碱性成纤维细胞生长因子拮抗转化生长因子-β_1对人α1(I)胶原基因的启动激活

目的 探讨碱性成纤维细胞生长因子 (b FGF)对人α1 ( )胶原基因启动子活性的影响 ,以及与转化生长因子 - β1 (TGF- β1 )之间的相互作用 ,为防治增生性瘢痕提供依据。 方法 正常皮肤及瘢痕成纤维细胞原代、传代培养。采用 Fu GENE转染试剂 ,分别瞬间转染含人α1 ( )胶原基因 5'端序列 - 2 .5 kb与报告基因氯霉素乙酰基转移酶(CAT)的重组体 ph COL2 .5至正常皮肤及瘢痕成纤维细胞。 ELISA法测定 b FGF及 TGF- β1 作用 2 4小时后 ,转染ph COL2 .5的两种成纤维细胞的报告基因 CAT表达量。 结果 b FGF能抑制转染 ph COL2 .5重组体的正常皮肤及瘢痕成纤维细胞 CAT表达量 ,且能拮抗 TGF-β1 对转染 ph COL2 .5重组体的两种成纤维细胞 CAT表达的上调作用。与对照组相比有统计学意义 (P<0 .0 5)。 结论 正常皮肤及瘢痕成纤维细胞中 ,b FGF均能抑制人 α1 ( )胶原基因的启动转录 ,且能拮抗 TGF-β1 对人α1 ( )胶原基因启动活性的上调作用 ,b

促肝细胞生长素对大鼠肝星状细胞增殖及α1(Ⅰ)胶原基因启动子活性的影响

目的:探讨促肝细胞生长素(pHGF)对大鼠肝星状细胞HSC-T_6增殖及α1(Ⅰ)胶原基因启动子活性的影响。方法:(1)采用MTT法分析pHGF对HSC-T_6细胞增殖的影响。(2)构建含人α1(Ⅰ)胶原基因5′侧翼序列(启动子)与氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因的重组体 pCOLH1.5,以脂质体法转染HSC-T_6细胞,ELISA法测定不同浓度pHGF作用24 h后,转染了重组体质粒的HSC-T_6细胞的CAT表达量。结果:(1)不同浓度pHGF对HSC-T_6细胞增殖均有明显的抑制作用,与对照组比较有明显差异(P<0.01)。(2)pHGF在200 μg/ml时对转染重组体质粒pCOLH1.5的HSC-T_6细胞的CAT活性具有明显的抑制作用,与对照组相比差异显著(P<0.05);增加pHGF浓度至400μg/ml时,对CAT活性抑制更为明显,与对照组相比差异非常显著(P<0.01)。结论:pHGF对HSC-T_6细胞增殖具有明显的抑制作用;对α1(Ⅰ)胶原基因启动子活性具有负性调控作用。

Ⅰ、Ⅲ型前胶原基因第2外显子核酶对靶RNA的体外切割活性的研究

目的体外研究锤头型α1 Ⅰ型及Ⅲ型前胶原基因第2外显子片段核酶对各自靶RNA分子的切割活性及反应条件.同时观察两反义核酶对瘢痕中成纤维细胞胶原合成的影响.方法将含α1 Ⅰ型及Ⅲ型前胶原基因第2外显子片段的重组质粒(pT-Ⅰ、pT-Ⅲ),经体外32p标记转录后形成产物靶RNA.同时将含特异性核酶基因的重组质粒(pT-g Ⅰ、pT-gⅢ)进行非标记的体外转录,产物(核酶)与各自的32P-靶RNA按不同的条件混和反应,电泳后放射自显影观察结果.将构建好的核酶以脂质体包裹后导入培养的成纤维细胞内,采用图像分析法观察核酶对成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白mRNA合成的影响.结果两种核酶在37℃、42℃均能有效切割各自的靶RNA,对Mg2+浓度的要求范围较宽(10～20mmol/L);反应温度从65℃逐渐降至并维持在37℃的条件下核酶切割活性显著提高.Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白mRNA的表达明显降低,胶原蛋白生成降低,胶原生成明显受抑制.结论针对α1 Ⅰ型及Ⅲ型前胶原基因第2外显子片段的核酶能有效地在体外对靶RNA进行切割并能有效地抑制瘢痕中成纤维细胞胶原的合成.

人皮肤成纤维细胞中α1(Ⅰ)前胶原基因转录调控研究

为寻找纤维化形成中调控人Ⅰ型前胶原基因高水平转录的启动序列及其DNA结合蛋白 ,以人皮肤成纤维细胞α1(Ⅰ )前胶原基因转录起始点上游 - 2 5kb至 + 4 2bp的片段为靶序列 ,采用PCR、基因重组、报告基因测活、细胞基因转染技术比较不同长短启动子活性 .凝胶滞留实验 (EM SA)研究高启动活性片段相应的DNA结合蛋白 .基因转染高活性转录因子识别序列至靶细胞 ,探讨前胶原基因激活阻断的新手段 .结果表明 ,- 2 4 83～ + 4 2bp、 - 2 6 8～ + 4 2bp序列具有强启动调控活性 ,而 - 10 5～ + 4 2bp片段启动活性最低 .EMSA对高启动活性小片段DNA结合蛋白的分析提示 ,- 2 6 8～ + 4 2bp序列中存在转录因子Ap 1、Sp 1、NF 1的特异结合位点 .转染高活性转录因子识别序列Ap 1、Sp 1至靶细胞可竞争性阻断胶原基因启动转录激活 .研究提示 ,人α1(Ⅰ )前胶原基因 - 2 4 83～ + 4 2bp、 - 2 6 8～ + 4 2bp片段有高启动活性 .转录因子Ap 1、Sp 1、NF 1与 - 2 6 8～ + 4 2bp序列中相应识别序列的结合与其基础高转录活性有关 .转染高活性转录因子识别序列Ap 1、Sp

五味子乙素对大鼠肝星状细胞增殖和胶原基因表达合成的影响

目的观察五味子乙素在大鼠肝星状细胞(HSCs)增殖,胶原表达合成方面的作用。方法经在体灌流消化大鼠肝脏分离HSCs,培养于DMEM培养基中,用3H-TdR和3H-pro掺入试验测定五味子乙素对HSCs的增殖和胶原合成影响,并用原位杂交方法探讨了其对HSCⅠ、Ⅲ型前胶原基因的表达作用。结果对于培养活化的HSCs,五味子乙素对HSCs摄取3H-TdR没有明显影响,但在40μmol/L时,剂量依赖地抑制HSCs摄取3H-proline,并在80μmol/L降低Ⅰ型前胶原基因表达(P<0.05)。结论五味子乙素具有降低HSCs胶原基因表达合成作用。

地塞米松抑制转化生长因子β_1对人α_1(Ⅰ)前胶原基因的转录激活

目的 探讨地塞米松与转化生长因子 β1 (TGFβ1 )之间的相互作用及对人α1 (Ⅰ )前胶原基因启动转录的影响。方法 人皮肤及瘢痕成纤维细胞原代、传代培养。采用FuGENE转染试剂 ,分别瞬间转染含人α1 (Ⅰ )胶原基因 5′侧翼序列 - 2 5kb与报告基因氯霉素乙酰基转移酶 (CAT)的重组体 phCOL2 5至人皮肤及瘢痕成纤维细胞。ELISA法测定地塞米松及TGFβ1 作用 2 4h后 ,转染了phCOL2 5的 2种成纤维细胞的报告基因CAT表达量。 结果 地塞米松能抑制转染了 phCOL2 5重组体的人皮肤及瘢痕成纤维细胞CAT表达量 ,且能拮抗TGFβ1 对转染了 phCOL2 5重组体的 2种成纤维细胞CAT表达的上调作用 (P <0 0 5)。结论 在正常皮肤及瘢痕成纤维细胞中 ,地塞米松均能抑制人α1 (Ⅰ )前胶原基因的启动转录 ,且能拮抗TGFβ1 对人α1 (Ⅰ )

低氧对人胚肺成纤维细胞增殖及I型前胶原基因表达的影响

目的阐明低氧在血管壁构形重组中的作用及川芎嗪的疗效机理。方法用细咆计数法及非放射性细胞增殖检测法观察2%低氧对人胚肺成纤维细胞增殖的影响;用Northern印迹杂交法检测2%低氧对人胚肺成纤维细胞Ⅰ型前胶原基因表达的作用及川芎嗪对基因表达的影响。结果低氧24.48及72h能明显促进人胚肺成纤维细胞增殖;低氧24h Ⅰ型前胶原基因表达明显升高;川芎嗪(30μg/ml及10μg/ml)可抑制上述基因表达的升高。结论低氧对人胚肺成纤维细胞有直接利激作用,通过促进其增殖及前胶原基因表达而影响肺血管构形重组和损伤组织的修复。

地塞米松抑制TGF-β_1对人α1(Ⅰ)前胶原基因的转录激活

目的:探讨地塞米松与TGFβ1之间的相互作用及对人α1(I)前胶原基因启动转录的影响。方法:人皮肤及瘢痕成纤维细胞原代、传代培养。采用FuGENE转染试剂,分别瞬间转染含人α1(Ι)胶原基因5'侧翼序列-2.5kb与报告基因氯霉素乙酰基转移酶(CAT)的重组体phCOL2.5至人皮肤及瘢痕成纤维细胞。ELISA法测定地塞米松及TGFβ1作用24h后,转染了phCOL2.5的2种成纤维细胞的报告基因CAT表达量。结果:地塞米松能抑制转染了phCOL2.5重组体的人皮肤及瘢痕成纤维细胞CAT表达量,且能拮抗TGFβ1对转染了phCOL2.5重组体的2种成纤维细胞CAT表达的上调作用(P<0.05)。结论:在正常皮肤及瘢痕成纤维细胞中,地塞米松均能抑制人α1(Ι)前胶原基因的启动转录,且能拮抗TGFβ1对人α1(Ι)前胶原基因的转录激活。

CCl_4诱导大鼠肝纤维化过程中α1（Ⅰ）、α1（Ⅲ）及α1（Ⅳ）前胶原基因表达的动态观察

利用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹杂交技术对ＣＣｌ４诱导大鼠肝纤维化过程中α１（Ⅰ）、α１（Ⅲ）及α１（Ⅳ）３种前胶原ｍＲＮＡ的表达状况进行观察。结果证实α１（Ⅰ）、α１（Ⅲ）及α１（Ⅳ）３种前胶原ｍＲＮＡ的表达均有增加，但三者的变化并不同步。纤维化早期首先是α１（Ⅳ）前胶原ｍＲＮＡ表达增加。随后是α１（Ⅲ）前胶原ｍＲＮＡ，后者在整个肝纤维化过程中呈优势性表达。α１（Ⅰ）前胶原ｍＲＮＡ的增加又滞后于α１（Ⅲ）且上升缓慢，至第２０周时才逐渐与α１（Ⅲ）前胶原ｍＲＮＡ含量相近。可能是由于存在反馈性抑制的缘故，使得前胶原基因表达的上调并非呈直线递增而是曲线上升。

细胞生长因子和维拉帕米在肝细胞胶原合成和前胶原基因表达中的作用

目的：探索肝细胞在肝纤维化形成中的可能作用。方法：用核酸原位分子杂交方法和３Ｈ脯氨酸掺入法，观察原代培养大鼠肝细胞在血小板衍生生长因子（ＰＤＧＦ）刺激前后胶原合成和Ⅰ、Ⅲ型前胶原ｍＲＮＡ的表达及钙拮抗剂维拉帕米对此作用的影响。结果：肝细胞培养一定时间后能够合成胶原，能够表达Ⅰ、Ⅲ型前胶原基因。ＰＤＧＦ能促进肝细胞的胶原合成和前胶原基因表达。但此刺激作用为维拉帕米所抑制。结论：这些研究为肝细胞参与肝纤维化形成提供了实验依据。

创伤后增生性疤痕中α1(Ⅰ)及(Ⅲ)型前胶原基因片段的克隆及鉴定

【目的】胶原蛋白是构成细胞外基质的主要组分之一 ,它的过量沉积是创伤后增殖性瘢痕形成的原因之一 ,本实验的目的就是要克隆出疤痕中α 1(Ⅰ )型及 (Ⅲ )型前胶原基因片段并进行鉴定。【方法】本研究根据α 1(Ⅰ )型及 (Ⅲ )型前胶原基因的核苷酸序列分别设计 3条引物 ,从瘢痕组织中经RT PCR分别扩增Ⅰ及Ⅲ型前胶原基因的第 2外显子 (Exon 2 )区域的基因片段 (ⅠF2 ,ⅢF2 ) ,克隆到T载体 (pGEM Tvector)。得到阳性重组质粒后经限制性内切酶酶切 ,PCR及测序加以证实。【结果】分别获得长度约为 12 9bp的DNA片段 (简称为ⅠF2 ) ,与长度约为 189bp的DNA片段 (简称为ⅢF2 ) ,与预期片段大小一致。得到重组质粒 pT Ⅰ及 pT Ⅲ ,并得到证实。【结论】获得的α1(Ⅰ )型及 (Ⅲ )型前胶原基因片段是预期所要得到的正确片段。

牛磺酸对大鼠贮脂细胞、肝细胞增殖及胶原基因表达的影响

目的:研究牛磺酸对大鼠贮脂细胞、肝细胞增殖及胶原基因表达的影响,为应用牛磺酸防治肝纤维化提供实验依据。方法:分离、培养大鼠贮脂细咆和肝细胞:采用~3H-胸腺嘧啶和~3H-脯氨酸掺入测定细胞增殖及胶原合成:用原位杂交检测I、Ⅲ型前胶原mRNA含量:结果:在5～80mmol/L浓度范围内。牛磺酸能显著抑制贮脂细咆、肝细胞的增殖及胶原合成,并呈时间、剂量依赖性关系:20mmol/L牛磺酸可显著抑制I、Ⅲ型前胶原mRNA的表达。结论:牛磺酸在体外具有抗肝纤维化作用,其对于防治肝纤维化可能有一定的临床意义和应用前景。

实验性石棉肺病变中Ⅰ型及Ⅲ型胶原基因表达的研究

以斑点杂交法测定染溫石棉尘后30天与60天大鼠肺组织中前胶原mRNA的水平,即proα_1(Ⅰ)、proα_2(Ⅰ)、proα_1(Ⅲ)mRNA的水平,并与正常大鼠肺组织对比,结果显示,染石棉尘的肺组织中这三种mRNA显著地高于正常对照组。在染尘后60天时Ⅰ型胶原的两种mRNA仍呈上升趋势,而Ⅲ型胶原的mRNA则呈稳定状态。体外实验的结果表明溫石棉及青石棉纤维都可以刺激2BS细胞中Ⅰ、Ⅲ型胶原基因的表达。矽肺组织来源的致纤维化因子与石棉纤维都具有促进胶原基因表达的作用,其共同作用效果更強。证明这两种因素都参与调节石棉肺的纤维化作用。

血小板源性伤口愈合因子促糖尿病大鼠伤口愈合与成纤维细胞前胶原Ⅰ型(α_1)基因表达的关系

目的研究外源性血小板源性伤口愈合因子（ＰＤＷＨＦ）对糖尿病大鼠伤口愈合的作用及其机理。方法通过糖尿病大鼠背部成对切口伤模型证实ＰＤＷＨＦ应用于伤口局部的情况。结果伤后７、１０及１４天，糖尿病治疗组及糖尿病自身对照组伤口抗张力值分别为１００．９４±１２．７４、２４４．０２±４８．０２、５３５．０８±３６．２６和６５．６６±１１．７６、１１０．７４±２７．４４、２７１．４６±２９．８０Ｎ／ｍ，两组间差异显著（Ｐ＜０．０１）。体外实验发现，生长融合的伤口成纤维细胞与ＰＤＷＨＦ孵育４、８及１２小时后，ＰＤＷＨＧ组前胶原Ⅰ型（α１）ｍＲＮＡ分别较对照组高０．９、３．７及２．２倍。

PCR标记前胶原基因探针及其检测肝星状细胞前胶原基因表达

目的 :建立一种新的前胶原基因探针制备方法 ,并用其检测HSC的前胶原mRNA表达。方法 :从NCBIGeneBank查询Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型前胶原基因的序列 ,根据基因序列用OLIGO软件设计其引物 ;RT PCR扩增基因 ,并用不对称PCR方法和DIG dUTP标记前胶原基因探针 ,用其原位杂交检测HSC前胶原基因表达。结果 :用所设计的引物和RT PCR扩增得到目的基因 ,制备了DIG标记的前胶原基因探针 ,并用其检测到HSC的前胶原基因表达。结论 :建立了一种新的、较简易的前胶原基因探针标记方法 。

粗纤维调节素对小鼠成纤维细胞Ⅰ型前胶原基因表达的影响

为了确定粗纤维调节素（Ｕｎ） 是否具有促进成纤维细胞Ⅰ型胶原合成的作用， 我们采用地高辛原位杂交和斑点杂交技术， 观察了Ｕｎ 对小鼠成纤维细胞（ＮＩＨ／３Ｔ３） Ⅰ型前胶原ｍ ＲＮＡ转录的影响； 结果发现Ｕｎ 对体外培养的３Ｔ３ 细胞Ⅰ型前胶原基因转录具有促进作用； 提示Ｕｎ 不仅作为一种细胞外基质而存在， 并且还有促进胶原合成的功能。

表皮生长因子在糖尿病大鼠伤口愈合过程中的机理初探

目的 研究表皮生长因子 (EGF)对糖尿病大鼠伤口愈合过程中的影响及其可能机理。方法 体外实验测定表皮生长因子对伤口成纤维细胞的增殖作用及其前胶元Ⅰ (α1)mRNA ,并通过糖尿病大鼠背部切口伤模型证实EGF应用于伤口局部的情况。结果 体外实验发现EGF可促进伤口成纤维细胞增殖并使其前胶元Ⅰ (α1)mRNA明显升高。糖尿病治疗组伤后 7、10、14天伤口抗张力明显高于糖尿病自身对照组 ,两组间差异显著 (P <0 .0 1)。结论 EGF可能通过刺激伤口成纤维细胞增殖及其前胶元Ⅰ (α1)

干扰素α-2b局部治疗对增生性瘢痕Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白及前胶原蛋白基因原位表达作用的研究

目的 探讨干扰素α 2b在活体上对增生性瘢痕Ⅰ、Ⅲ型胶原的作用及作用环节。方法 对局部注射干扰素α 2b后 3天及 7天的 6例增生性瘢痕应用免疫组织化学和原位杂交技术 ,进行了Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白和Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA的原位表达的测定。结果 ①干扰素α 2b在局部注射后 7天 ,Ⅰ型胶原蛋白量减少 (P <0 .0 5 ) ,但Ⅲ型胶原蛋白量无明显减少 (P >0 .0 5 ) ;②干扰素α 2b在局部注射后 3天 ,Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达明显抑制 ,至注射后 7天 ,Ⅰ型前胶原mRNA被进一步抑制 ,而对Ⅲ型前胶原mRNA抑制缓解。③干扰素α 2b对Ⅰ型前胶原mRNA表达的抑制要比Ⅲ型前胶原mRNA强。结论 干扰素α 2b通过抑制前胶原基因的表达从而抑制Ⅰ。

活血止痛汤对硬膜外瘢痕凋亡基因p53及Ⅰ、Ⅲ型前胶原蛋白mRNA表达的影响

目的:探讨活血止痛汤对硬膜外瘢痕凋亡基因p53及Ⅰ、Ⅲ型前胶原蛋白mRNA表达的影响。方法:将45只雌性新西兰白兔随机分成假手术组(A组)、空白对照组(B组)和活血止痛汤组(C组),每组15只。手术切除B组和C组白兔的L4、L5椎板,造成1.0 cm×1.0 cm硬脊膜裸露区。术后对C组白兔予以活血止痛汤灌胃2周。术后第2、4、8周末时每组各处死动物5只,观察硬膜外瘢痕组织与硬膜的粘连程度,以逆转录聚合酶链式反应测定其硬膜外瘢痕组织中p53及Ⅰ、Ⅲ型前胶原蛋白mR-NA的表达水平。结果:A组无硬膜外瘢痕形成,C组硬膜外瘢痕组织与硬膜粘连程度较B组轻。B、C组各时相的p53及Ⅰ、Ⅲ型前胶原蛋白mRNA的表达水平均高于A组(P<0.05)。术后第2、4、8周末时,C组p53及Ⅰ、Ⅲ型前胶原蛋白mRNA的表达水平均低于B组(P<0.05)。总体观察也发现C组较B组粘连程度明显低(P<0.05)。结论:活血止痛汤可能通过调节p53及Ⅰ、Ⅲ型前胶原蛋白mRNA的表达,减少了椎板切除术后成纤维细胞增殖和胶原等细胞外基质的沉积,减少了硬膜外瘢痕增生、粘连。

外源性脯氨酸羟化酶对人RPE细胞中缺氧诱导因子通路的负向调节作用

背景目前抗VEGF药物的应用已广泛用于眼部新生血管性疾病发病的治疗，但有部分患者的疗效并不理想，因此研究VEGF的上游基因缺氧诱导因子-1（HIF—1）及其限速酶脯氨酸羟化酶（PHDs）在新生血管形成中的作用具有重要的临床意义。目的探讨外源性PHDs在HIF-1激活通路中的负性调节作用。方法用Hela细胞提取RNA，采用逆转录PCR法从cDNA克隆PHD1、PHD2和PHD3，通过限制性内切酶构建pFLAG—PHD1、pFLAG—PHD2和pFLAG—PHD3质粒并通过基因测序进行鉴定。分别将人RPE细胞株（ARPE-19）在体积分数21％O2（常氧组）、1％O2（低氧组）和缺氧模拟剂（CoCl2，缺氧组）条件下进行培养，将pFLAG—PHD1、pFLAG—PHD2和pFLAG—PHD，质粒分别转染至培养的ARPE-19细胞中，pFLAG—CMV2转染作为空白对照。采用Westernblot法测定和比较转染细胞在不同氧环境培养下PHD1、PHD2和PHD3蛋白的表达强度；采用双荧光素酶报告系统评估各组细胞中HIF-1的转录活性。结果Westernblot法检测显示常氧组、低氧组和缺氧组ARPE-19细胞中均有PHD1、PHD2和PHD3蛋白的表达，各组细胞中PHD2的表达条带均强于PHD1和PHD3蛋白，差异均有统计学意义（P〈0．05）。pFLAG—CMX转染后常氧组细胞中内源性HIF-1活性反应低，低氧组和缺氧组细胞中HIF-1的转录活性明显升高，与空白对照组相比，pFLAG—PHD1、pFLAG—PHD2、pFLAG—PHD3转染后常氧组细胞中内源性HIF-1活性反应无明显变化（F=0．48，P〉0．05），而低氧及缺氧组细胞中HIF-1活性明显下降，与空白对照组比较差异均有统计学意义（F=24．30，112．67，均P〈0．05）。相同培养条件下，pFLAG—PHD：转染后细胞中HIF-1活性明显低于pFLAG—PHD，和pFLAG—PHD，转染细胞，差异均有统计学意义（均P〈0．05）。结论PHDs对人RPE细胞中HIF-1的激活通路有明显的负向调节作用，其对低氧细胞和缺氧细胞中HIF-1转录活性的抑制作用明显强于常氧细胞，其中PHD2抑制HIF调节通路的作用明显强于PHD1和PHD3。