D细胞样品,用双向凝胶电泳技术分离照射组与对照组细胞样品中的总蛋白质,应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)得到相应的肽质量指纹图,并最终鉴定差异蛋白质。结果:质谱鉴定获得10张肽质量指纹图,经数据库搜索后8个蛋白点被初步鉴定(2个蛋白点无结果),其中1个蛋白点重复。用Mascot软件查询NCBInr数据库初步鉴定出7种差异表达的蛋白质,即亲环素A、肌球蛋白轻链2、细胞角蛋白9、α-烯醇酶、磷酸丙糖异构酶1、Makorin环指蛋白1、c-myc启动子结合蛋白1。结论:所鉴定的7种蛋白与辐射诱导肺癌的发生、发展过程密切相关,为寻找辐射致肺癌早期诊断和治疗的新靶点提供了理论依据。

α粒子诱发BEP2D细胞癌变株中多种基因启动子的异常甲基化

目的 :研究α 粒子诱发人支气管上皮细胞癌变株中 p14 ARF,p16 INK4a,MGMT ,GSTP1,BUB3和DAPK基因的甲基化情况。方法 :用甲基特异性的PCR(MSP)分析基因启动子区CpG岛的甲基化情况和用RT PCR检测细胞的基因转录水平。结果 :p14 ARF基因在BEP2D细胞中没有甲基化 ,但在其癌变细胞BERP35T1中发生了甲基化 ,且甲基化导致 p14 ARF基因的转录水平显著下降。p16 INK4a和BUB3在两种细胞中均没有发生甲基化 ,BUB3经测序证实 ;MGMT在BEP2D细胞和癌变细胞中均发生甲基化 ;DAPK在BEP2D细胞中已有部分甲基化 ,在BERP35T1细胞中完全甲基化 ;GSTP1在BEP2D细胞中没有甲基化 ,在BERP35T1细胞中发生部分甲基化。结论 :在辐射诱发人支气管上皮细胞恶性转化中 ,部分与细胞增殖。

^(60)Coγ射线诱导BEP2D细胞蛋白质表达的改变

利用双向凝胶电泳和质谱技术,研究人支气管上皮细胞(BEP2D细胞)经60Coγ射线照射后细胞蛋白质表达的改变。结果表明:受照BEP2D细胞蛋白质表达发生了改变,共同差异表达的蛋白质点上调的有3个,下调的有1个;通过质谱分析和数据库检索,有2个蛋白质点(样品D和样品660)经检索鉴定为肌球蛋白质轻链(MLC2和MLC3),其中MLC2蛋白质的表达量随着剂量的升高而增高。这些蛋白质的高表达可能与辐射诱发肺部肿瘤有关。

辐射诱导BEP2D细胞蛋白质表达的改变

利用双向凝胶电泳和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术,研究与人肺永生化支气管上皮细胞(BEP2D细胞)辐照相关的差异蛋白质,寻找辐射致肺癌早期诊断和治疗的新指标。结果表明,提取样品蛋白进行二维凝胶电泳,找到差异表达蛋白质点约18个,质谱鉴定获得10张肽质指纹图,经数据库搜索后初步鉴定差异表达的蛋白质有7种,即亲环素A、肌球蛋白轻链2、细胞角蛋白9、α-烯醇酶、磷酸丙糖异构酶1、MKRN1、c-myc启动子结合蛋白1。该7种蛋白质与辐射诱导肺癌的发生、发展过程密切相关。

α-粒子诱发BEP2D细胞恶性转化中DNA修复基因DNA-PK的表达和突变分析

目的 :研究α 粒子诱发人支气管上皮细胞 (BEP2D)恶性转化中DNA修复基因DNA PK的结构和表达变化。方法 :用Northernblot杂交检测基因转录水平 ,聚合酶链式反应 单链构象多态性 (PCR SSCP)分析基因编码序列结构变化。结果 :癌变细胞中DNA修复基因Ku70 (XRCC 6 )的编码碱基发生突变 ,第 114 8～ 115 3位点由AGGATC突变为GAGTAC ,致使编码的氨基酸由RI变为EY ;细胞恶性转化过程中 ,DNA修复基因DNA PKcs(XRCC 7)的表达发生改变 ,在恶性转化早期即α 粒子照射后第 2 1代就已被抑制 ,但发生癌变 (第 35代 )后 ,部分细胞克隆的该基因表达又重新上调。结论 :DNA修复基因DNA PK的结构和表达的变化 ,导致细胞DNA修复能力缺陷 ,基因组不稳定性增加 ,是α 粒子癌变的分子机制之一。