广州市从化区育龄人群α-珠蛋白生成障碍性贫血筛查及基因鉴定结果分析

目的了解和分析广州市从化区育龄人群中α-珠蛋白生成障碍性贫血发病率及基因突变类型。方法应用血细胞分析和血红蛋白电泳对24083例育龄人群血样进行初筛,初筛阳性者采用跨越断裂点聚合酶链反应(GAP-PCR)和PCR反向点杂交技术检测α-珠蛋白变异基因,使用PCR反向点杂交方法检测β-珠蛋白17种常见突变基因。结果经基因鉴定共检出α-珠蛋白生成障碍性贫血基因异常者2596例,异常发生率10.78%。α-β复合基因突变者170例,复合发生率0.71%。在突变基因中,包括缺失型2550例,占98.23%;非缺失型46例,占1.77%。共含有14种基因突变类型,其中血红蛋白H(HbH)病5种,以--^(SEA)/-α^(3.7)为主;轻型4种,--^(SEA)/αα基因型达到了68.61%;静止型5种,占比最高的前两种基因型为-α^(3.7)/αα和-α^(4.2)/αα。αβ复合基因突变类型检出23种,检出率最高的前六种分别为--^(SEA)/β^(CD41-42),-α^(3.7)/β^(CD41-42),--^(SEA)/β^(654),--^(SEA)/-28,-α^(3.7)/β^(654)和-α^(3.7)/βCD17,占全部复合类型的75.27%。结论广州市从化区α-珠蛋白生成障碍性贫血基因异常发生率较高,基因突变类型和构成比具有自己的特点,是α-珠蛋白生成障碍性贫血一个较为特殊的区域。

泰国缺失型α-珠蛋白生成障碍性贫血临床血液学表型分析

目的探讨泰国型α-珠蛋白生成障碍性贫血的血液学表型,了解其在人群中的检出情况。方法采用标准的血液学分析技术测量红细胞参数与血红蛋白组分,利用单管多重Gap-PCR技术检测α-珠蛋白生成障碍性贫血缺失基因,反向点杂交技术诊断α-珠蛋白生成障碍性贫血点突变基因。结果东南亚缺失型组与泰国缺失型组相比,红细胞计数(RBC)、血红蛋白(HB)、红细胞平均体积(MCV)、红细胞平均血红蛋白量(MCH)、HbA2差异无统计学意义(P>0.05)。健康对照组分别与东南亚缺失型组、泰国缺失型组进行两两比较,其各项血液学指标差异均有统计学意义(P<0.01)。结论血液学指数、血红蛋白电泳提示α珠蛋白生成障碍性贫血,而常规基因检测结果正常或是α-珠蛋白生成障碍性贫血纯合子时,建议进行泰国型缺失型或菲律宾缺失型的筛查,以确保珠蛋白生成障碍性贫血诊断的准确性。

滤纸干血片法毛细管电泳Hb Bart′s带筛查新生儿α-珠蛋白生成障碍性贫血的应用价值评价

目的评估滤纸干血片毛细管电泳技术检测Hb Bart′s带在新生儿期筛查α-珠蛋白生成障碍性贫血的临床应用价值。方法对2 987例新生儿足跟血标本应用滤纸干血片毛细管电泳技术检测Hb Bart′s带水平并同时做基因分析,采用四格表法分析Hb Bart′s带对α-珠蛋白生成障碍性贫血的筛查价值。结果共检出Hb Bart′s带阳性标本131例,筛查阳性率为4.39%(131/2 987)。经基因分析,共检出2类6种α-珠蛋白生成障碍性贫血基因共226例。Hb Bart′s带对α-珠蛋白生成障碍性贫血诊断敏感度为50.00%(113/226),假阳性率为0.65%(18/2 761);特异性为99.35%(2 743/2 761);假阴性率(即漏诊率)为50.00%(113/226);其中Bart′s带对H病的筛查敏感度高达100.00%,标准型α-珠蛋白生成障碍性贫血的筛查敏感度为90.99%(101/111),对-α(3.7)/αα、-α(4.2)/αα静止型及非缺失型α-珠蛋白生成障碍性贫血的筛查敏感度较低。结论滤纸干血片毛细管电泳Hb Bart′s带在新生儿期筛查α-珠蛋白生成障碍性贫血有很高的特异性。对H病及标准型α-珠蛋白生成障碍性贫血亦有较高的筛查敏感度,但是对静止型及非缺失型α-珠蛋白生成障碍性贫血的筛查价值有限。

鲤形目五种鱼α-珠蛋白基因cDNA的克隆

从血液中提取总RNA ,根据α珠蛋白氨基酸序列的N末端和C末端碱基序列的保守性设计 2 0个碱基长的简并引物 ,用RT PCR方法扩增并克隆了鲤鱼 (Cyprinuscarpio)、草鱼 (Ctenopharyngodonidellus)、鲫鱼 (Carassiusaura tus)、泥鳅 (Misgurnusanguillicaudatus)和大鳞副泥鳅 (Paramisgurnusdabryanus) 5种我国常见鱼类的α 珠蛋白基因cDNA。序列同源性检索表明 :所克隆的cDNA片段为这 5种鱼各自的α 珠蛋白基因 ,其GenBank注册号分别为AF5 2 815 6、AF5 2 815 7、AF5 2 8197、AF5 2 8198、AF5 2 8199;克隆的 5种鱼的α 珠蛋白基因氨基酸编码序列均为 4 2 9bp。氨基酸序列比较后发现 :泥鳅与大鳞副泥鳅的相似性最高为 94 4 1% ;大鳞副泥鳅与草鱼的相似性最低为 83 92 % ;其余的相似性介于二者之间。另外 ,对已克隆的α 珠蛋白基因用Within group方法进行了聚类分析 ,聚类结果显示 :进化关系较近的物种α 珠蛋白氨基酸序列的相似性与其从形态解剖所得的系统进化关系是一致的 ;进化关系较远的物种α 珠蛋白氨基酸序列的相似性与其生存环境具有较密切的关系。

滤纸干血片毛细管电泳技术在新生儿α-珠蛋白生成障碍性贫血筛查中的应用

目的探讨干血片毛细管电泳技术在新生儿α-珠蛋白生成障碍性贫血(以下简称α-地贫)筛查中的应用价值。方法使用干血片毛细管电泳仪对46 718例新生儿足跟血滤纸干血片标本进行血红蛋白(Hb)电泳分析,检测HbA、HbF、HbA2和异常Hb的水平,对筛查表型阳性的病例召回进行基因分析。结果 46 718例新生儿足跟血滤纸干血片标本中检测出巴特血红蛋白(Hb Bart′s)阳性者2 598例,筛查阳性率5.56%(2 598/46 718);召回544例经基因分析确诊477例α-地贫基因携带者,故Hb Bart′s带筛查与基因确诊的符合率为87.68%(477/544)。进一步分析其临床表型与Hb Bart′s水平的关系可见,随着临床表型的加重,Hb Bart′s水平逐渐增加,且差异有统计学意义(P=0.000)。结论滤纸干血片毛细管电泳分析技术与基因分析有较好的一致性,可根据Hb Bart′s水平的多少初步判断α-地贫的临床分型。

鲈α-珠蛋白基因的克隆和序列分析

从鲈头肾cDNA文库中随机挑取噬菌斑,作为模板,以λZAPExpress载体两端含有的T3和T7启动子序列设计引物,用PCR方法扩增插入片断,从中克隆到血红蛋白α亚基的cDNA(Genebank登录号为EU588586)。该cDNA包含435 bp的开放阅读框,编码144个氨基酸。计算其可能的分子量为15864.51,PI为8.83。序列比较分析结果表明,在近端与血红素结合的组氨酸高度保守,与大菱鲆α类珠蛋白同源性最高,达83.3%,与金鲈和大西洋鳕的同源性分别为72.7%和67.8%,与非洲爪蟾α-珠蛋白同源性最低,为2339.4%。通过构建系统进化树,对鲈α-珠蛋白的系统演化进行了分析,并对其二级和三维结构进行了预测。

藏羚羊α-珠蛋白基因编码区的克隆及同源性分析

目的:克隆藏羚羊α-珠蛋白基因编码区,并进行同源性分析。方法:从藏羚羊肝组织中提取总RNA,通过RT-PCR获得藏羚羊α-珠蛋白cDNA,将其与pGEM(-T Easy载体连接,构成重组质粒,并转化大肠杆菌TOP10扩增培养后,鉴定阳性质粒并进行测序。将测序的结果与NCBI数据库进行同源性比较。结果:获得α-珠蛋白编码区cDNA序列,提交GenBank数据库并取得注册号为DQ650713。与绵羊α-珠蛋白基因相比较,其在16、53、132、134处出现核苷酸密码子突变(GAC→GGC)、(TCG→TCC)、(AGC→GGC)、(AAC→AGC)。推导的氨基酸序列比较发现,132位的天冬酰胺酸(Asn)突变为丝氨酸(Ser),134位的丝氨酸(Ser)突变为甘氨酸(Gly);与人类的α-珠蛋白相比较,有19处的氨基酸发生改变。结论:成功地克隆出藏羚羊α-珠蛋白基因编码区,为高原低氧适应相关基因的研究提供了实验依据。

siRNA对体外培养红系细胞α-珠蛋白基因表达的影响

目的研究针对α-珠蛋白基因的小分子干扰RNA(si RNA)对体外培养红系细胞α-珠蛋白肽链mRNA表达的影响。方法将针对α-珠蛋白肽链设计、化学方法合成的si RNA通过脂质体转染体外培养正常人的红系细胞,在转染后24、48、72 h,用流式细胞术检测转染效率,RT-PCR检测α链mRNA表达水平。结果脂质体转染FCM标记的si RNA进入红系细胞后,24、48、72 h的转染效率分别为61.2%、44.3%、33.7%。si RNA作用于体外培养的红系细胞,经RT-PCR检测,转染后α-珠蛋白基因mRNA相对表达量下降,浓度越高,相对表达量越低。随着作用浓度增加,红系细胞台盼兰拒染率越低;且作用时间越长,台盼兰拒染率也越低。结论脂质体转染si RNA能特异性地抑制体外培养的红系细胞中α-珠蛋白基因表达,可能会成为β-珠蛋白生成障碍性贫血基因治疗的一个新靶点。

SYBR-GreenⅠ实时荧光聚合酶链反应结合融解曲线分析技术在α-珠蛋白生成障碍性贫血基因诊断中的应用

目的探讨SYBR-GreenⅠ实时荧光PCR(SYBR-PCR)结合融解曲线分析(D.C)技术进行α-珠蛋白生成障碍性贫血(α-地贫)基因诊断的价值。方法对22个家系中的37份样品采用4管SYBR-PCR结合D.C进行--SEA、-α3.7,-α4.2及非缺失型(αα)4个等位基因型的检测,进而作出基因诊断。同时运用单管多重PCR(mPCR)结合凝胶电泳技术进行基因检测加以对照确认。结果22个家系中6个家系检出有--SEA或-α3.7携带者,其中东南亚型缺失携带者(--SEA/αα)7例,右侧缺失携带者(-α3.7/αα)3例,东南亚型缺失与右侧缺失双重杂合子(--SEA/-α3.7)1例。2例为胎儿产前诊断。其中1例为Bart′s水肿胎儿(--SEA/--SEA),另1例为东南亚型缺失携带者(--SEA/αα)。用mPCR凝胶电泳技术得出的基因诊断结果与上述结果一致。结论SYBR-PCR结合D.C技术在α-地贫的基因诊断、携带者检出及产前诊断方面具有实用价值。

鸡α-珠蛋白基因5’端MAR调控GFP的表达

目的 :观察不同细胞密度、不同转染时间MAR对GFP表达的影响。方法 :采用脂质体法将pcmv gfp与pgfp mar两个真核表达载体转染人的神经母细胞瘤细胞系 (SH -SY5Y)。结果 :在细胞密度为 3.0× 10 5cells ml,转染后 72hGFP表达量较其它条件下高 ,且在相同条件下 ,pgfp mar比pcmv gfp表达要高。结论 :初步证明该MAR能够提高GFP的表达。

新生儿脐血血红蛋白电泳对α-珠蛋白生成障碍性贫血基因诊断的价值

目的研究脐血血红蛋白电泳在α-珠蛋白生成障碍性贫血及异常血红蛋白病中的诊断价值,了解东莞厚街地区新生儿α-珠蛋白生成障碍性贫血基因携带率、基因类型和异常血红蛋白种类。方法用脐血标本进行血红蛋白电泳,对电泳区带进行扫描定量分析,对检出HbBart's带的标本进行α-珠蛋白生成障碍性贫血基因诊断。结果2369例脐血标本共检出HbBart's带的标本有92例,携带率为3.88%;经基因诊断为α-珠蛋白生成障碍性贫血的有87例,其中--SEA/69例占79.3%,-α3.7/12例占13.8%,-α4.2/6例占6.9%;检出异常血红蛋白病11例占0.46%。2369例标本中母亲为α-珠蛋白生成障碍性贫血基因携带者,新生儿脐血检出HbBart's带的有16例。结论脐血血红蛋白电泳对新生儿α-珠蛋白生成障碍性贫血及异常血红蛋白病的筛查和诊断是一种简便、有效的方法。

α-珠蛋白生成障碍性贫血干预效果分析

目的探讨α-珠蛋白生成障碍性贫血产前诊断在降低出生缺陷中的效果。方法选择2003年1月至2012年7月进行α-珠蛋白生成障碍性贫血产前诊断的妊娠1 037例,采用聚合酶链反应结合琼脂糖凝胶电泳和反向点杂交技术对脐带血和原位培养后的羊水或绒毛组织检测α珠蛋白基因,同时对合并β-珠蛋白生成障碍贫血者进行β-珠蛋白基因检测。结果 1 037例妊娠中α-珠蛋白生成障碍性贫血检出率为79.27%,其中血红蛋白H(Hb Bart′s)胎儿水肿综合征292例,HbH病45例;同时检出中间型、重型β-珠蛋白生成障碍贫血5例,β-珠蛋白生成障碍贫血杂合子28例,包括α复合β-珠蛋白生成障碍贫血26例,终止妊娠339例。结论α-珠蛋白生成障碍性贫血产前干预是防止该类患儿出生的有效措施,同时应加强复合型珠蛋白生成障碍贫血的干预。

血红蛋白定量分析在α-珠蛋白生成障碍性贫血产前诊断中的价值

目的探讨胎儿脐血血红蛋白定量分析在α-珠蛋白生成障碍性贫血产前诊断中的价值。方法对2 211例孕中晚期脐血进行血红蛋白和α-珠蛋白基因分析,ROC曲线分析HbBart′s最佳临界值,评价其在α-珠蛋白生成障碍性贫血产前诊断中的价值。结果 HbBart′s诊断重型、中间型、轻型和静止型α-珠蛋白生成障碍性贫血ROC曲线下面积分别为1、1、0.970和0.913,最佳临界值分别为58.30%、21.05%、7.95%和2.75%,灵敏度分别为100.00%、100.00%、95.78%、83.86%;特异性分别为100.00%、100.00%、98.04%和96.61%。结论以ROC曲线分析得到的HbBart′s最佳临界值对重型α-珠蛋白生成障碍性贫血具有较好的诊断价值,无误诊及漏诊。

标准型α-珠蛋白生成障碍性贫血患儿红细胞参数及网织红细胞的分群分析

目的探讨红细胞参数及网织红细胞三分群参数在标准型α-珠蛋白生成障碍性贫血(α-地贫)患儿中的变化及意义。方法将经基因确诊的56例6～13岁标准型α-地贫患儿设为观察组,80例同一年龄阶段的健康儿童设为对照组,观察分析两组参数的变化。红细胞参数包括红细胞计数(RBC)、血红蛋白测定(Hb)、红细胞平均体积(MCV)、红细胞平均血红蛋白含量(MCH)、红细胞平均血红蛋白浓度(MCHC)、红细胞体积分布宽度(RDW-CV)和Mentzer指数(MCV/RBC);网织红细胞参数包括网织红细胞百分率(RET%)及三分群参数即低荧光强度网织红细胞百分率(LFR%)、中荧光强度网织红细胞百分率(MFR%)和高荧光强度网织红细胞百分率(HFR%),采用统计学方法比较两组间参数的差异。结果标准型α-地贫患儿红细胞参数的主要特征表现为小红细胞增多,Hb减低,MCV、MCH、MCHC均下降,RDW-CV轻度升高,Mentzer指数小于13。网织红细胞三分群表现为LFR%降低,MFR%和HFR%相应升高。除RET%外,观察组的其他各参数值与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.01)。结论红细胞参数及网织红细胞三分群参数对地贫患儿的筛查及其鉴别诊断具有一定的临床应用价值,为进一步进行基因诊断提供了重要的参考依据。

牦牛2个α-珠蛋白基因在染色体上排列顺序的确定

本试验扩增并克隆测定了牦牛2个α-珠蛋白基因间区域的序列.根据所测结果及人、鼠、山羊、马和黄牛的α-珠蛋白基因序列比对中的保守区设计了2对特异性引物,扩增并克隆测定了牦牛α-珠蛋白的上、下游基因序列.将测定的牦牛α-珠蛋白基因间区域序列进行同源性搜索,发现没有任何一个基因与它同源.上、下游基因的测序结果表明,上游基因为牦牛α1-珠蛋白基因,下游基因为α2-珠蛋白基因.这表明牦牛的2个α-珠蛋白基因在染色体上紧密排列,其中α1-珠蛋白基因在前,α2-珠蛋白基因在后.

鸡α-珠蛋白基因5′端MAR调控GFP基因在COS7细胞中表达的研究

目的研究鸡α-珠蛋白基因5′端核基质结合区(matrix association region,MAR)的基因表达调控作用。方法采用PCR方法扩增鸡α-珠蛋白基因5′端1 600 bp长度的MAR,并将该MAR连接在pCMV/GFP载体CMV启动子上游和GFP报告基因下游,构建含2个MAR的真核表达载体pGFP/2MAR。采用Lipofectimine脂质体介导法转染COS7细胞,用荧光显微镜和流式细胞术对荧光表达进行观察、定量。结果荧光显微镜观察pGFP/2MAR在转染48 h后荧光表达量明显高于pCMV/GFP的荧光表达量;流式细胞仪分析表明,在COS7细胞中pCMV/GFP和pGFP/2MAR的荧光表达量分别为17.9%和33.6%。结论该MAR确实能提高GFP在真核细胞中的表达量。

红笛鲷α-珠蛋白和β-珠蛋白基因的克隆及序列分析

应用已知的标签序列通过RACE-PCR和RT-PCR方法成功克隆红笛鲷（Lutjanus sanguineus）α-珠蛋白和β-珠蛋白基因的全长cDNA序列。α-珠蛋白和β-珠蛋白基因的cDNA全长分别为560和563 bp,开放阅读框分别为429和444 bp,各编码143和148个氨基酸,理论相对分子质量分别为15690和16400,理论等电点为7.79和6.61。氨基酸序列BLAST结果表明,红笛鲷α-珠蛋白基因和β-珠蛋白基因编码的氨基酸序列与其他鱼类的相似性分别在59%-79%和55%-80%之间。用邻接法（Neighbor-Joining）构建的α-珠蛋白基因和β-珠蛋白基因的系统发育树表明,红笛鲷与真鲷（Pagrus major）、金头鲷（Sparus aurata）和鰤（Seriola quinqueradiata）等亲缘关系较近。

MLPA技术在α-珠蛋白生成障碍性贫血罕见基因型患者及家系分析中的应用

目的探讨多重连接探针扩增(MLPA)技术在α-珠蛋白生成障碍性贫血(简称地贫)患者罕见基因型及家系分析中的应用价值,为临床检测工作提供帮助。方法采用血细胞分析仪和血红蛋白电泳技术对患者进行地贫表型分析,运用PCR-反向斑点杂交技术进行常规α-珠蛋白基因和β-珠蛋白基因检测,采用MLPA技术对α-珠蛋白基因进行检测,运用Gap-PCR和一代测序的方法对罕见缺失突变进行扩增并测序验证。结果先证者为--^(SEA)缺失复合-α^(27.6)大片段缺失,罕见-α^(27.6)大片段缺失源自患儿父亲。结论家系分析对发现和诊断地贫的罕见基因型尤为重要;MLPA技术是检测罕见缺失型α-珠蛋白基因突变的有效手段。

合并α-珠蛋白生成障碍性贫血对维持性血液透析患者使用促红素疗效的影响

目的:探讨维持性血液透析(MHD)患者合并α-珠蛋白生成障碍性贫血(α-珠贫)对其使用促红素纠正贫血疗效的影响。方法:选择12例合并α-珠贫的MHD患者(α-珠贫组),观察其贫血纠正过程及对促红素的反应,并与无合并α-珠贫的12例MHD患者(对照组)进行比较。结果:α-珠贫组患者开始血液透析时的初始血红蛋白水平明显低于对照组(P<0.01)。12例α-珠贫患者在透析治疗的前3个月每周促红素用量虽由137 IU/kg上升至190 IU/kg,血红蛋白仅上升了22 g/L,在此期间α-珠贫组有7例(58%)患者发生心力衰竭,而对照组仅1例(8%)发生心力衰竭,两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。在随后3个月中,α-珠贫组患者每周促红素用量升至(234±34)IU/kg,血红蛋白升至(114±3)g/L,贫血得以纠正。α-珠贫组在贫血纠正时及维持期每周促红素用量明显高于对照组(P<0.01)。α-珠贫组12例患者透析期间平均红细胞体积、平均红细胞血红蛋白含量均无明显变化(P均>0.05)。结论:合并α-珠贫可能加重MHD患者的贫血程度,且使其对常规剂量促红素治疗反应不足,需大剂量促红素才可纠正其贫血,但这并不能改变其小细胞低色素状态。

跨跃断裂位点PCR检测α-珠蛋白生成障碍性贫血基因缺失及其临床应用

目的评价跨跃断裂位点PCR(GAP-PCR)法检测α-珠蛋白生成障碍性贫血基因缺失(-α3.7,-α4.2,-SEA)的可行性,并进行初步临床应用。方法用GAP-PCR法检测158例临床疑诊为α-珠蛋白生成障碍性贫血病人血标本,用金标准Southern blot法进行盲法平行检测,评价前者方法学性能。结果GAP-PCR法检出α-珠蛋白生成障碍性贫血基因缺失阳性率为42.41%(67/158),其中αα/--SEA为32.91%(52/158),-α3.7/αα为6.96%(11/158),-α4.2/αα为1.90%(3/158),-α3.7/--SEA为0.63%(1/158),与Southern blot法完全一致。GAP-PCR法检测敏感度、特异度和准确度均为100%。结论此法检测结果准确,操作简便,为α-珠蛋白生成障碍性贫血诊断和筛查的有效方法。