测定HepG2细胞内^13C标记氨基酸及代谢物同位素丰度的方法

目的利用稳定同位素和气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometer,GC-MS)衍生化法检测四君子汤(Sijunzi Decoction,SJZD)与丝裂霉素C(mitomycin C,MMC)联用对HepG2细胞内丙氨酸代谢的影响,探讨不同给药组与空白组HepG2细胞内丙氨酸代谢的差异及其意义。方法 HepG2细胞分4组(空白组、SJZD组、MMC组和SJZD与MMC联用组),分别给^13C标记丙氨酸(^13C-labeled alanine,^13C-Ala)培养12 h,回收细胞并加入体积分数为80%的甲醇溶液超声破碎后,离心取上清液,氮吹仪吹干,用体积分数为1%三甲基氯硅烷(trimethylchlorosilane,TMCS)的N-甲基-N-(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺(N-methyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide,MSTFA)衍生化,利用GC-MS检测并分析检测结果。结果 ^13C-Ala同位素丰度在10.00%~98.00%内均可以被准确测定,所建立的方法具有良好的准确度和精密度,用该方法对10组供试品进行测定,并根据EI图谱的离子碎片信息对^13C-Ala同位素丰度进行计算,统计分析结果显示,空白组与SJZD组无显著性差异(P>0.05),空白组与MMC组有极显著性差异(P<0.01),联用组与MMC组有极显著性差异(P<0.01);采用相对峰面积(Area%)比较各组之间的差异,所得结果与采用同位素丰度进行计算的结果一致。^13C-Ala下游产物乳酸的代谢采用同位素丰度进行计算,结果显示:各组之间无显著性差异。但Area%结果显示:SJZD组与空白组比较无显著性差异(P>0.05),MMC组与空白组有极显著性差异(P<0.01),联用组与MMC组相比有极显著性差异(P<0.01)。结论 SJZD单独作用对丙氨酸及其代谢产物乳酸的影响不大,与MMC联用给药后对MMC的干扰有明显的抑制作用,所得结果与前期靶向代谢组学的结论相一致,本方法可作为HepG2细胞内氨基酸更为精确的测定方法,具有良好的应用前景。

气相色谱-质谱法研究13C标记脂肪酸的同位素丰度和化学纯度

稳定同位素13 C标记的脂肪酸呼气试验被广泛地应用于医学临床研究。本实验利用脂肪酸在EI质谱中共有的麦氏重排碎片离子,建立了通用的稳定同位素13 C标记(羧基位或α位)短链及中链脂肪酸同位素丰度的气相色谱-质谱(GC/MS)检测方法,并考察了稳定同位素样品的"同位素记忆效应"和样品配制浓度对检测结果的影响。以上海化工研究院研制的乙酸-1-13 C和辛酸-1-13 C为样品,测得两者的同位素丰度分别为98.5%和98.7%,精密度优于0.06%;实验还发现,EI源和ESI源对中链脂肪酸辛酸-1-13 C同位素丰度的测定结果一致,且具有良好的精密度。该方法可以实现对13 C-脂肪酸同位素丰度和化学纯度的同时测定。

酶催化法测定^(13)C标记尿素同位素丰度

建立酶催化法测定^(13)C标记尿素同位素丰度的快速检测方法。在特殊制作的三球反应管中经过2步反应:(1)利用脲酶的专一性将尿素-^(13)C催化转化生成碳酸铵-^(13)C,在40℃下,反应5 min;(2)经过酸化生成^(13)C标记CO_(2),将气体引入MAT-271气体同位素质谱仪中,检测质荷比为44和45离子流强度,并计算^(13)C同位素丰度。结果表明,测定值与标样的^(13)C标示值误差在0.1%以内,精密度RSD<0.1%,建立的检测方法与现行行业标准方法测试结果基本一致,该方法操作相对简便快速、专一性强,适用于呼气试验诊断试剂及原料药尿素-^(13)C中同位素丰度的快速检测。

气相色谱法测定稳定同位素^13(C)标记辛酸纯度的不确定度评定

根据行业标准《稳定同位素^13(C)标记的辛酸》(HG/T 5941—2021),采用气相色谱法测定稳定同位素^13(C)标记的辛酸纯度,对测定过程中的不确定度来源进行了分析,主要为标准溶液配制、标准曲线拟合、样品制备和样品测量重复性等。按《测定不确定度评定与表示》(JJF 1059.1—2012)的规定进行不确定度计算,稳定同位素^13(C)标记的辛酸纯度的测量不确定度来源主要为标准溶液配制与标准曲线拟合,其合成标准不确定度为0.817%,扩展不确定度为1.6%,测定结果为99.0%±1.6%(k=2)。

基于高分辨液质联用的双标记氨基酸同位素丰度测定方法研究

近年来,稳定同位素标记化合物,尤其是同位素标记氨基酸在合成生物学、蛋白质组学、代谢组学等前沿科学研究中发挥着越来越重要的作用。建立了一种基于高分辨液质联用的双标记氨基酸同位素丰度检测方法,以^(13)C_(2),^(15)N-甘氨酸为例,考察了样品浓度、质谱扫描张数等影响因素对同位素丰度计算结果的影响,结果表明该方法具有良好的准确性和稳定性,所需样品用量少,操作简单,有望成为一种简便、通用的同位素试剂质控方法;也将为代谢组学、海洋学等同位素示踪技术应用研究提供数据支持。

土壤呼吸及其^(13)C同位素测定方法的对比研究

为比较不同方法在土壤呼吸及其^(13)C同位素测定中的差异,应用气相色谱仪法(GC-TCD)、稳定同位素比值质谱仪气体进样法(Gasbench-IRMS)、甲酚红显色法(MicroResp)、碱液吸收法4种方法测定土壤呼吸速率,并采用Gasbench-IRMS法和碱液吸收法两种方式检测土壤呼吸的^(13)C同位素丰度,以期准确评估土壤呼吸及碳排放,并为相关研究提供参考。结果表明:(1)两种仪器法(GC、IRMS)测定土壤呼吸速率的数值结果相近(基础呼吸)或趋势一致(诱导呼吸),且重复性好(标准偏差分别为0.011、0.010mg/(kg·h)),准确度高;MicroResp法的测定结果与仪器测量值较为相近,但分辨率较低;碱液吸收法的测定结果较真实值偏高(当土壤有机质含量低时)或偏低(当土壤有机质含量高时)。(2)在测定CO_(2)中的^(13)C含量上,Gasbench-IRMS法直接测定的结果误差小(δ^(13)C值的标准偏差为0.137‰),接近实际值,可以准确地反映出土壤微生物呼吸对底物的利用状况。综上,仪器法较化学分析法(MicroResp、碱液吸收)更能准确测定土壤呼吸及其^(13)C同位素。

^(13)CMFA过程中GC-MS分析菌体蛋白氨基酸的^(13)C标记丰度

基于13C标记的代谢通量分析(13CMFA)由于具有准确性和应用性已成为国际上代谢工程研究的热点,其中一个至关重要的问题就是分析菌体蛋白氨基酸的13C标记丰度信息。用含20%全标记葡萄糖([U-13C])和80%天然葡萄糖的合成培养基喂养维生素B12生产菌Pseudomonas denitrifican,然后在稳态条件下取20mg带13C标记菌体用1ml6mol/L盐酸95℃水解24h得到带13C标记的菌体蛋白氨基酸;氨基酸经分离、浓缩、真空干燥、MBDSTFA衍生化后得到的TBDMS衍生物可以用气相色谱-质谱(GC-MS)进行分析,最后分析质谱图得到15种菌体蛋白氨基酸的13C标记丰度信息。成功获得菌体蛋白氨基酸13C标记丰度信息的实验方法和样品处理技术,为13CMFA在国内进一步发展提供了参考意义。