嗜热芽胞杆菌α-环糊精葡萄糖基转移酶在枯草芽胞杆菌中的表达

【目的】构建分泌表达α-环糊精葡萄糖基转移酶(α-CGTase)的重组枯草芽胞杆菌,实现α-CGTase的安全高效表达。【方法】通过PCR法扩增嗜热地芽胞杆菌α-CGTase基因,运用EcoRI/XhoI分别对α-CGTase基因及pBES进行双酶切,然后将该基因片段插入到大肠杆菌-枯草芽胞杆菌穿梭载体pBES中,再电转化法转化枯草芽胞杆菌RIK1285;对重组枯草芽胞杆菌B.subtilisRIK1285/pBE-CGT发酵条件进行探索。【结果】(1)利用发酵培养基分泌表达α-CGTase,重组枯草芽胞杆菌工程菌B.subtilisRIK1285/pBE-CGT发酵上清液产酶达到2.9U·mL-1。(2)TB为最适发酵培养基(配方:甘油0.5%,蛋白胨1.2%,酵母粉2.4%,K2HPO41.64%,KH2PO40.23%);在初始pH6.5,温度为37℃下,摇瓶发酵培养24h后,α-环糊精酶的环化活性达到5.3U·mL-1,是野生菌株嗜热地芽胞杆菌(0.66U·mL-1)的8倍。【结论】成功构建了枯草芽胞杆菌B.subtilisRIK1285/pBE-CGT工程菌,并确定其最适发酵培养基和培养条件。

利用重组大肠杆菌生产α-环糊精葡萄糖基转移酶

将来源于软化类芽孢杆菌(Paenibacillus macerans)的α-环糊精葡萄糖基转移酶(α-CGT)基因插入含pelB信号肽的质粒pET-20b(+)中,构建了表达载体pET-20b(+)/cgt,并将其转化表达宿主E.coliBL21(DE3)。对重组菌E.coliBL21/pET-cgt进行摇瓶发酵条件的优化,确定了其胞外表达α-CGT酶的最适条件:葡萄糖8 g/L,乳糖0.5 g/L,蛋白胨12 g/L,酵母膏24 g/L,K2HPO472 mmol/L,KH2PO417 mmol/L,CaC l22.5 mmol/L;初始pH为7.0,诱导温度为25℃。在该条件下培养90 h后最终α-CGT酶的胞外比活达到22.1 U/mL,与来源菌P.macerans所产天然酶比活相比提高了42倍,实现了α-CGT酶的高效生产。将基因工程菌在上述条件下于3 L发酵罐中发酵,90 h后胞外酶比活达到22.6 U/mL,证实了工业化放大的可能性。

一种α-环糊精葡萄糖基转移酶的纯化及性质研究

报道了一种主要转化产物是α-环糊精的环糊精葡萄糖基转移酶的纯化、酶学性质和转化特性。将发酵上清液通过硫酸铵分级沉淀、疏水柱层析和离子交换层析获得表观电泳纯的酶蛋白。纯酶的分子量约为75kDa,等电点5.3。最适反应温度为50℃,最适反应pH为6。对可溶性淀粉的Km和Vmax值分别是50mg/ml和6.07mg/ml/min。色氨酸残基为酶活力的必需基团。酶的N末端序列为-SPDTSVDNKV-。Ca2+,Zn2+,Fe3+,Cu2+,Fe2+,Ag+对酶活力有强烈抑制作用。纯酶催化转化条件试验表明,廉价的马铃薯淀粉是酶催化制备α-CD的适宜底物,最佳转化条件为:酶量200μ/g淀粉,温度40℃,反应时间24h,总转化率达41%,其中α-环糊精占总转化产物的78%。因此,该酶不仅表现出特殊的酶学特性,而且有较好的产业化开发前景。

响应面法优化多黏芽孢杆菌产α-环糊精葡萄糖基转移酶发酵培养基

为了提高多黏芽孢杆菌YLW-8产α-环糊精葡萄糖基转移酶的能力,对培养基条件进行优化,并利用优化后的培养基条件考察培养时间及不同初始p H对YLW-8产酶的影响。采用Plackett-Burman重要因素筛选实验筛选出影响产酶的3个主要因素:玉米淀粉、麸皮、磷酸氢二钾。在此基础上利用最陡爬坡实验逼近最大响应值区域,最后利用中心组合实验确定主要因子之间的交互作用及最佳条件。结果表明,玉米淀粉1%,硫酸铵0.15%,麸皮1.5%,碳酸钙0.5%,蛋白胨0.5%,磷酸氢二钾0.01%,酵母膏0.4%,硫酸镁0.015%时,α-环糊精葡萄糖基转移酶的酶活为3089.8U/m L,利用该培养基条件培养时间可缩短至3d,初始p H8.0。该条件可以降低染菌的几率,大大减少生产成本,可应用于α-环糊精生产工业。

重组α-环糊精葡萄糖基转移酶表达条件的优化及其产物专一性的分析

将来源于Bacillus sp 602-1的α-环糊精葡萄糖基转移酶(α-CGT)基因(cgt)插入到表达载体PQE30中,构建重组质粒PQE30/cgt,成功转化宿主菌E.coli M15后,得到重组菌株E.coli M15(PQE30/cgt)。在IPTG的诱导下得到酶表达的最适条件:TB培养基,0.01 mmol/L IPTG,诱导温度16℃,胞内酶比活力最高可达5 209 U/mL;加入IPTG 24 h后,添加甘氨酸和甘露醇会促使酶向胞外分泌。酶蛋白自诱导表达的适宜条件为在TB培养基中添加乳糖3.0 g/L,葡萄糖1.2 g/L,16℃培养96 h,酶比活力达到8 635 U/mL,明显高于IPTG诱导的效果。通过SDS-PAGE验证了上述结论。酶催化转化实验表明:重组酶转化质量分数为1%可溶淀粉24 h后,α-环糊精(α-CD)转化率可达38.2%,α和β的峰面积比约为3.4∶1,α-CD具有较高的专一性,因此该重组α-CGT酶具有较好的工业化应用前景。

α-环糊精葡萄糖基转移酶菌株的筛选与鉴定

从富含淀粉的土样中,初筛出22株产α-环糊精葡萄糖基转移酶菌株,然后用透明圈法筛选出3株酶活力较高的菌株,最后绘制酶活力曲线,得到一株酶活力为0.64U/mL的菌株N1.通过菌落形态、显微观察和生理生化特性,鉴定N1为肠杆菌科的产酸克雷伯氏菌.

α-环糊精葡萄糖基转移酶高产菌株YLW-8的鉴定

[目的]鉴定α-环糊精葡萄糖基转移酶高产菌株YLW-8。[方法]通过分析YLW-8菌株的形态、生理生化反应及16Sr DNA基因序列鉴定菌株的种类,并对YLW-8产α-环糊精葡萄糖基转移酶(α-CGTase)基因进行序列测定和同源性分析。[结果]菌株YLW-8根据形态、生理生化反应初步鉴定其属于芽孢杆菌属(Bacillus),其16Sr DNA基因序列(Gen Bank登录号为KF010776)与多粘芽孢杆菌同源性高达99%以上。结合形态、生理生化特性以及16Sr DNA序列分析,鉴定YLW-8菌株为多粘芽孢杆菌(Paenibacillus)。YLW-8产α-CGTase基因测序结果在NCBI中进行比对,与Paenibacillus macerans的α-CGTase基因的同源性为99%(GenBank登录号为KF010775)。[结论]该研究为后续α-CD工业化生产研究提供技术参数和理论依据。

基因工程大肠杆菌发酵生产α-环糊精葡萄糖基转移酶的培养基优化

对基因工程大肠杆菌发酵生产α-环糊精葡萄糖基转移酶的培养基进行了优化,首先通过单因素试验,挑选出对菌株产酶有较大影响的因子及浓度范围,再通过两水平析因试验和最陡爬坡试验确定显著影响因子和浓度拐点,最后采用响应面分析法确定得到培养基成分的最佳配比为:甘油10.74g·L-1,酵母提取物51.85g·L-1,酵母蛋白胨10g·L-1,磷酸氢二钾22.82g·L-1,磷酸二氢钾2.85g·L-1。与原始培养基生产水平相比,采用优化培养基后,酶活提高了48.4%。

α-环糊精葡萄糖基转移酶的高效表达及酶法制备AA-2G条件优化

目的构建分泌表达α-环糊精葡萄糖基转移酶(α-Cyclodextrin Glycosyltransferase,α-CGTase)的重组菌株,并利用该酶液制备AA-2G。方法经PCR扩增浸麻芽孢杆菌154基因组获得α-CGTase基因序列,将该基因序列和p ET26b载体分别经Nco I、Xho I双酶切后用T4 DNA连接酶连接,并转化大肠杆菌BL21。利用发酵培养基分泌表达α-CGTase,利用该酶和淀粉糊精、维生素C反应制备AA-2G,并进行制备条件优化。结果在大肠杆菌中实现了α-CGTase的胞外分泌表达,胞外环化酶活力达到120 U/m L,利用该酶的转糖基反应将淀粉糊精、维生素C转化为AA-2G,经HPLC检测正确。结论利用自制α-CGTase得到了AA-2G,通过制备条件优化AA-2G产量为17.46 g/L,转化率达到58.2%(mg/mg)。

金属离子对重组大肠杆菌发酵生产α-环糊精葡萄糖基转移酶的影响

本文研究了金属离子对α-环糊精葡萄糖基转移酶发酵生产的影响。首先,采用单因素分析确定几种微量元素的最佳产酶浓度;其次,通过两水平析因试验确定了关键的影响因子及其最大响应区域,其分别是Mg SO4·7H2O,Fe SO4·7H2O,MnSO4·H2O;最后,通过Box-Benhnken中心组合试验建立数学模型,并采用响应面分析法获得了微量元素的最优配比参数为:MgSO4·7H2O 10.94 mmol·L-1,Fe SO4·7H2O 6.48 mmol·L-1,Mn SO4·H2O 0.51 mmol·L-1,Ca Cl2·5H2O 3 mmol·L-1。与对照组相比,酶活提高了1.4倍。

产α-环糊精葡萄糖基转移酶的菌株筛选、鉴定与酶学性质的初步研究

从上海浦东新区新场镇某农场种植田筛选出1株高产α-环糊精葡萄糖基转移酶的菌株,初步研究其酶学性质,以获得有良好热稳定性和pH稳定性的酶。通过形态学特征、生理生化试验鉴定和16S rRNA序列比对分析,确定该菌株为浸麻类芽孢杆菌(Paenibacillus macerans),命名为P.macerans TLLY7。酶学性质测定结果表明,该酶的酶活性为1.35 U/mL,其最适反应温度为50℃、最适反应pH值为6.0,并且在40~45℃、pH 6.0~9.0稳定性良好。Ca^(2+)、Mn^(2+)和Zn^(2+)对酶表现出促进作用,Fe^(2+)、Cu^(2+)和Co^(2+)则对该酶表现出抑制作用。其中Ca^(2+)对酶的促进作用最强,酶活性促进率为25%,Cu^(2+)对酶的抑制作用最强,酶活性抑制率为33%。K^(+)、Mg^(2+)对酶活性的影响较小。菌株TLLY7所产α-环糊精葡萄糖基转移酶的酶学性质初步研究表明其具有深入研究的价值和应用的潜力。

复合诱变选育高产α-环糊精葡萄糖基转移酶的菌株及产酶条件优化

对出发菌株Paenibacillus macerans TLLY7进行紫外-微波复合诱变,以获得高产α-环糊精葡萄糖基转移酶的菌株,并用响应面法优化复合诱变菌株的发酵条件来提高酶活力。确定了紫外、微波诱变的最佳条件:20 W紫外灯照射70 s,微波低火档辐照60 s。筛选出复合诱变菌株UM2-6,经过8次连续传代培养,验证其遗传性能较稳定,菌株酶活力可达3.09 U/mL,是出发菌株酶活力(1.35 U/mL)的2.29倍。在单因素试验的基础上,通过Plackett-Burman试验筛选出影响发酵的3个显著性因素:培养温度、初始pH、接种量,设计Box-Behnken中心组合试验确定菌株最优发酵条件。结果表明,最佳发酵培养基成分为可溶性淀粉10 g/L、酵母浸粉10 g/L、NaCl_(2)g/L、CaCl_(2)0.2 g/L、K_(2)HPO 4·3H_(2)O 1 g/L,最佳发酵条件为培养温度37.1℃、初始pH 6.9、接种量4%,此时突变菌株UM2-6产α-环糊精葡萄糖基转移酶的酶活力为4.19 U/mL,为优化之前酶活力(3.09 U/mL)的1.36倍。该研究为进一步工业化开发利用性状稳定且高产α-环糊精葡萄糖基转移酶的菌株提供了借鉴。

基因工程大肠杆菌发酵生产α-环糊精葡萄糖基转移酶的培养基优化

所谓的基因工程就是利用现有的基因拼接技术以及DNA重组技术在分子水平上对基因实施比较复杂的操作,也就是将外源基因重新导入受体细胞中,这样一来,根据受体细胞自身的复制、转录、翻译等工作的持续进行,能够将外源基因所拥有的性状很好地表达出来。主要论述的是基因工程中大肠杆菌发酵生产α-环糊精葡萄糖基转移酶的培养基优化具体操作以及成果和结论,希望通过全文的论述,能够更好地给我国未来基因工程研究提供有价值的参考。

产环糊精葡萄糖基转移酶的菌株选育及酶分子改造研究进展

环糊精(cyclodextrin,CD)因其内疏水外亲水的特殊结构被广泛运用,而酶法制备CD是常用方法,主要应用环糊精葡萄糖基转移酶(cyclodextrin glycosyltransferase,CGT酶)。该文对产CGT酶的菌株选育和酶分子改造这两方面进行综述,重点讨论提升酶表达量的4种异源表达常用优化策略:产酶条件优化、信号肽选择、启动子优化、密码子优化,以及定点突变、定点饱和突变、易错PCR这3种常用的酶分子改造方法对酶相关特性的影响。

环糊精葡萄糖基转移酶my20结构域删除突变体的表达和酶学性能

本实验以海洋来源的环糊精葡萄糖基转移酶(cyclodextrin glycosyltransferase,CGTase)my20为研究对象,构建了D、E以及DE结构域截短突变体,通过pET-24a载体和宿主菌E.coli BL21(DE3)进行异源表达,并利用镍亲和层析柱纯化得到纯酶。以my20环化比活力为100%计,my20ΔD、my20ΔE、my20ΔDE相对环化活力分别约为197%、22%、17%,表明E结构域是CGTase催化环化反应的重要结构域,D结构域的存在可能降低了底物分子进入催化结构域的能力。my20为耐热酶,3种截短突变酶相较之下耐热性均有不同程度的降低,说明D、E结构域在CGTase耐热性方面具有重要的作用。my20在缺失了DE结构域后,催化产物中α-环糊精占比相较其他截短酶提升约8%,表明缺失DE结构域影响其产物的特异性。本实验结果可为CGTase通过结构域改造在工业生产方面发挥作用提供一定的理论基础。

Bacillus stearothermophilus NO2环糊精葡萄糖基转移酶Leu277突变提高α-环糊精产量

环糊精葡萄糖基转移酶(cyclodextrin glucosyltransferase,CGTase)能够以淀粉为底物发生环化反应生成环糊精,包括α-环糊精(α-cyclodextrin,α-CD)、β-环糊精及γ-环糊精,其中α-环糊精产量低且易降解。该研究选择Bacillus stearothermophilus NO2来源的CGTase,考察其突变体E142P、L277M、L277F、E142P/L277M、E142P/L277F、L277M/N353A及L277F/N353A以可溶性淀粉为底物生产α-CD的能力。与野生型相比,最优突变体为E142P/L277M,α-环糊精产量提高1.7 g/L,且在产物中占比提高14.3%。分子动力学(molecular dynamics,MD)模拟结果表明,E142P/L277M突变体中2个突变位点相互影响较小。此外,L277M/N353A催化效果较差,MD结果表明该突变体整体结构变化较大且溶剂可及表面积增大,不利于转糖苷反应的发生。该研究为CGTase的分子改造提高环化反应活性以及CGTase在α-环糊精工业化生产中提升产量提供了新思路。

环糊精葡萄糖基转移酶合成AA-2G反应条件初探

为了探究重组菌株pET-28a(+)-cgt-T1/BL21(DE3)产生的环糊精葡萄糖基转移酶(Cyclodextrin glucosyltransferase,CGTase)催化合成2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸(Ascorbic acid 2-glucoside,AA-2G)的效果,用LB发酵培养基表达重组蛋白CGTase-T1,经亲和纯化柱纯化并浓缩后,测定其β-环化活性和歧化活性。以维生素C(Vitamin C,V_(C))和β-环糊精为底物,酶法合成AA-2G,并通过单因素优化实验,进一步探究了不同糖基供体、底物浓度、pH、温度、底物比例、蛋白浓度以及反应时间对AA-2G产量的影响,对酶合成AA-2G的动力学进行了分析。结果表明:此酶具有合成AA-2G的能力,未优化前AA-2G的产量为0.67 g/L。优化后,考虑到低成本和经济效益,选择可溶性淀粉和麦芽糊精为糖基供体,当糖基供体为可溶性淀粉时,底物浓度为70 g/L,反应pH4.5,反应温度37℃,底物比例3/3(VC/糖基供体),蛋白浓度5.0 mg/mL,反应时间为42 h时,该重组CGTase催化合成AA-2G的产量最高能达到12.68 g/L;当糖基供体为麦芽糊精时,底物浓度为30 g/L,反应pH5.0,反应温度37℃,底物比例4/2,蛋白浓度5.0 mg/mL,反应时间为30 h时,该重组CGTase催化合成AA-2G的产量最高能达到4.96 g/L。在最适条件下,AA-2G的产量分别是未优化反应条件下的18.93倍和7.40倍。经动力学分析发现可溶性淀粉作为糖基供体的催化效率高于麦芽糊精,因此,可溶性淀粉作为糖基供体比麦芽糊精更具有优势,合成得到AA-2G的产量更高。本研究成功将重组CGTase-T1用于AA-2G的合成,通过优化酶法合成的反应条件,使AA-2G的产量得到了大幅提高,为实现AA-2G的工业生产提供参考意义。

甘油三酯-葡萄糖指数与γ-谷氨酰基转移酶在中青年代谢综合征诊断中的临床应用

目的探讨甘油三酯-葡萄糖(TyG)指数与γ-谷氨酰基转移酶(GGT)预测中青年代谢综合征(MS)的临床价值。方法选取2022年12月至2023年9月在首都医科大学附属北京世纪坛医院肥胖与代谢中心住院治疗的151例中青年MS患者作为研究对象(MS组),另选取同期在医院进行健康体检者130例作为对照组,分别测定两组的代谢及炎症指标。MS组根据MS组分数目分为MS3组(101例)、MS4组(32例)及MS5组(18例),比较三组TyG指数、GGT水平。采用Pearson相关检验分析TyG指数、GGT与MS诊断指标的相关性。通过多因素logistic回归分析MS发生的危险因素。使用受试者操作特征(ROC)曲线评估TyG指数、GGT预测MS的价值。结果MS组患者TyG指数、GGT显著高于对照组,MS5组TyG指数、GGT显著高于MS3组和MS4组,差异均有统计学意义(P<0.05)。Pearson相关分析显示,TyG指数、GGT水平与体重指数、舒张压、收缩压、空腹血糖、甘油三酯呈正相关(P<0.05),与高密度脂蛋白胆固醇呈负相关(P<0.05)。Logistic回归分析显示,TyG指数、GGT均为MS的危险因素。ROC曲线分析显示,TyG指数、GGT预测MS的曲线下面积(AUC)分别为0.72(95%CI 0.66~0.781)、0.675(95%CI 0.612~0.739)结论中青年MS患者TyG指数、GGT表达明显增高,二者均与MS的发生密切相关。

多黏芽孢杆菌产ɑ-环糊精葡萄糖基转移酶在大肠杆菌中的可溶性表达及其转化产物特异性研究

通过设计简并引物,从Paenibacillus macerans YLW菌株中克隆到其α-环糊精葡萄糖基转移酶(α-CGTase)基因,构建重组质粒α-CGTase-p ET28a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),得到重组菌株α-CGTase-p ET28a/BL21(DE3)。在16℃,1m M IPTG条件下诱导15 h,实现了α-CGTase的可溶性表达,胞内酶活达到10046U/m L,是野生菌株胞外酶活的3.25倍。经镍柱一步法亲和纯化α-CGTase后,酶蛋白纯化了6.05倍,酶收率28.82%,通过SDS-PAGE检测获得表观电泳纯酶蛋白。酶催化转化实验表明:重组α-CGTase酶转化质量分数为5%的马铃薯淀粉15 h后,环糊精的总转化率可达40.7%,转化生成α-CD,β-CD,γ-CD比例分别为:43.6%、41.8%和14.6%。该重组酶对α-CD具有较好的转化专一性,通过转化条件的进一步优化将具有非常好的产业化开发前景。

β-环糊精葡萄糖基转移酶的固定化及其酶学性质

采用吸附-交联法对β-环糊精葡萄糖基转移酶(β-cyclodextrin glycosyltranserase,β-CGTase)进行固定化,对吸附载体进行了比较和筛选,优化了交联条件,并对固定化后酶的催化特性进行了初步分析。研究表明阴离子交换树脂D380对β-CGTase的吸附性较好;固定化的最佳条件为:戊二醛浓度0.02%、pH 8.0、4℃和固定化8 h,固定化后β-CGTase的酶活可达842 U/g。固定化β-CGTase的热稳定性显著提高,具有良好的操作稳定性;与游离态相比,固定化β-CGTase催化瑞鲍迪苷A形成的产物较少,显现出更佳的催化特异性。