非标记液晶生物传感器检测人类β防御素-2

基于液晶取向变化构建液晶生物传感器用以检测人类β防御素-2(HBD-2)。传感器基底经过3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)与N,N-二甲基十八烷基(3-(三甲氧基硅丙基))氯化铵(DMOAP)混合溶液组装氨基化膜,再利用戊二醛(GA)对组装膜进行醛基化修饰用以固定HBD-2抗体。当基底表面固定的HBD-2抗体与一定浓度范围内的HBD-2特异性结合后,改变了传感器基底形貌,扰乱了液晶分子的有序排列,从而引起光学信号的改变,可用于检测HBD-2。当HBD-2的含量高于5.0ng/mL时,可观测到明显的光学图像变化。本方法易操作,无需标记,灵敏度较高,特异性好,响应速度快。

梓醇、左旋紫草素、丹皮酚调控角质形成细胞表达人β防御素-2的机理

目的探讨梓醇、左旋紫草素、丹皮酚通过影响JNK信号通路发挥调控HBD-2的作用。方法用IL-1β和TNF-α各100ng/m L的混合物刺激Ha Ca T细胞18h建立HBD-2高表达及JNK信号通路活化的细胞学体外模型,配制含合适浓度的梓醇、左旋紫草素、丹皮酚培养基干预细胞模型,并设阴性及阳性对照。用实时荧光定量PCR法检测各组中HBD-2 m RNA的表达;用ELISA法检测培养上清中HBD-2蛋白的表达;用Western blot法检测各组中JNK蛋白的表达。结果左旋紫草素、丹皮酚和JNK抑制剂(阳性对照药物)可以明显下调细胞学体外模型中HBD-2基因及蛋白的表达(P<0.05),左旋紫草素与JNK抑制剂相当(P>0.05),丹皮酚弱于JNK抑制剂(P<0.05)。梓醇则明显上调细胞学体外模型中HBD-2基因及蛋白的表达(P<0.05)。左旋紫草素、丹皮酚和JNK抑制剂可以明显下调P-JNK2蛋白的相对含量,梓醇对P-JNK2蛋白无抑制作用,反而上调其表达。结论紫草、丹皮可能通过抑制JNK2MAPK信号通路的活化,下调HBD-2的表达,从而发挥其治疗银屑病的作用。地黄治疗银屑病的机制尚需从其他方面继续探讨。

丹参酮对寻常性痤疮皮损组织β防御素-2 mRNA表达的影响

目的探讨寻常性痤疮皮损中人β防御素-2(HBD-2)mRNA的表达情况及丹参酮对其的影响。方法选择40例寻常性痤疮患者于口服丹参酮治疗前、后分别评价疗效及不良反应,同时取背部皮损,用逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)检测HBD-2 mRNA的表达情况,并与20名健康人进行比较。结果治疗组治疗前、后皮损及正常对照组均可检测到HBD-2 mRNA的表达,患者皮损部位表达明显高于非皮损部位和对照组,差异有显著性意义(P<0.01),治疗后患者皮损中HBD-2 mRNA表达比治疗前显著下降(P<0.01),但明显高于非皮损部位和正常对照组(P<0.01)。治疗后患者非皮损部位HBD-2 mRNA表达较治疗前升高(P<0.05)。结论丹参酮有抗炎、杀菌的功能,还可保持患者皮损局部HBD-2 mRNA的较高浓度表达,增强对寻常性痤疮患者的抗炎作用。

脂多糖及前炎症细胞因子诱导人原代气道上皮细胞β防御素-2表达的实验研究

目的观察脂多糖(LPS)及前炎症细胞因子白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导人原代气道上皮细胞人β防御素-2(hBD-2)的表达,探讨呼吸道先天性病原体防御机制。方法LPSI、L-1β及TNF-α刺激培养人原代气道上皮细胞后,RT-PCR法检测hBD-2 mRNA的表达,Western blot和免疫组化法检测hBD-2 mRNA蛋白的表达。结果正常人原代上皮细胞有微量hBD-2 mRNA表达,不同质量浓度的LPSI、L-1β及TNF-α刺激细胞后,hBD-2 mRNA表达呈剂量依赖性增加,与对照组差异显著。0.1μg/mL的LPS、1 ng/mL的IL-1β和10 ng/mL的TNF-α刺激上皮细胞4 h后,细胞均可见hBD-2蛋白表达。结论一定剂量的LPS及前炎症细胞因子可诱导人气道上皮细胞hBD-2表达,且诱导hBD-2表达时间较短,hBD-2的表达可能是气道最初的防御反应。

寻常性银屑病患者皮损中抗菌肽LL-37和人β防御素-2mRNA的表达

目的:探讨寻常性银屑病患者皮损中抗菌肽LL-37与人β防御素-2(hBD-2)mRNA的表达。方法:应用逆转录(RT)-PCR方法检测31例寻常性银屑病患者皮损和16例正常人皮肤组织中LL-37和hBD-2mRNA的表达。结果:与正常人皮肤组织相比,寻常性银屑病患者皮损中LL-37和hBD-2mRNA的表达水平明显升高(P<0.001)。结论:寻常性银屑病患者皮损中LL-37和hBD-2mRNA表达水平的上调可能与银屑病患者很少发生皮肤感染等有关。

CpG ODN通过活化p38 MAPK上调A549细胞β防御素-2的表达

目的研究含CpG基序的寡核苷酸(unmethylated CpG motif containing oligodeoxynucleotide,CpG ODN)对人肺腺上皮细胞A549β防御素-2(humanβ-defensin 2,hBD-2)的表达及p38 MAPK磷酸化水平的影响。方法培养A549细胞,加或不加p38特异性抑制剂SB203580情况下用不同浓度CpG ODN进行干预。用RT-PCR法检测刺激后A549细胞hBD-2 mRNA表达变化,用Western Blot法检测细胞内p38MAPK蛋白磷酸化水平的变化。结果 CpG ODN刺激可以促进A549细胞内磷酸化p38 MAPK含量的增加,活化p38 MAPK途径,从而诱导hBD-2的表达,与对照组比较,P<0.05;用特异性阻断剂SB203580阻断p38 MAPK磷酸化可抑制CpG ODN的诱导作用。结论 CpG ODN通过p38 MAPK途径诱导hBD-2在呼吸道上皮细胞的表达,增强呼吸道对外界微生物的抵抗作用。

人β防御素-2基因的合成及其真核表达载体的构建

目的 合成人 β防御素 2 (Humanβ defensin 2 ,hBD 2 )基因并构建其真核表达载体 ,为hBD 2基因的转染和表达奠定基础。方法 根据GenBank中的hBD 2结构基因序列 ,设计合成了 3条长度为 82bp的长寡聚核苷酸引物 (H1、H2、H3 ) ,用PCR延伸扩增的方法进行全长为 2 11bp的基因合成 ;PCR产物经双酶切后 ,克隆入真核表达载体pLXSN并导入细菌扩增。结果 PCR产物和重组载体经凝胶电泳及测序分析 ,证实合成的基因与原序列一致 ,并成功克隆到真核表达载体pLXSN上。结论 用PCR延伸扩增法合成基因 ,能方便快捷地获得目的基因片段 ,提高了基因合成的准确性 。

人β防御素-2稳定表达细胞株的建立及其表达产物对耐药大肠埃希菌抗菌活性研究

目的建立稳定表达人β防御素2(hBD2)的COS-7细胞株,并检测其表达产物对耐药大肠埃希菌的抗菌活性。方法将重组hBD2真核表达载体pCMV-hBD2通过脂质体转染COS-7细胞,筛选稳定表达hBD2单克隆细胞株;经RT-PCR和Western blot检测稳定转染后目的基因在转录水平和蛋白水平的表达;用微量稀释法检测稳定转染后细胞培养上清液对耐药大肠埃希菌的抗菌作用。结果筛选出稳定表达hBD2的COS-7细胞株,检测到目的基因在转录水平和蛋白水平均有表达,且其表达产物使耐药大肠埃希菌存活率降至15%。结论建立了稳定表达hBD2的COS-7细胞株,其表达产物对耐药大肠埃希菌具有一定的抗菌活性。

黄白液对复发性生殖器疱疹患者皮损中人β防御素-2mRNA表达的影响

目的探讨复发性生殖器疱疹(recurrent genital herpes,RGH)患者皮损中人β防御素-2(humanβ-defensin-2,HBD-2)的表达情况及黄白液对其影响。方法27例RGH患者随机分为黄白液组14例,泛昔洛韦组13例,于治疗前后检测HBD-2的表达情况,并与10名健康人进行比较。结果健康人和RGH患者皮损均可检测到HBD-2的表达,治疗后患者HBD-2表达,黄白液组高于泛昔洛韦组。结论黄白液适用于RGH治疗,可保持患者局部HBD-2的较高浓度表达,以改善患者的免疫功能。

猪β防御素-2基因在HEK293T细胞中的表达

用Trizol试剂提取猪血白细胞总RNA,根据已发表的序列设计引物,采用RT-PCR方法扩增出猪β防御素-2(pBD-2)基因,并将该基因插入到真核表达载体pcDNA3.1A中,构建成猪β防御素-2基因的真核表达载体pcDNA3.1A/pBD-2,经磷酸钙介导转染HEK293T细胞进行表达。结果表明:本试验扩增的pBD-2基因与已发表的序列完全一致。表达产物经Western-blot检测,证明pBD-2能够在真核细胞HEK293T中表达。

外源性人β防御素-2调节子宫内膜异位症细胞增殖/凋亡及炎性因子的表达

【目的】探讨体外条件下加入外源性人β防御素-2蛋白对子宫内膜异位症(EMs)细胞增殖/凋亡和炎性因子表达的影响。【方法】组织块消化法原代培养EMs细胞,Western Blot法检测EMs细胞hβD-2蛋白、TNF-α及IL-1β的蛋白表达;Western Blot法检测加入重组人hβD-2蛋白(40μg/mL)前后EMs细胞内TNF-α,IL-1β蛋白表达变化;按不同梯度浓度(80、40、20、10μg/mL)加入人β防御素-2蛋白(hβD-2)后,ELISA法检测EMs细胞培养液上清中TNF-α,IL-1β细胞因子的浓度;加入高剂量hβD-2蛋白(120μg/mL)并培养EMs细胞24H设为实验组,对照组为完全培养基培养的EMs细胞,MTT法检测实验组及对照组EMs细胞增殖情况;PI法检测实验组及对照组EMs细胞凋亡情况。【结果】原代培养的EMs细胞可表达hβD-2蛋白、TNF-α、IL-1β蛋白;加入外源性重组人hβD-2蛋白后,EMs细胞表达TNF-α、IL-1β蛋白下调;EMs细胞培养液上清中可检测出TNF-α,IL-1β的表达;在加入hβD-2后,EMs细胞培养液上清内TNF-α、IL-1β表达下降,且随着加入hβD-2浓度增高其下降趋势增大,差异有统计学意义(80>40>20>10μg/mL,P<0.05);在EMs细胞培养基中加入高浓度外源性人β防御素2蛋白孵育后(120μg/mL),与对照组相比,EMs细胞的增殖受到明显抑制,且凋亡明显增加(P<0.05)。【结论】hβD-2可以影响子宫内膜异位症细胞内炎症因子TNF-α,IL-1β的表达,并可抑制EMs细胞的增殖,促进其凋亡。为治疗EMs提供新的理论依据。

寻常痤疮皮肤人β防御素-2的表达及意义

目的:研究寻常痤疮患者皮肤β防御素-2(hBD-2)的表达情况及丹参酮治疗对其的影响。方法:用免疫组化方法检测40例寻常痤疮患者皮损及非皮损部位hBD-2的表达水平,观察其在丹参酮治疗前、后的变化,同时记录皮损情况及不良反应等,并与正常对照组进行比较。结果:丹参酮治疗寻常痤疮效果良好,副作用少。在寻常痤疮患者皮损处hBD-2的表达显著增强,与非皮损部位及正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);丹参酮治疗后皮损好转,局部hBD-2表达减弱,但仍明显高于非皮损部位(P<0.05);治疗前、后非皮损部位hBD-2的表达水平没有明显变化,与正常对照组比较差异亦无统计学意义(P>0.05)。结论:hBD-2在寻常痤疮皮损部位的表达显著增加,并随着炎症的减轻而下调,提示其参与痤疮的发病过程。

TNF-α、IL-1β诱导人角质形成细胞β防御素-2的表达

目的观察TNF-α、IL-1β诱导人角质形成细胞(Hacat细胞)表达β防御素-2(hBD-2)的情况,阐明不同诱导因素在不同时间点诱导hBD-2的规律及差异性。方法将培养的Hacat细胞分为四组:对照组、TNF-α组、IL-1β组、TNF-α+IL-1β组。对照组不加任何药物干预,其余各组分别于6h,18h,24h加入药物后用RT-RCR方法检测hBD-2mRNA的表达。结果TNF-α和IL-1β干预组Hacat细胞hBD-2mRNA表达均高于对照组(P<0.05),各组干预18h的表达量均明显高于干预6h,24h时的表达量。TNF-α与IL-1β联合干预Hacat细胞时有协同作用,18h时hBD-2mRNA表达量最高。结论TNF-α、IL-1β二者联合时有协同作用,Hacat细胞产生hBD-2mRNA的表达量随时间变化而变化。

人β防御素-2基因在SPC细胞中的转染表达

目的合成人β防御素-2(hum anβ-defensin-2,hBD-2)基因并构建其真核表达载体,转染SPC细胞,检测其表达,明确hBD-2重组载体的表达活性,为hBD-2基因转染和表达的研究奠定基础。方法根据Genebank中的hBD-2结构基因序列设计合成三条引物,用PCR延伸扩增的方法合成hBD-2基因,克隆入真核表达载体pLXSN;通过脂质体转染法将pLXSN-hBD-2导入SPC细胞,采用W estern-b lot法检测hBD-2的表达。结果经凝胶电泳及测序分析,证实合成的基因与原序列一致,并成功克隆到真核表达载体pLXSN上,所构建的真核表达重组载体pLX-SN-hBD-2转染SPC细胞后呈现有效表达。结论成功构建了PCR合成的hBD-2基因真核表达重组载体pLXSN-hBD-2,通过基因转染的方法导入SPC细胞并获得表达hBD-2,为进一步的动物转基因抗感染实验研究提供了依据。

香烟烟雾提取物对A549细胞β防御素-2表达的影响

目的研究香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract,CSE)对人肺腺上皮细胞A549β防御素-2(humanβ-defensin2,hBD-2)表达的影响。方法培养A549细胞,加或不加LPS(10μg/ml)情况下用5%CSE进行干预。用RT-PCR法和Western Blot法分别检测hBD-2mRNA和蛋白表达变化。结果LPS可以诱导A549细胞hBD-2的表达;5%CSE不影响A549细胞hBD-2的表达,但可抑制LPS的诱导作用。结论CSE可以抑制LPS诱导的肺腺上皮细胞hBD-2表达,这可能与CSE减弱呼吸道抵御外界微生物入侵能力,导致呼吸道感染及慢性阻塞性肺疾病有关。

人β防御素-2基因在解脲支原体感染女性生殖道组织中的表达

目的:检测人β防御素-2基因(hBD-2)在正常及解脲支原体感染的女性生殖道的表达情况及与炎症程度的关系。方法:采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测正常及解脲支原体感染的女性宫颈、子宫内膜中hBD-2基因的表达情况,用β-actin作内参照。结果:在正常及解脲支原体感染女性宫颈、子宫内膜中hBD-2基因均有表达,且支原体感染的女性hBD-2基因表达比正常女性明显增强,二者差异有统计学意义(P<0.01)。结论:hBD-2在正常及解脲支原体感染的女性生殖道中有广泛表达,且后者比前者明显,提示hBD-2在正常女性生殖道特别是在解脲支原体感染中起着重要的防御作用。

结肠癌组织中β防御素-2的表达与树突状细胞浸润的相关性研究

目的探讨β防御素-2(HBD-2)在结肠癌组织中的表达与树突状细胞(DCs)浸润的相关性。方法 30例结肠腺癌以及结肠腺瘤患者作为研究组,30例正常健康者作为对照组。运用免疫组化法检测HBD-2和S100蛋白在两组人员结肠黏膜组织中的表达情况,计算阳性率,分析HBD-2与DCs浸润的相关性。结果研究组患者结肠黏膜组织中HBD-2和S100蛋白表达的阳性率分别为73.33%和80.00%,其中结肠腺癌患者中HBD-2和S100蛋白表达的阳性率分别为78.26%和82.61%,结肠腺瘤患者分别为57.14%和71.43%;对照组结肠黏膜组织中HBD-2和S100蛋白表达的阳性率分别为23.33%和16.67%,观察组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);HBD-2表达与DCs浸润呈显著的正相关(r=0.742,P<0.05)。结论 HBD-2和S100蛋白在结肠腺癌和结肠腺瘤组织中的表达水平显著高于正常结肠组织;HBD-2表达与DCs浸润有呈著的正相关。

人类β防御素-2在舍格伦综合征患者中的表达及其意义

目的研究人类β防御素(hBD)-2及其mRNA在舍格伦综合征(SS)患者涎腺组织中的表达情况,探讨hBD-2在SS临床以及病理过程中的作用。方法采用免疫组织化学染色SP法及原位杂交(ISH)技术检测30例SS患者涎腺组织和10例正常涎腺组织中hBD-2的表达情况,并统计分析了其表达、临床病理特征之间的关系。结果 SP法和ISH的结果均提示,SS患者较正常的涎腺组织中hBD-2的表达水平增高(P<0.05);伴有全身结缔组织疾病的SS患者较未伴有的hBD-2阳性表达率升高;病理分级4级的SS患者较3级SS患者的hBD-2阳性表达率高(P<0.05)。结论 hBD-2可能参与了SS的特异性免疫病理过程,为利用唾液进行早期诊断涎腺疾病的易感性或风险因子提供了新的思路。

玉屏风散对小鼠β防御素-2基因表达的影响

研究玉屏风散益气固表、提高机体对环境病因抵抗力的机理。实验组6只小鼠以玉屏风散水煎液灌胃10 d,对照组6只小鼠给予同体积生理盐水,处死动物后提取肺组织总RNA,通过实时荧光定量PCR测定小鼠在灌服玉屏风散水煎液后β防御素-2基因表达水平。结果实验组小鼠β防御素-2基因的相对表达量是对照组的9.327倍。表明玉屏风散增强机体抵抗力与其可上调β防御素-2基因的表达从而提高机体非特异性免疫力有关。