长期施肥土壤β-葡糖苷酶动力学特性研究

以长期施肥的黑土和棕壤为供试对象,对土壤β-葡糖苷酶动力学特性进行研究.结果表明,土壤β-葡糖苷酶的酶促反应符合一级动力学模型.黑土有机肥处理对土壤β-葡糖苷酶动力学参数影响较大,Km和Vmax值均高于单施化肥和对照处理;与对照相比,化肥处理影响较小.棕壤施用化肥后,Km和Vmax值与其他处理相比均减小,有机肥处理后Vmax和Vmax/Km值增大.2种土壤各施肥处理β-葡糖苷酶的Vmax值与土壤有机质、全氮含量均呈显著正相关关系,并对施肥处理的响应较敏感.

低活性β-葡糖苷酶酵母菌株的筛选及其在黑莓果酒发酵中的应用

从本实验室保存的23株来源于自然发酵果酒的酵母中筛选到1株β-葡糖苷酶活性较低、生长快且不产膜的酵母FY4,经18S r DNA序列分析,该菌株鉴定为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。利用该菌株发酵黑莓果酒,通过单因素和正交试验考察了发酵温度、果胶酶用量、加糖量和接种量对黑莓果酒中花色苷含量的影响。结果表明,当酵母FY4接种量为2%,发酵温度为32℃,加糖量为14%,果胶酶添加量为0.22%时,发酵后黑莓果酒中的花色苷含量达到(406.31±5.64)mg/L,是相同条件下利用商业酿酒酵母PHYTHM.nsac发酵的黑莓果酒中花色苷含量的1.53倍。

两种气候条件下梯度有机质含量农田黑土纤维素酶和β-葡糖苷酶活性研究

利用空间移位的方法将5种有机质含量的农田黑土置于中温带大陆性季风气候(MAT4.5)和寒温带大陆性季风气候(MAT1.5)条件下,探究了气候-有机质-施肥对土壤纤维素酶活性和β-葡糖苷酶活性的影响。结果表明:在MAT4.5条件下农田黑土中纤维素酶活性要高于MAT1.5;随有机质含量升高,纤维素酶活性在MAT4.5条件下呈逐渐降低的趋势;施肥能明显提高纤维素酶活性,且在MAT4.5条件下增加幅度较大,而在MAT1.5条件下却呈现出“U”型变化趋势。MAT4.5条件下β-葡糖苷酶活性略高于MAT1.5条件下的活性,其活性均随着土壤有机质含量升高而增强;施肥能提高各有机质含量农田黑土中β-葡糖苷酶活性,在MAT1.5条件下提升幅度较大。方差分析表明气候-有机质-施肥的主效应对土壤纤维素酶与β-葡糖苷酶活性均有显著影响,但是交互作用只对纤维素酶整体活性有显著影响。

近暗散白蚁β-葡糖苷酶基因RpBg7的克隆及其在毕赤酵母中的表达

【目的】白蚁是自然界中利用木质纤维素能力很强的生物,是纤维素酶的天然资源库。本研究旨在挖掘新来源的纤维素酶基因,为生物质能源的高效利用提供新的天然酶。【方法】根据前期蛋白质组测序的结果,利用PCR结合RACE克隆了近暗散白蚁Reticulitermes perilucifugusβ-葡糖苷酶7(β-glucosidase 7)基因RpBg7 cDNA全长序列;通过生物信息学软件分析了RpBg7的序列;用表达载体pPICZαA在毕赤酵母Pichia pastoris X-33中表达RpBg7蛋白,并用4-硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷(4-nitrophenylβ-d-glucopyranoside,4pNPG)为底物检测了表达的RpBg7蛋白的酶活性。【结果】获得了近暗散白蚁的一个内源性β-葡糖苷酶7基因RpBg7(GenBank登录号:MN944395),其开放阅读框长1485 bp,编码495个氨基酸残基。RpBg7蛋白预测分子量为57 kD,属于糖苷水解酶1(glycoside hydrolase 1,GH1)家族,具有保守的碱性氨基酸残基Glu187和Glu394。通过毕赤酵母表达系统成功表达RpBg7蛋白。酶活性分析结果表明,毕赤酵母胞外分泌蛋白粗酶液和胞内蛋白粗酶液中RpBg7酶活性分别为4.43和7.47 U/mL。【结论】克隆并利用毕赤酵母表达了近暗散白蚁的GH1家族的一个β-葡糖苷酶7基因RpBg7,为后期纤维素酶的改造和应用提供了条件。

耐受酒精β-葡糖苷酶的添加对葡萄酒品质影响的研究

研究β-葡糖苷酶粗酶液在不同温度和不同乙醇浓度的缓冲溶液的酶活,β-葡糖苷酶对萜类物质的含量的影响,通过观察酒体澄清度和分析酒体口感确定β-葡糖苷酶对酒体品质影响。结果表明,在葡萄酒的发酵过程中添加β-葡糖苷酶能够增加萜类物质的含量,能提升葡萄酒的保健价值。在葡萄酒的酿造过程中,添加β-葡糖苷酶对葡萄酒口感没有明显的影响,添加β-葡糖苷酶对酒体的澄清度没有很大影响。在低温下,β-葡糖苷酶在较高的酒精浓度下保持较高的催化活性,从而增加了葡萄酒中萜类物质的含量。

摊放过程中茶树鲜叶呼吸率、β-葡糖苷酶活性、挥发物和糖苷芳香先成物的改变

将采下的茶树鲜叶放在室温25℃、相对湿度67％-72％的室内摊放12h，每2h进行一次测定。12h后，叶片含水量从75．1％降至68．1％，呼吸率只有刚采鲜叶的60．1％。叶片中的β-葡糖苷酶活性在10h后增加1．09～1．22倍。挥发物的含量在4h后增加1．87倍并达到峰值，然后下降。葡糖苷芳香先成物的含量，特别是顺-3-己烯醇先成物，在最初8h显著增加；10h后，其含量与刚采摘鲜叶中的含量相似。

白曲的β-葡糖苷酶活性及其对甘薯烧酒香气的作用

研究了β-葡糖苷酶的活性(BGA)在甘薯烧酒酿造中的作用。黑曲(A.awamori)中的BGA高于白曲(A.kawachii),白曲又高于黄曲(A.oryzae)。白曲中的BGA在制曲最后阶段迅速增强,低温制曲高于高温制曲。应用BGA弱的市售酶制剂进行了清香型甘薯烧酒的酿制试验。

副干酪乳杆菌β-葡糖苷酶的表达、纯化及酶学性质研究

为了实现糖苷类物质的高效转化,将来源于副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei) TK1501β-葡糖苷酶基因连接于表达载体pET28a(+)上,在E. coli BL21中表达,重组酶经镍离子亲和层析分离得到纯酶,其分子质量和比酶活分别为86. 63kDa和675. 56U/mg。最适作用温度和pH分别为30℃和6. 5。Mg^2+和Ca^2+对β-葡糖苷酶酶活抑制作用最小,Cu^2+几乎使其丧失催化活性。其底物特异性较宽泛,对大豆异黄酮、栀子苷、水杨苷、七叶苷、虎杖苷、熊果苷均有降解作用。以β-pNPG为底物时,该酶的Km和Vmax分别为1. 44mmol/L和58. 32mmol/(L·s),催化系数kcat为3 982/s。结果与分析表明,来源于副干酪乳杆菌TK1501β-葡糖苷酶对水解大豆异黄酮和合成糖苷将会发挥重要作用。

主要酿造因子对野生酵母β-葡萄糖苷酶产量的影响

实验考察了典型葡萄酒酿造因子糖、酸、醇对野生酵母β-葡萄糖苷酶产量的影响,以评价菌株在葡萄酒酿造条件下的应用性能。结果表明,各菌株β-葡萄糖苷酶主要定位在胞内,总酶活力以H.uvarum菌株的0.51U/mL为最高,P.fermentans菌株最小。各酿造因子对菌株产β-葡萄糖苷酶产量的影响差异较大。较高初始糖含量和低pH条件对各菌株产酶都有显著地抑制作用,其中P.fermentans菌株受抑制作用最大,在pH3.0条件下受抑制程度达到了63.50%-84.32%,Saccharomyces和Hanseniaspora两属酵母受影响较小,且H.uvarum在酸性条件下的产酶量最高。较低浓度的乙醇（5%）对菌株产酶有一定的促进作用,随着乙醇含量的增加,各菌株产酶量都受到了显著抑制,P.fermentans菌株甚至没有酶的产生。综合各因子对各菌株产酶量的影响情况,H.uvarum菌株以较优表现展示出其较好的应用前景。

pH值对纤维素酶系内切β-葡聚糖苷酶活力影响的酶催化动力学模型

pH值是影响酶催化反应速率的重要因素之一,建立动力学模型有助于定量分析酶解反应。经典的“三状态”动力学模型未考虑pH值对底物解离状态的影响及产物抑制的作用,该文对“三状态”动力学模型进行改进。在一系列假设基础上提出绿色木霉产纤维素酶水解羧甲基纤维素钠(CMC-Na)的反应机理,建立了pH值对纤维素酶系内切β-葡聚糖苷酶活力影响的动力学模型,推导出反应速率表达式。Lineweaver-Burk作图法求得内切β-葡聚糖苷酶水解CMC-Na在不同pH的动力学参数:K′m和V′max,试验最佳初始pH值与模型计算pH值符合,从而模型得以验证。

利用瞬间表达技术分析小麦几丁质酶和β-1,3葡聚糖苷酶基因的抗病性功能

几丁质酶基因和-β1,3葡聚糖苷酶基因是植物抗病反应过程中的两类重要的病程相关蛋白(PR)基因。为了快速准确地评价此类基因组成性表达后的抗病效果及在分子育种上的应用价值,利用瞬间表达技术分别在感病小麦品种离体叶片表皮细胞中过量表达1个小麦几丁质酶基因Cht4和2个小麦-β1,3葡聚糖苷酶基因G lb3s2和G lb3s6,并以GUS基因的共表达标识阳性转化细胞。基因枪轰击后高密度接种白粉病菌孢子,40h后观察转化阳性表皮细胞及其表面孢子的发育,并以阳性转化细胞中白粉病菌成功侵入的细胞所占比例(侵入频率)为指标分析目标基因的表达对白粉病菌入侵及吸器形成产生的影响(对照为单独导入GUS基因的表皮细胞)。结果表明,小麦几丁质酶基因Cht4(侵入频率为18.3%,对照为25.04%)和小麦-β1,3葡聚糖苷酶基因G lb3s2(侵入频率为19.63%,对照为24.63%)在感病小麦品种叶片表皮细胞中的瞬间表达,对白粉病菌侵入和吸器形成均有抑制作用,在一定程度上增强了表达细胞对白粉病菌的抗性。

绿色木霉MJ1产内切β-葡聚糖苷酶的分离纯化及酶学性质

利用KTAUPC-900快速蛋白液相色谱系统(FPLC)从绿色木霉MJ1固体发酵产物中分离纯化出内切β-葡聚糖苷酶。分离纯化后酶的比活力提高了28·6倍,回收率为19·7%。SDS-PAGE后经BIO-RAD凝胶成像系统分析该内切酶的分子量为64·7kD。酶学试验研究表明:该酶的最适反应温度53℃,最适pH为4·2,Lineweaver-Burk法求得动力学参数,Km和Vmax分别为1·230×10-2g/mL、2·396×10-2mg/(mL·min)。并确定了FPLC层析缓冲液的离子强度为2·2mmol/L时分离效果达到最佳。

一株绿色木霉产外切β-葡聚糖苷酶条件及其纯化与性质的研究

从树林中腐烂木块上采集并筛选出一株分泌外切β葡聚糖苷酶(exo1,4βD glucanaseorcellobiohydrolase,CBH)的绿色木霉菌株.在100mL的锥形瓶中装入40mL培养基的产酶状况最好,其通气量最佳,培养液初始pH为8时绿色木霉产生的CBH活力最高.随绿色木霉生长时间的延长,CBH的活力与培养基中的葡萄糖含量呈交替的一高一低的波浪状变化.通过硫酸铵分部分离、葡聚糖G100凝胶过滤、DEAE纤维素52阴离子交换柱层析等方法使绿色木霉所产的CBH达到了电泳纯,纯化倍数为16.3.CBH的反应最适温度为60℃,最适pH为6.0,Km(底物为羧甲基纤维素钠)为17.34mg/mL.

内切β-葡聚糖苷酶的分离纯化及酶学性质

利用A¨KTA UPC-900快速蛋白液相色谱系统(FPLC)从黑曲霉发酵粉中分离纯化出内切β-葡聚糖苷酶。分离纯化后的酶比活力提高了8.1倍,回收率为7.5%。经SDS-PAGE电泳分析该内切酶的相对分子质量为26 400。酶学试验研究表明:该酶的最适反应温度为55℃,最适pH为4.8,Lineweaver-Burk法求得动力学参数,Km和Vmax分别为6.838×10-3mg/mL、2.906×10-2(mL.min)/mg。并确定了FPLC层析缓冲液的离子强度为4.8 mmol/L时分离效果达到最佳。

康氏木霉内切β-葡聚糖苷酶的分离纯化及酶学性质

康氏木霉GIMP3.444经摇瓶发酵,获得分泌到胞外的纤维素酶,粗酶液经(NH4)2SO4分级沉淀、Sephacryl S200凝胶过滤层析、DEAE Sepharose FF离子交换层析及Octrl Separose CL-4B疏水层析分离纯化出一种内切型的β-葡聚糖苷酶,SDS-PAGE电泳鉴定为单一条带,BIO-RAD分析相对分子量为61.8 ku。该内切β-葡聚糖苷酶的最适反应温度为55℃,最适反应p H值为4.4,作用于羧甲基纤维素钠时,Lineweaver-Burk法求得Km、Vmax分别为4.81 mg/m L、2.48 mg/(min·m L)。

内切β-葡聚糖苷酶的分离纯化及酶学性质

通过分子筛层析和离子交换层析等手段,分离纯化了绿色木霉WS-71纤维素酶系中的内切型β-1,4-葡聚糖苷酶组分。通过SDS-PAGE电泳测得分子量为41.8kD,该酶组分的最佳水解温度是50℃,最适pH为4.6。酶在温度40～70℃和在pH4.0￣5.0的区间稳定。Fe3+,K+,Ca2+,Mg2+,Mn2+对酶解有促进作用,Hg2+,Cu2+,Zn2+和EDTA对酶解有不同程度的抑制作用。作用于羧甲基纤维素钠的Km值为16.78mmol/L,Vmax为5.612×10-4mol/min,Kcat为6.97S-1。

1株产纤维素酶细菌的内切-β-葡聚糖苷酶的分离纯化及其酶学性质

为对1种细菌来源的内切-β-葡聚糖苷酶进行分离纯化和酶学性质研究,利用盐析沉淀、凝胶层析、疏水层析和弱阳离子交换色谱等对细菌菌株DM-4所产内切-β-葡聚糖苷酶进行了分离纯化,利用SDS-PAGE电泳对其纯度和分子量进行检测,考察温度和pH值对酶活力的影响,最后计算酶的反应动力学常数。结果显示,经分离纯化,获得2个酶活组分CMC酶Ⅰ和酶Ⅱ,其纯化倍数分别为45.94倍和32.27倍,回收率分别为14.66%和8.33%。CMC酶Ⅰ和酶Ⅱ分子量分别为38.99、45.53 ku,其最适作用温度分别为55~60℃和55℃,最适pH值均为7.5。温度低于70℃时,2种酶组分均对热稳定,并在pH值为6.0~8.0范围内具有良好稳定性。CMC酶Ⅰ的K_(m)为2.55 g/L,V_(m)为37.59μg/(min·mL);CMC酶Ⅱ的K_(m)值为4.37 g/L,V_(m)为28.82μg/(min·mL)。结果表明,采用盐析沉淀、凝胶层析、疏水层析和弱阳离子交换色谱多种分离技术对菌株DM-4所产内切-β-葡聚糖苷酶具有良好的分离纯化效果,经凝胶电泳检测,酶组分达电泳级纯度。酶学性质表明,菌株DM-4所产的2种CMC酶组分均为中性偏碱性纤维素酶,这与霉菌来源的纤维素酶有所不同。

一种康氏木霉内切β-葡聚糖苷酶的分离纯化及酶学性质

为获得康氏木霉(Trichodermakoningii)内切β-葡聚糖苷酶组分,并研究其酶学性质,通过硫酸铵盐析、DEAE Sepharose FF阴离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析对康氏木霉GIMP3.444纤维素酶主要组分进行分离纯化,SDS-PAGE电泳检测蛋白质纯度和分子量,MALDI-TOFMS鉴定蛋白质种类。结果显示,从康氏木霉所产的纤维素酶系中分离纯化获得一种内切β-葡聚糖苷酶组分,相对分子质量为44 600,酶的比活力为19.65 U/mg。该内切酶的最适反应p H值为4.5,最适反应温度为55℃。以羧甲基纤维素钠(CMC-Na)为底物时,酶的米氏常数(Km)为7.22 mg/ml。不同金属离子对酶活性影响不同,其中Ca2+(0.3 mmol/L)对酶的抑制作用较强,抑制了近35%的活力。通过MALDI-TOFMS鉴定及数据库分析,确定该酶为一种新的内切β-葡聚糖苷酶组分。

pQE30-bgln原核表达质粒的构建和鉴定

构建重组原核表达质粒pQE30-bgln使之可以在大肠杆菌中表达以获得β-葡糖苷酶,用于提高从植物中提取白藜芦醇的得率.以克隆质粒pUCP67为模板,用降落PCR的方法扩增β-葡糖苷酶基因片段(bgln).利用原核表达载体pQE30构建pQE30-bgln重组质粒,用酶切电泳验证重组结果的正确性,测序检测质粒重组后序列情况.PCR结果显示扩增片段2.2 kb,与预期相同.重组质粒酶切后显示其大小约5.6kb,大小及酶切图谱与预期相同.经测序发现插入片段读码框正确.可用于原核表达的pQE30-bgln质粒构建成功.