C型产气荚膜梭菌β毒素基因克隆与核苷酸序列分析

用ＰＣＲ技术，从含Ｃ型产气荚膜梭菌β毒素基因质粒ｐＢ１２中扩增出了０．９５Ｋｂ的β毒素基因，然后用限制性核酸内切酶ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ对其进行双酶切处理，最后将其定向连接在事先经同样内切酶处理的载体ｐＥＴ－２８ｃ（＋）中的相应位点上，转化至受体菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中。经ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ双酶切分析和核苷酸序列分析，证明重组质粒ｐＸＥＴＢ２含有产气荚膜梭菌β毒素基因，确定了其全部的核苷酸序列。

产气荚膜梭菌β毒素研究进展

产气荚膜梭菌β毒素是引起人和动物食物中毒、气性坏疽和坏死性肠炎的一种致死性毒素。论文主要针对产气荚膜梭菌β毒素的基因和蛋白的分子结构及其致病机理进行介绍,对几种重要分子生物学检测技术的研究进展以及各自的优缺点进行分析,对产气荚膜梭菌的预防和治疗的方法进行了概括,为产气荚膜梭菌β毒素的进一步研究提供参考。

产气荚膜梭菌β毒素单克隆抗体的研制

为了得到产气荚膜梭菌β毒素单克隆抗体,以重组产气荚膜梭菌β毒素为抗原免疫小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合并筛选出阳性单克隆杂交瘤细胞株,接种至小鼠腹腔,培养后抽取腹水并用正辛酸-硫酸铵纯化法进行纯化,从而获得抗产气荚膜梭菌β毒素单克隆抗体。该单克隆抗体经特异性试验,能与天然β毒素及重组β毒素发生特异性反应,且效价较高,为进一步建立快速有效的临床检测技术奠定了基础。

C型产气荚膜梭菌β毒素蛋白结构及抗原表位预测

利用DNASTAR、I-Tasser软件对C型产气荚膜梭菌β毒素的蛋白结构、抗原表位进行预测与分析.综合β毒素蛋白亲水性、表面可能性、抗原指数、二级结构预测结果显示,B细胞抗原表位可能位于肽链2-4、7-16、23-26、36-40、55-58、72-75、172-179、190-193、196-203、211-214、246-249位氨基酸区域;结合三级结构预测结果显示,190-193、211-214成为表位的可能性较大.

野生型产气荚膜梭菌β毒素基因的克隆与分析

用多联PCR方法对从猪舍污水中分离的细菌进行鉴定,获得1株B型和1株C型产气荚膜梭菌,用PCR方法扩增了β毒素基因并进行了测序,获得了包括RBS、信号肽基因和全长成熟肽基因以及部分3’末端序列的β毒素基因;测序后与GenBank中B、c型菌β毒素基园进行比较。野生B、C型菌与二者的同源性分别达到99％以上,氨基酸同源性也在99％以上。

C型产气荚膜梭菌β毒素基因核苷酸序列的测定与分析

为了研究C型产气荚膜梭菌β毒素基因的遗传变异特点,试验采用生物软件设计扩增产气荚膜梭菌β毒素基因的引物,PCR扩增产物纯化后测定核苷酸序列,然后与参考序列进行同源性比对。结果表明:所测菌株与参考菌株核苷酸序列同源性依次为99.5%、99.8%、99.9%,推导的氨基酸序列同源性依次为99.4%、99.4%、99.6%,碱基突变以A-G、C-T之间的转换为主。

B型产气荚膜梭菌β毒素的表达与纯化

将构建好的表达产气荚膜梭菌β毒素的重组质粒pET-32a-β转化大肠杆菌BL21(DE3),将得到的重组菌株BL21(DE3)(pET-32a-β)用IPTG进行诱导表达,探究其最佳诱导时间.对所表达的β毒素包涵体进行变性、纯化和复性,获得了纯度较高的可溶性蛋白,动物免疫实验取得了良好的结果,为下一步抗产气荚膜梭菌β毒素的单克隆抗体和单链抗体的研究奠定基础.

产气荚膜梭菌β毒素抗体间接ELISA检测方法的建立

【目的】建立产气荚膜梭菌β毒素抗体间接ELISA检测方法。【方法】将原核表达重组质粒pET-28a-β转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,用IPTG进行诱导表达,表达产物经镍柱亲和层析纯化、尿素梯度透析复性后进行Western blot鉴定。用复性的β毒素重组蛋白作为包被抗原,通过优化间接ELISA试验条件,建立其抗体间接ELISA检测方法,对该方法的特异性、敏感性和重复性进行考察,并用其对521份临床样本进行检测。【结果】通过诱导、纯化和复性,获得了纯度较高且具有良好反应原性的β毒素重组蛋白。间接ELISA条件为：抗原最佳包被质量浓度为5.0μg/mL,阳/阴性血清最佳稀释度为1∶50,酶标二抗最佳稀释度为1∶2 500,以含50g/L脱脂奶粉的PBST作为封闭液,37℃封闭1h,抗原抗体作用1h,TMB显色30min。间接ELISA的判定标准为OD450≥0.313为阳性,OD450〈0.313为阴性;建立的间接ELISA方法的特异性为96%,敏感性为98%;批内变异系数在3%-4%,批间变异系数在9%以下。利用间接ELISA检测方法对521份临床山羊血清样本的检测结果表明,抗体阳性率为72.5%。【结论】对产气荚膜梭菌β毒素进行了原核表达,成功建立了其抗体间接ELISA检测方法,为产气荚膜梭菌β毒素抗体检测试剂盒的研制奠定了基础。

产气荚膜梭菌α、β毒素研究进展

产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)是一种革兰氏阳性、产生芽胞、严格厌氧及形成特殊荚膜的梭状杆菌。该菌广泛存在于自然界的水源、土壤及人和动物肠道之中。研究发现,该菌至少可以产生15种以上的毒素,但目前仅有5-6种毒素,即α、β、ε、ι毒素及肠毒素(CPE)、β2毒素等被认为是该菌的主要致病性毒素。根据产气荚膜梭菌产生四种致死性毒素(α、β、ε、ι毒素)的能力,将其分为五种类型,即A、B、C、D、E型。产气荚膜梭菌是一种重要的人畜共患病的病原体,可引起人的食物中毒和多种动物坏死性肠炎、肠毒血症同时也是人畜创伤性气性坏疽以及人类食物中毒的主要病原菌之一。近年来,对产气荚膜梭菌α、β毒素研究取得了重大进展。现就产气荚膜梭菌α、β毒素的组成、结构、分子生物学、检测等方面的研究进展做一综述。

产气荚膜梭菌C58-1株β毒素的克隆与表达

为研究魏氏梭菌β毒素蛋白在机体免疫应答中的作用和特点,参照GenBank:中KP064405.1B型魏氏梭菌β毒素基因,使用Primer5.0软件,设计合成了一对引物,应用PCR方法扩增出长为756bp的β毒素主要抗原区域,将该基因克隆到原核表达质粒pET 32a(+)中,经酶切鉴定、测序分析后,转化大肠杆菌BL21,并对其诱导表达。大肠杆菌表达产物经SDS-PAGE分析,结果表明:该基因片段得到较高表达,融合蛋白约为45KD,主要以包涵体形式存在。

产气荚膜梭菌β毒素蛋白抗原表位预测及CPB-N蛋白免疫原性分析

为获得具有与β毒素蛋白相同免疫原性的新蛋白,本研究对产气荚膜梭菌β毒素蛋白的氨基酸序列进行综合分析,预测其抗原表位并筛选出有效的新蛋白。采用生物信息学方法综合分析β毒素蛋白二级结构、亲水性、可塑性、抗原性、跨膜区域以及信号肽,同时参考ElliPro服务器在线预测。最终预测aa108～aa320区段为优势抗原表位,在此基础上建立β毒素蛋白三维结构模型,标记特殊位点并筛选出B型产气荚膜梭菌新蛋白(CPB-N)。诱导表达CPB-N后通过SDS-PAGE和western blot鉴定,结果显示在约24 ku处有明显条带。采用间接ELISA方法对免疫小鼠的血清和肠道灌洗液样品进行检测,结果表明CPB-N与β毒素蛋白的免疫原性基本相同。CPB-N蛋白的筛选及预防产气荚膜梭菌引起的疾病奠定了重要的研究基础。

魏氏梭菌β毒素的提纯

利用硫酸铵盐析、Sephadex凝胶过滤和DEAE离子交换层析等纯化方法,首次在国内获得免疫纯β毒素。β毒素是B型和C型魏氏梭菌所产生的主要致死性和坏死性毒素,在动物疾病发生中起重要作用。该两型魏氏梭菌还产生α毒素(卵磷脂酶)、θ毒素(氧敏感溶血素)、δ毒素(溶血素)κ、毒素(胶元酶)和λ毒索(蛋白分解酶)等。为了研究毒素生物学活性,制备单因子血清,首先必须分离出纯毒素,Akama、Worthington和Sakiurai均用大体相同的盐析、凝胶过滤,离子交换层析或亲和层析等方法提纯β毒素,但都未能使之彻底纯化,且对其物理性质还知之甚少。本实验利用我所现有条件,对用生化分离和免疫学技术纯化β毒素的方法及其部分特性加以研究,以期获得免疫学单一的毒素制品。

产气荚膜梭菌β毒素和ε毒素以及腐败梭菌α毒素三联基因工程灭活疫苗的制备与免疫效力评价

为了获得高表达量的重组C型产气荚膜梭菌β毒素,鉴定其致死性和反应原性,并评价其与D型产气荚膜梭菌ε毒素和腐败梭菌α毒素共表达产物联合制成三联基因工程灭活疫苗的免疫保护效力。设计含不同酶切位点的2对引物,PCR扩增C型产气荚膜梭菌β毒素基因cpb1和cpb2,将二者克隆至pRSFDuet-1质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),自诱导培养基诱导2段基因共表达。用SDS-PAGE和Western-blot以及小鼠毒性试验、抗毒素血清和中和试验对表达产物进行鉴定。将诱导收获的大肠杆菌以及D型产气荚膜梭菌ε毒素和腐败梭菌α毒素的共表达产物1∶2配比灭活制成三联灭活铝佐剂疫苗,以每只1mL剂量皮下免疫家兔2次后,测定血清中和抗体效价,用1MLD的C、D型产气荚膜梭菌毒素和腐败梭菌毒素分别攻击。结果显示,所构建的重组大肠杆菌BL21(pRSFDuet-cpb1-cpb2)能够表达重组β毒素,产物能够与C型产气荚膜梭菌抗毒素血清反应,且具有小鼠致死毒性,抗毒素血清可以将其毒性中和;制成联合疫苗免疫家兔,免疫血清对C型产气荚膜梭菌毒素的中和抗体效价为8MLD/0.1mL,对D型产气荚膜梭菌毒素的中和抗体效价为45MLD/0.1mL,对腐败梭菌毒素的中和抗体效价为1.5MLD/0.1mL;用3种毒素攻击免疫组家兔均全部保护,对照组全部死亡,达到《中华人民共和国兽药典三部(2015版)》效力检验标准。本研究为羊猝狙、肠毒血症和快疫三联疫苗的研制提供了试验基础。

产气荚膜梭菌β毒素的表达及其抗血清的制备

PCR扩增B型产气荚膜梭菌C58-2株β毒素完整成熟肽序列,将942 bp的基因片段以正确的阅读框架定向克隆于p ET-32a(+)中,然后将重组质粒转化进宿主菌BL21(DE3)中,在37℃1 mmol/L IPTG诱导下该片段获得良好表达。经SDS-PAGE分析,其表达的蛋白约为54.6 ku,与预期值一致。Western blot显示,该重组蛋白可被C型产气荚膜梭菌血清识别,表明该重组蛋白具备与天然毒素相类似的反应原性。重组β毒素蛋白在菌液上清、超声波裂解上清和包涵体中均有分布,且以包涵体为主,表明重组蛋白可同时以胞外、周质和胞浆的形式表达。小鼠试验表明,重组β毒素蛋白不具有毒性。毒素-抗毒素中和试验表明,该抗血清具有β毒素特异性。以重组β毒素蛋白作为抗原免疫家兔,每0.1 m L的一免、二免、三免后抗血清分别可以中和10、20、50个小鼠MLD的C型毒素。结果表明,试验所获得的重组菌株有望成为产气荚膜梭菌β类毒素生产的候选菌株,所制备的抗血清有望进一步研制成为抗β毒素国家标准品。

产气荚膜梭菌主要外毒素最新研究进展

产气荚膜梭菌是一种重要的人兽共患病的病原体,可引起人的食物中毒和抗生素相关腹泻。近年来,对产气荚膜梭菌的主要外毒素研究取得了重大进展。本文综述了产气荚膜梭菌主要外毒素的组成、结构、理化性质、作用机理、检测及分子遗传学等方面的研究进展。

B型产气荚膜梭菌三种主要毒素基因的PCR检测

为了对B型产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens type B)进行快速检测,依据NCBI登录的产气荚膜梭菌α、β及ε毒素基因序列设计引物,并对其进行PCR扩增。琼脂糖凝胶电泳结果显示3个毒素基因均被成功扩增,目标片段条带清晰,长度与预期相符。

鸡坏死性肠炎解决方案

鸡坏死性肠炎的病原为A型或C型产气荚膜梭菌,为革兰阳性、产芽胞的厌氧菌,可产生不同的毒素,与疾病的病变和临床症状有关。A型和C型产气荚膜梭菌产生的a毒素、C型产气荚膜梭菌产生的β毒素均与坏死性肠炎的肠黏膜坏死有关。因此鸡坏死性肠炎不仅是侵袭性腹泻,而且是肠毒素性腹泻。针对肠毒素性腹泻,处方时应清热解毒、清热燥湿和适当的苦寒攻下,协助机体清除体内毒素。

OEPR法构建含不同破伤风毒素T细胞表位的CPB表达质粒及其产物的初步鉴定

为了提高产气荚膜梭菌β毒素(CPB)亚单位疫苗的免疫效果,试验将不同破伤风毒素辅助性T细胞表位引入该蛋白前,用OEPR(Overlap Extension PCR and Recombination)法构建了8个重组表达质粒(即p Cold-CPB、p Cold-P2-CPB、p Cold-P21-P30-P2-CPB、p Cold-P32-P23-P21-P30-P2-CPB和p ET22b-CPB、p ET22b-P2-CPB、p ET22b-P21-P30-P2-CPB、p ET22bP32-P23-P21-P30-P2-CPB)。将阳性重组质粒转入到大肠杆菌中,以自诱导培养基表达目的蛋白。SDS-PAGE分析结果表明,8个重组菌均成功表达出目的蛋白,且大小均与预期一致。Western Blotting检测结果表明,重组蛋白均可被C型产气荚膜梭菌阳性血清识别。毒性试验结果表明,重组蛋白均可致死小鼠。本研究首次用OEPR法成功构建了8个含不同破伤风毒素T细胞表位的产气荚膜梭菌β毒素表达质粒,并成功表达了目的蛋白,为探索破伤风毒素辅助性T细胞表位对产气荚膜梭菌β毒素免疫效果的影响及进一步开发亚单位疫苗奠定了基础。

牦牛源C型产气荚膜梭菌动物致病性及其β毒素基因生物信息分析

复苏培养本实验室保存的牦牛源C型产气荚膜梭菌Qinghai-06(GenBank登录号:MW980095),利用振荡比浊法、动物试验和病理切片方法对菌株生长曲线及动物致病性进行研究,随后通过对β毒素基因扩增、克隆、双向高通量测序、生物软件分析等分子生物学与生物信息学方法对其编码蛋白的一级结构、二级结构、三级结构、蛋白特殊区域及B细胞线性抗原表位进行分析。结果显示,牦牛源C型产气荚膜梭菌Qinghai-06菌株按照5%体积分数接种后,2~6h为对数期;菌液D_(600 nm)值与稀释倍数的关系式为y=-0.857ln(x)+2.236;菌液D_(600 nm)值与菌落CFU的关系式为:y=0.881x-0.017;菌株对感染小鼠的LD_(50)为0.408×10^(8)CFU/m L。H.E染色镜检观察到可引起肠、脑、肾脏、肝脏、脾脏组织病理变化。β毒素基因序列长927bp,共编码309个氨基酸,分子式为C_(1535)H_(2396)N_(406)O_(502)S_(9),相对分子质量为34.9ku,p I=5.52,不稳定指数为35.91,亲水性总平均值为-0.567,含有全部20种氨基酸,为单体,含1个Zn^(2+)配体。结果表明:牦牛源C型产气荚膜梭菌Qinghai-06属强致病菌株,其β毒素蛋白为含丰富无规则卷曲结构和潜在磷酸化位点的、稳定的亲水性蛋白,有效B细胞线性抗原表位主要集中于140~290区段。