猪β-干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其活性

为了高效表达分泌型的猪β-干扰素,将去除信号肽的编码梅山猪β-干扰素成熟多肽基因（mPoIFNβ）插入酵母-大肠杆菌穿梭载体pPIC9K,构建成分泌型重组表达载体pPIC9K-mPoIFNβ。将以SalⅠ线性化的pPIC9K-mPoIFNβ用化学方法（LiCl）,与鲑鱼精DNA（ssDNA）共转化入毕赤酵母菌株GS115,转化子经MD平板筛选和PCR鉴定后获得阳性菌株,再经高浓度G418筛选到多拷贝菌株。以1%甲醇连续诱导4 d,SDS-PAGE和Western blot检测结果表明：表达产物为22 ku和26 ku的混合物,在GS115中的表达量约为80 mg/L,占分泌型总蛋白的29.4%-30.8%,表明猪β-干扰素基因在毕赤酵母中获得了高效分泌表达。对表达产物进行理化分析发现,重组酵母菌表达的蛋白耐酸（pH2）,对热（56℃）部分敏感,并能被特异性的抗猪β-干扰素抗体中和而不与抗猪γ-干扰素抗体反应。以细胞病变抑制法（CPE50）测定干扰素抗病毒活性,在MDBK（牛肾细胞系）中表达的猪β-干扰素的抗VSV比活性达到2.0×10^6U/mg;对口蹄疫病毒在IBRS-2细胞中的增殖也有明显的抑制作用。

重组人β-干扰素在体内外对肿瘤生长的抑制作用

目的 :观察点突变重组人 β 干扰素 (IFN β)对人肿瘤细胞体内外生长的抑制作用 ,为其临床应用提供实验资料。 方法 :分别将人结肠癌LoVo、肺腺癌A5 49细胞置于含 2 0 0IU/ml,10 0 0IU/ml及 5 0 0 0IU/mlIFN β培养基中培养 2 4h后 ,于 0 .3%琼脂糖培养基中培养 10～ 14d ,观察软琼脂中集落形成情况。将裸鼠皮下接种LoVo ,A5 49细胞 ,72h后分组 ,每次注射 2 0万IU/kg或 10 0万IU/kg ,5 0 0万IU/kgIFN β ,每天 1次 ,连续 10d ,同时设置生理盐水对照组、标准品组和注射用环磷酰胺治疗组。荷瘤后第 14天处死小鼠 ,称取瘤重。以上实验均重复 3批。结果 :在体外 ,经重组人新型 β 干扰素处理的LoVo细胞及A5 49细胞的集落数均明显低于未经处理的细胞 (0 .0 5 >P >0 .0 1) ,与标准品组无明显差异 (P >0 .0 5 )。荷瘤裸鼠经治疗后 ,瘤重随着重组人 β 干扰素剂量的升高而降低 ,即重组人β 干扰素可呈剂量依赖性地抑制LoVo ,A5 49细胞在体内的生长 ,在疗效方面与标准品间无显著差异 (P >0 .0 5 )。结论 :重组人 β

用构建的新型BmNPV载体在家蚕高效表达人β-干扰素

构建了家蚕核多角体病毒新型载体ｐＢｍ９２，该载体将多角体蛋白基因的起始密码ＡＴＧ改变为ＡＴＴ，然后在多角体蛋白基因的＋１２位后连接有５个外源基因的克隆位点。将ＨｕＩＦＮ－β基因克隆在多角体蛋白基因的＋１２位后，构建了ｐＢｍＩＦＮ＋１２；同时构建了Ｈｕ ＩＦＮ－β克隆在－３位后的转移载体ｐＢ－ｍＩＦＮ－３。

β-干扰素治疗尖锐湿疣疗效观察

目的 评价β干扰素治疗尖锐湿疣的疗效、安全性及复发率。方法 采用随机对照的方法，治疗组采用β干扰素肌肉注射，同时β干扰素霜外用；对照组采用安慰剂生理盐水肌肉注射，同时β干扰素霜外用。结果 治疗组痊愈率５１ ．２８ ％ ，总有效率为６４ ．１０ ％ ，对照组痊愈率２３ ．３３ ％ ，总有效率３６ ．６７ ％ 。结论 选用β干扰素治疗皮损小而少的尖锐湿疣患者，安全有效。

广西巴马小型猪β-干扰素基因的克隆、序列分析和蛋白结构预测

从刀豆素A刺激12 h和15 h的巴马小型猪外周血淋巴细胞中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增出β-干扰素(IFN-β)基因,将其克隆到PMD18-T载体上,进行序列分析和蛋白结构预测。结果表明,克隆的巴马猪IFN-β基因氨基酸序列与GenBank上登录的梅山猪和长白猪的IFN-β基因氨基酸同源性为98.4%和98.9%,与人、牛、马的IFN-β氨基酸同源性分别为65.1%,65.1%,66.1%。人和猪IFN-β基因在5个螺旋结构序列上同源性很高,而且在维持蛋白结构和生物学活性上的氨基酸位点也非常保守。

猪β-干扰素的原核表达及其对猪流行性腹泻病毒的抑制作用研究

本研究通过PCR技术克隆了猪β干扰素全基因,设计引物亚克隆猪β干扰素成熟蛋白编码基因并对,5’端1个稀有密码子进行了大肠杆菌偏嗜性改造。构建了猪IFN-β原核单纯表达载体pRLC-poIFNβ,实现了poIFN-β在大肠杆菌中的表达,表达产物约占菌体总蛋白的17.3%。表达产物以包涵体形式存在,用含6mol/L盐酸胍的变性液溶解及含GSH-GSSG复性液复性处理,复性后的表达产物经凝胶层析纯化后,MDBK细胞-VSV病变抑制法测定结果表明,重组猪β干扰素具有良好的抗病毒活性,约为5.6x105U/mg。用重组猪β干扰素处理猪肾传代细胞PK-15后,细胞病变抑制法(CPE50)测定结果表明:重组猪β干扰素可显著抑制猪流行性腹泻病毒(PEDV)的感染。

牦牛β-干扰素基因的克隆与表达

提取经植物血凝素(PHA)诱导培养的牦牛外周血淋巴细胞总RNA,采用RT-PCR技术扩增并克隆了牦牛IFN-β基因,经PCR和酶切鉴定及测序分析,再克隆到pGEX-4T-1质粒载体中,构建了原核表达重组载体,经IPTG诱导表达重组蛋白,可表达约41 ku的牦牛IFN-β融合蛋白,主要以包涵体形式存在。序列分析结果表明,牦牛IFN-β基因ORF为498 bp,与乳牛IFN-β参考序列的同源性高达98.6%,与猪、马、猫、人IFN-β基因的同源性分别为72.5%、68.9%、66.1%和63.5%,而与狗、鼠、鸡等动物的同源性均不超过25%;分子遗传进化树分析也表明,牦牛与乳牛IFN-β基因的亲缘关系最近,而与鼠、狗、鸡等的亲缘关系较远,说明IFN-β基因有种属差异性。

猪β-干扰素的基因改造表达及其抗猪繁殖与呼吸综合征病毒活性测定

本研究根据GenBank上登录的猪β-干扰素基因成熟肽核苷酸序列(mPoIFNβ),在保持原猪β-干扰素蛋白序列不变的基础上,对猪β-干扰素基因进行了毕赤酵母偏嗜性改造,并构建了毕赤酵母重组表达质粒pPICZαC-PoIFNβ。pPICZαC-PoIFNβ经SacⅠ酶切线性化后,电击转化导入感受态的毕赤酵母菌株X-33中,转化子经YPDS+Zeocin抗性平板筛选和PCR鉴定后获得多株阳性菌株。阳性酵母菌株经甲醇诱导分泌表达了重组PoIFNβ,其表达量约为127.9mg/L。表达产物经SDS-PAGE和Western blotting检测,结果表明,表达产物为分子质量约25和28ku的混合物,并且二者都可与PoIFNβ阳性血清结合。以细胞病变抑制法测定重组β-干扰素在BHK-21细胞上的抗水泡性口炎病毒活性为2.8×103 IU/mL;对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在Marc-145细胞上抗病毒活性达到1.6×103 IU/mL。

奶牛β-干扰素在大肠杆菌中高效表达和生物活性分析

提取经植物血凝素诱导培养的中国健康奶牛外周血淋巴细胞总RNA,应用RT-PCR方法扩增出奶牛β-干扰素成熟蛋白基因并将其克隆到pMD18-T载体上。测序结果表明,扩增片段为奶牛β-干扰素成熟蛋白序列,与GenBank上发表的干扰素序列同源性为100%。将其重组到原核表达载体pET32a(+)上,并在大肠杆菌BL21中实现了高效表达。表达产物以His-Tag融合蛋白的形式存在,表达量约占细菌总蛋白的40%。用镍亲和层析法对蛋白进行纯化,并利用VSV-MDBK/IBRV细胞系统分析其生物活性。重组奶牛β-干扰素抗病毒活性分别约3.16×105U/mL,7.5×104U/mL。结果表明,重组奶牛β-干扰素特异性好,而且抗病毒活性比较稳定。本研究为研制和开发重组奶牛β-干扰素类生物制品研发奠定了基础。

甲基强的松龙联合β-干扰素治疗多发性硬化疗效观察

目的:观察甲基强的松龙联合β-干扰素治疗多发性硬化的临床疗效。方法:选取郑州大学第一附属医院收治的72例多发性硬化患者,随机分为观察组和对照组,各36例。所有患者均采用甲基强的松龙治疗,在此基础上观察组同时给予β-干扰素皮下注射,20 mg/次,3次/周,疗程为3个月。观察并比较两组患者治疗效果及不良反应发生情况。结果:观察组治疗总有效率为91.6%,对照组总有效率为75.1%,差异具有统计学意义(P<0.05)。两组不良反应发生率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:甲基强的松龙联合β-干扰素治疗多发性硬化效果显著,可促进神经功能恢复,降低残障程度,安全性高,值得在临床中推广应用。

用于转导猪β-干扰素基因的高滴度逆转录病毒的制备

通过 DNA重组技术 ,将卵清蛋白 5′调控序列和猪 β-干扰素基因重组到逆转录病毒载体 p L NHX中。通过瞬时转染法 ,将构建好的逆转录病毒重组载体和表达 VSV- G膜蛋白的表达载体 p VSV共转染 GP2 2 93包装细胞。病毒滴度测定表明 ,利用瞬时转染法可以产生高滴度的逆转录病毒 ,最高滴度可达 10 7CFU/ m L。

聚乙二醇修饰β-干扰素的研究

采用平均分子量为 5kD的已活化的单甲氧基聚乙二醇 (mPEG)对重组人 β 干扰素 (rhIFN β)进行化学修饰。优化修饰条件 ,选择对rhIFN β反应性高的修饰剂 ,制备三种不同修饰程度的修饰物 ,并对修饰物进行初步检定。三种修饰物的修饰率分别为 10 .12 %、2 2 .99%、4 2 .4 7% ;比活性分别保留为原来的 93.5 3%、4 8.6 9%、13.18% ;PEG修饰后的rhIFN

β-干扰素及其重组产品的基础和临床应用

β干扰素(IFNβ)是一种具有广泛抗病毒、抗肿瘤及免疫调节功能的细胞因子,随着基因工程技术的应用,已获得两种重组β干扰素并用于临床。如何对重组β干扰素进一步优化,提高其临床应用价值仍是研究的重点。本文不仅对β干扰素的结构、基因、受体、信号传导途径及生物学效应等方面,而且对目前市场上重组β干扰素的种类、来源、优缺点、临床应用及其优化方面的研究进展作一综述。

猪β-干扰素的研究进展

干扰素是由干扰素诱生剂诱导生物细胞所产生的一类高活性多功能的糖蛋白,干扰素自被发现以来,由于其广谱抗病毒、抗肿瘤活性及其强大的免疫调节作用而受到研究者们的重视。在其基因结构、作用机理及体外重组表达等方面都取得了巨大突破。作者综述了猪β-干扰素的基本特性、作用机理及其临床应用。

β-干扰素对SD大鼠急性脊髓损伤后Bax、Fas、Bcl-2基因表达的影响

目的研究β-干扰素在SD大鼠急性脊髓损伤中的治疗作用,探讨其对凋亡基因Bax、Fas、Bcl-2的表达的影响。方法用Allen装置撞击SD大鼠脊髓胸9-10(T9-10)节段,建立脊髓损伤模型。术后分为A组-脊髓损伤组(SCI组),B组-甲泼尼龙琥珀酸钠组(MP组),C组-β-干扰素组(IFN-β),D组(假手术组),用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测各组损伤脊髓组织中Bax、Fas、Bcl-2的基因表达情况。结果 RT-PCR结果显示:甲泼尼龙琥珀酸钠及β-干扰素能明显降低Bax、Fas表达,升高Bcl-2表达。结论β-干扰素具有减少SD大鼠急性脊髓损伤后Bax、Fas表达,并促使抑制Bcl-2表达。

β-干扰素对大鼠急性脊髓损伤后神经功能恢复的影响

目的初步探讨β-干扰素对大鼠急性脊髓损伤后神经功能恢复的影响。方法 SD成年大鼠40只随机分成A组(脊髓损伤组)、B组(甲基强的松龙干预组)、C组(β-干扰素干预组)、D组(假手术组)各10只,用改良的Allen装置撞击大鼠脊髓胸9~10节段建立脊髓损伤模型,术后各组予相应干预处理。采用BBB评分、改良Tarlov评分和斜板实验方法观察大鼠行为学改变情况,于术后第1、3、7、14和21天对大鼠急性脊髓损伤后不同时段的脊髓神经功能进行评分。结果大鼠急性脊髓损伤后BBB评分、改良Tarlov评分和斜板实验分值均近0,随着时间进展评分逐渐升高,B、C组升高明显,干预治疗的B、C组与A组相比7d内无显著变化(P>0.05),14d时有显著变化(P<0.05);但B组与C组比较无显著变化(P>0.05)。结论β-干扰素应用有利于大鼠急性脊髓损伤后神经功能恢复,其作用机制需要进一步研究。

激素联合β-干扰素治疗多发性硬化疗效分析

目的分析激素联合β-干扰素用于治疗多发性硬化的临床效果。方法选择多发性硬化患者100例进行治疗分析,并且根据患者选择治疗方法的差异将患者分为观察组和对照组,各50例,观察组患者采用激素联合β-干扰素进行治疗,对照组患者采用单纯的激素治疗,比较两组患者治疗的总有效率和治疗前后血清IL-6水平的变化情况。结果观察组患者治疗的总有效率为94%,对照组患者治疗的总有效率为74%,观察组患者的治疗效果更好;从血清IL-6指标的变化上看,两组患者治疗之前指标参数相似,而治疗后观察组患者为(16.38±5.27)g/L,对照组治疗后为(35.27±5.19)g/L,观察组的恢复水平明显优于对照组患者,两项判定指标相比差异均具有统计学研究意义(P<0.05)。结论采用激素联合β-干扰素治疗多发性硬化有着很好的临床效果,可以促进患者神经功能的恢复,降低患者出现残障的风险,并且安全性很高,有着积极的临床治疗价值。

重组β-干扰素上调HepG2细胞表达基因抑制性消减杂交技术筛选

目的利用抑制性消减杂交技术筛选重组β-干扰素（IFN-β）上调HepG2细胞表达基因。方法以重组IFN-β2000U·mL^-1刺激对数生长期HepG2细胞，设经0．9％氯化钠注射液作用的HepG2细胞为阴性对照组；制备HepG2细胞裂解液，从中提取mRNA并逆转录合成cDNA，经RsaⅠ酶切后，将实验组cDNA分成两组，分别与两种不同的接头衔接，再与阴性对照组cDNA进行两次消减杂交和两次抑制性聚合酶链反应（PCR），将产物与T／A栽体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠埃希菌进行基因文库扩增，随机挑选克隆PCR后进行测序及同源性分析。结果成功构建了重组IFN-β作用HepG2后差异表达的cDNA消减文库。扩增后得到50个200～1000bp插入片段的克隆，随机挑选其中31个插入片段测序，通过生物信息学分析获得其全长基因序列，共获得20种编码基因，其中1种为未知功能的新基因。结论通过该方法可筛选得到IFN-β作用于HepG2细胞后上调表达的部分基因，包括与细胞生长调节、物质代谢和细胞凋亡密切相关的一些蛋白编码基因。

亚洲猫β-干扰素基因的克隆与分析

[目的]为猫干扰素类生物制品的研究奠定基础。[方法]根据NCBI上的猫IFN-β基因序列,设计1对特异引物。以从病死猫肝脏组织中提取的基因组DNA为模板,进行PCR扩增。将扩增产物回收后,与pUCm-T载体连接,并转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞。通过PCR和双酶切对获得的质粒DNA进行鉴定后,进行序列分析和核苷酸、氨基酸序列同源性的比较。[结果]经PCR扩增,可获得一条561 bp的特异性条带。猫IFN-β基因已成功重组到载体中,获得阳性克隆。序列分析结果表明,亚洲猫IFN-β基因长561 bp,编码186个氨基酸,与已报道的猫IFN-β基因同源性达99.82%,而氨基酸序列未改变。[结论]该研究成功克隆了猫IFN-β基因,为进一步利用基因工程技术生产重组猫IFN-β基因及其生物学功能的研究奠定了基础。