仿刺参cytb和β-actin基因表达稳定性比较

基因表达分析需要采用内参基因来校正目的基因的表达量。采用半定量RT-PCR的方法分析了cytb和β-actin基因在仿刺参(Apostichopus japonicus)未受精卵、受精卵、多细胞期、囊胚期、原肠期、小耳状幼体、中耳状幼体、大耳状幼体、樽型幼体、五触手幼体、稚参11个发育阶段和幼参的体壁、体腔细胞、肠道和呼吸树中的表达情况。结果表明:cytb在不同发育阶段和不同组织中稳定表达;β-actin基因在稚参之前不同发育阶段中表达水平有显著差异,在幼参的体壁、肠道和呼吸树中稳定表达。此外,cytb在lipopolysaccgarides(LPS)刺激前后的原肠胚、小耳状幼体、中耳状幼体、大耳状幼体、樽型幼体、稚参和幼参四种组织中表达量无显著差异;β-actin基因在LPS刺激前后的幼参体腔细胞、肠道和呼吸树中表达量无显著差异。本研究为仿刺参功能基因表达分析中,cytb与β-actin基因作为内参基因的可行性提供了依据。

谢氏宽漠王β-actin基因cDNA克隆、序列分析及表达量检测

β-actin是actin家族的一员,在维持细胞结构、运动和分裂等细胞生理活动方面发挥着重要作用,是基因定量实验中最常用的内参之一。本实验采用同源克隆和RACE技术扩增得到谢氏宽漠王Mantichorula semenowi β-actin基因。序列分析结果表明,该基因cDNA全长1372bp,开放阅读框长1131bp,编码376个氨基酸,5′和3′末端非翻译区域(UTR)分别为66bp和175bp;该序列与其他动物β-actin基因核苷酸序列具有96%～99%高度同源性。β-actin表达量检测结果显示热激后不同恢复时间其表达量无明显变化,且与未经热激处理的对照相比无显著差异。表明β-actin是研究受外界环境胁迫作用下昆虫体内不同基因表达水平的可靠内参基因。

鸡β-actin基因实时荧光定量PCR方法的建立

根据GenBank上鸡β-actin基因的序列，在保守区域设计并合成一对引物，采用SYBRGreenI染料建立了荧光定量PCR法（real-timePCR）。以常规PCR产物为标准品，建立了标准曲线，并进行了熔解曲线分析。结果表明，标准曲线Ct值检测范围为12～31，扩增效率为95．1％；熔解曲线分析结果显示产物特异的单个峰，其Tm为88±0℃，检测周期从RNA提取到荧光定量PCR结束只需4h。本试验建立的鸡β-actin基因实时荧光定量PCR法扩增效率高、检测范围广、检测周期短，为pactin基因作为内参基因进行鸡功能基因与病原基因表达的定量分析奠定了基础。

鸭β-actin基因实时荧光定量PCR方法的建立

根据GenBank中鸭β-actin基因的序列,在保守区域设计并合成一对引物,采用SYBR G reen I染料建立了荧光定量PCR法(real-tim e PCR).以PCR产物建立标准曲线,C t值线性范围为12.2~35.1,相关系数为0.996;熔解曲线分析显示产物为单特异峰,Tm为86.5±0℃.本实验建立的鸭β-actin基因实时荧光定量PCR法扩增效率高、线性范围广、检测周期短,为β-actin基因作为内参基因进行鸭功能基因与病原基因表达的定量分析奠定了基础.

白纹伊蚊β-actin基因实时荧光定量RT-PCR方法的建立

目的建立白纹伊蚊β-actin基因实时荧光定量RT-PCR法。方法根据GenBank上白纹伊蚊β-actin基因的序列（GenBank accession number：DQ657949）,利用Primer Express3.0软件设计并合成一对引物,采用SYBRGreen I作为染料建立实时荧光定量RT-PCR法。以Ct值为纵坐标,以稀释倍数的对数为横坐标,建立标准曲线,并进行溶解曲线分析。结果标准曲线Ct值检测范围为15~30,扩增效率为97.9%,相关系数为0.996,溶解曲线分析结果显示产物为特异的单峰,其Tm值为86.4℃。结论成功建立白纹伊蚊β-actin基因实时荧光定量RT-PCR法,为β-actin基因作为内参基因进行白纹伊蚊功能基因表达差异研究奠定基础。

嗜虫书虱β-actin基因克隆及定量PCR方法的建立

旨在建立嗜虫书虱的实时荧光定量PCR分析方法,为嗜虫书虱基因的定量分析提供技术支持。利用RT-PCR方法,从嗜虫书虱体内克隆获得了β-actin基因cDNA片段(GenBank登录号:FJ041117),该基因片段长度为822 bp,编码273个氨基酸残基(从第3个碱基开始编码)。根据此β-actin基因的序列设计引物,建立了基于SYBR Green I染料技术的实时荧光定量PCR方法。建立的嗜虫书虱β-actin实时荧光定量PCR法扩增效率高、检测范围广、检测周期短,为β-actin作为内参基因进行嗜虫书虱功能基因的定量分析奠定了基础。

金纹细蛾β-actin基因克隆及表达分析

为了明确β-actin基因在金纹细蛾定量实验中作为内参基因的可靠性。根据近缘物种同源基因设计简并引物,通过RT-PCR技术克隆得到金纹细蛾β-actin基因片段,并进行序列分析;利用QRT-PCR方法检测该基因在金纹细蛾不同发育时期及成虫5种组织间的表达情况。结果表明:金纹细蛾β-actin基因片段为594bp(GenBank登录号:KF880733),编码174个氨基酸残基,具有actin蛋白家族典型特征,富含4种类型特定功能位点,其氨基酸序列与其他鳞翅目昆虫的相似性均大于96%。金纹细蛾β-actin基因在其生长发育阶段稳定表达,无显著差异,可以作为研究金纹细蛾不同发育时期的内参;在成虫头、胸、足和翅4种组织间表达量无显著差异。

SYBR Green Ⅰ法洋虫β-actin基因实时荧光定量RT-PCR体系的建立

为了建立洋虫β-actin基因实时荧光定量RT-PCR体系,本实验采用MJ Research OpticonTM 2型实时荧光定量PCR仪,利用SYBR Green Ⅰ染料法,根据GenBank上其他昆虫β-actin基因的保守序列设计引物,对PCR退火温度、引物浓度、模板浓度等各反应因子进行优化,结合扩增曲线和熔解曲线进行分析。结果显示,在20μL体系下,当2×SYBRR Premix Ex TaqTM为10μL时,引物和cDNA模板的最佳浓度分别为1μmol/L和50ng/μL。最佳PCR反应程序为:94℃预变性30s,44个循环包括94℃变性10s,45℃退火30s,72℃延伸40s,最后加做熔解曲线82℃1s。结果表明,在洋虫不同发育时期β-actin基因表达水平基本稳定,因此β-actin基因可以作为洋虫实时荧光定量RT-PCR的内参基因。本研究成功建立了2-ΔΔCT相对定量法的洋虫β-actin基因实时荧光定量RT-PCR体系,并分析了优化PCR反应体系的重要性,建立的洋虫β-actin基因荧光定量RT-PCR方法简便、特异性强,该体系的建立可用于洋虫蜕皮相关基因表达差异的深入研究。

苹果蠹蛾β-actin基因cDNA的克隆、序列分析及mRNA表达稳定性检测

【目的】克隆苹果蠹蛾(Cydia pomonella(L.))的β-actin基因cDNA全长,确定其作为内参基因的可能性。【方法】运用RT-PCR和RACE技术分段扩增苹果蠹蛾β-actin基因5′和3′非编码区及保守区,拼接后根据所获序列设计引物,完整克隆苹果蠹蛾β-actin基因。利用生物信息学软件对苹果蠹蛾β-actin基因编码的蛋白质进行分析预测;通过实时定量PCR和半定量PCR方法,检测不同发育阶段以及杀虫剂处理后苹果蠹蛾β-actin mRNA的表达情况。【结果】苹果蠹蛾β-actin基因cDNA全长1 466bp(GenBank登录号为KC832921),包括5′非编码区67bp、3′非编码区268bp和开放阅读框1 131bp,编码一个由376个氨基酸残基组成的蛋白质。推导的蛋白质相对分子质量为41.793 7ku,等电点为5.29,含有3个actin蛋白家族的典型识别特征以及6种类型的特定功能位点,氨基酸序列与其他昆虫β-actin一致性高达99%。实时定量PCR和半定量PCR结果表明,β-actin基因在苹果蠹蛾发育不同时期以及杀虫剂处理后表达量无显著差异(P>0.05)。【结论】苹果蠹蛾β-actin基因可作为可靠的内参基因应用于基因mRNA的表达定量研究。

小鼠β-actin基因的RT-PCR克隆与真核表达

以Trizol-异丙醇法提取小鼠肝脏总RNA,根据NCBI数据库中小鼠β-actin基因序列设计引物,采用RT-PCR技术扩增小鼠β-actin基因编码区并测序;以pcDNA3.1-flag为载体,构建β-actin基因真核表达质粒,继而将其重组产物转染于HeLa细胞,采用Western blot印迹法鉴定重组蛋白pcDNA3.1-flag/β-actin的表达水平。结果表明：克隆获得的289 bp片段与NCBI数据库中β-actin基因序列完全吻合,并且成功构建的pcDNA3.1-flag/β-actin真核基因表达载体,其重组质粒可在HeLa细胞中有效表达约43×10^3KD融合蛋白。

中华卵索线虫β-actin基因的克隆与分析

利用RACE技术克隆中华卵索线虫Ovomermis sinensisβ-actin基因,RT-PCR方法检测该基因在中华卵索线虫不同发育时期的表达情况。结果首次获得了中华卵索线虫β-actin基因全长cDNA序列。该基因cDNA全长1636bp,其中ORF长1131bp,编码376个氨基酸;5′UTR长137bp;3′UTR长367bp。由该cDNA推导的蛋白质序列与秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans、人类等物种的β-actin蛋白序列相似性均在95%以上。系统进化树显示其系统发育关系与传统的分类关系基本一致。β-actin基因在不同发育时期的线虫中持续恒量表达。由此推断中华卵索线虫β-actin基因具有高度保守性,可以作为生物物种进化的分子标志,且能较好反映物种间的系统发生关系,是量化实验的理想内标参照。

米蛾β-actin基因cDNA片段的克隆及表达量检测

为克隆米蛾[Corcyra cephalonica(Stainton)]β-actin基因cDNA片段,建立米蛾β-actin基因实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法,并评估其在实时荧光定量研究中作为内参基因的可靠性,利用反转录PCR(RT-PCR)技术克隆获得米蛾β-actin基因cDNA片段,采用SYBR GreenⅠ染料法建立qRT-PCR方法,检测在米蛾卵、幼虫、蛹和成虫4个虫态中β-actin基因的表达量。获得了长为822bp的米蛾β-actin基因片段(Gen Bank accession:KJ599569),编码273个氨基酸残基;荧光定量标准曲线的Ct值检测范围为13~28,扩增效率为90.1%,相关系数R^2=0.992,溶解曲线分析结果显示产物为特异的单峰,其Tm值为(84±0.5)℃,符合定量要求;实时荧光定量结果表明,β-actin基因在米蛾不同发育历期中的表达水平无显著性差异(p>0.05)。成功建立了米蛾β-actin基因qRT-PCR方法 ,β-actin基因可以作为米蛾基因表达定量研究中的可靠内参基因。研究结果为β-actin作内参基因进行米蛾功能基因表达差异研究奠定了分子基础。

中华豆芫菁β-actin基因cDNA的克隆、序列分析及表达量检测

【目的】克隆中华豆芫菁(Epicauta chinensis Laporte)β-actin基因全长cDNA序列,并检测其在相对实时定量研究中作为内参基因的可靠性。【方法】采用RT-PCR和RACE技术扩增中华豆芫菁β-actin基因全长cD-NA序列,利用生物信息学软件对其进行序列分析;并用实时定量PCR方法检测在中华豆芫菁雄性成虫脑、中肠、精巢和脂肪体4种不同组织中及注射刺激和非刺激条件下β-actin基因的表达量。【结果】中华豆芫菁β-actin基因全长1 673bp,其中5′非编码区88bp,3′非编码区455bp,开放阅读框为1 120bp,编码376个氨基酸,推测其编码蛋白分子质量约为93.6ku,理论等电点为5.09,富含6类特定功能位点,其氨基酸序列与其他昆虫的β-actin序列一致性可达97%～99%;实时定量PCR结果显示,该基因在中华豆芫菁不同组织、注射刺激与非刺激情况下表达量无显著差异(P>0.05)。【结论】中华豆芫菁β-actin基因可作为基因表达定量研究中的可靠内参。该基因的cDNA序列已递交GenBank,获得登录号为JQ764814。

中国鲎β-actin基因的克隆与组织表达

中国鲎(Tachypleus tridentatus)是一种古老的海洋动物.利用RT-PCR和RACE等分子生物学技术,获得中国鲎β-肌动蛋白基因(中国鲎β-actin,简称为TTBA)全长cDNA序列,总共1 515bp,包括70bp 5′非编码区(untranslated regions,UTR)、314bp 3′UTR和一个1 131bp的开放阅读框(open reading frame,ORF).ORF可编码376个氨基酸残基,总分子质量约为41 807.7u.同源蛋白的序列比较结果显示,TTBA推导氨基酸序列与其他物种具有很高的相似性,推测β-actin基因具有很高的遗传保守性.而基于β-actin蛋白序列比对而绘制的系统进化树显示中国鲎与其他节肢动物具有较高的相似性,此结果与其现行的分类地位基本一致.以Real-time RT-PCR法检测表明,在卵子发生各期的卵巢组织中TTBA表达量保持稳定(p>0.05),可作为定量检测的内参基因.

桃小食心虫总RNA的有效提取与β-actin基因的克隆

根据桃小食心虫幼虫、蛹、成虫3种虫态各自形态及生理特点,克服了幼虫和蛹的几丁质、糖含量较高,成虫鳞片较多的特点,探讨3种虫态总RNA的提取方法;设计该物种β-actin基因的简并引物并对其产物克隆测序。结果表明:提取获得的RNA可以满足RT-PCR等后续试验需要;β-actin基因在桃小食心虫幼虫、蛹、成虫3种虫态中表达稳定;首次获得了桃小食心虫的β-actin基因序列(Genbank:KJ002793)。

RACE法克隆日本三角涡虫β-actin基因

采用cDNA末端快速扩增法(RACE),以日本三角涡虫cDNA为模板扩增β-肌动蛋白(β-actin)基因,对聚合酶链式反应(PCR)产物进行测序和拼接。经与NCBI核酸数据库进行序列比对,结果表明:产物的cDNA长度为1168 bp,开放阅读框ORF长999 bp,编码332个氨基酸,具有actin蛋白家族典型特征。

粘虫β-actin基因cDNA的克隆、序列分析及表达量检测

β-actin基因作为actin家族的一员,在基因定量实验中常用作内参基因。本实验运用RT-PCR和RACE技术,以粘虫Mythimna separata(Walker)cDNA为模板,对β-actin基因进行克隆获得全长cDNA序列,并利用生物信息学方法,对β-actin基因全长cDNA序列及推测得到的β-actin蛋白序列进行分析。结果表明,获得的粘虫核β-actin基因cDNA序列长度为1 472 bp,其中包括68 bp的5′非编码区、273 bp的3′非编码区和1 131 bp的开放阅读框,编码一个376个氨基酸蛋白,具有actin蛋白家族典型特征。推测得到的粘虫β-actin蛋白理论分子量为41.7497 ku,等电点为5.29,富含6种类型的特定功能位点。该蛋白序列与其他动物β-actin蛋白序列具有97.9%～99.7%高度同源性。β-actin表达量检测结果显示β-actin在6种不同组织间表达无显著差异(P>0.05),表明β-actin可作为研究粘虫不同基因表达水平高低的可靠内参基因。该基因的cDNA序列已经递交GenBank并获得登录号为GQ856238。

CYP4F2和β-actin基因实时荧光定量PCR标准品质粒和标准曲线的构建

目的制备用于CYP4F2和β-actin基因mRNA实时荧光定量PCR检测的标准品质粒与标准曲线。方法通过PCR扩增CYP4F2和β-actin进行双酶切鉴定和测序分析,确保重组质粒完整正确;大量抽提重组质粒,测定其拷贝浓度,10倍稀释成梯度标准品,目的片断纯化后直接连接于p GEM-T easy载体,转化E.coli DH5α宿主菌,获得阳性克隆;通过PCR扩增进行荧光定量PCR检测分析。结果 CYP4F2和β-actin基因目的片段均成功重组,获得的重组质粒保持了目的片段的特异性和序列完整性。梯度浓度标准质粒的实时荧光定量PCR结果显示,循环阈值(Ct)与起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系。结论成功构建了CYP4F2和β-actin基因实时荧光定量PCR标准品质粒和标准曲线。

缢蛏β-ACTIN1基因的分子特性及其表达分析

为研究缢蛏功能基因的表达调控,利用SMART cDNA文库构建试剂盒成功构建了缢蛏肝脏组织的标准化cDNA文库。对随机选取的5 679个克隆进行随机测序,比对、筛选出2条β-actin同源序列,对其中一条EST序列两端进行扩增、测序,然后进行5′RACE(rapidamplification of cDNA ends,RACE)扩增、测序,拼接得到全长cDNA序列,命名为β-ACTIN 1。该序列全长为1 552 bp,包括73 bp的5′非翻译区和348 bp的3′非翻译区,以及1 131 bp的开放阅读框。阅读框共编码376个氨基酸,推算分子量约为41.95 ku,理论等电点为5.23。与其他7种软体动物的氨基酸序列进行比对发现,β-ACTIN1基因的氨基酸序列中Ile179、G lu229、Ser232、Pro236、Ile248、Asn272、Cys273、Val283、Ser320、Ser325、Val330、Pro339等12个氨基酸残基具有特异性;同时发现缢蛏β-ACTIN 1氨基酸序列与其他软体动物的相似性高达97%以上。系统进化分析显示,缢蛏首先与软体动物聚在一起,然后与节肢动物聚在一起,再依次与鱼类、两栖类、哺乳类聚在一起。荧光定量PCR检测结果显示,β-ACTIN1基因在缢蛏各组织中的表达及鳗弧菌诱导后的表达均不稳定,不适合作为内参基因。

柔嫩艾美球虫免疫与鸡盲肠扁桃体TNF-α基因表达动态的关系

根据GenBank上鸡β-actin、TNF-α的基因序列设计引物,应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术克隆获得了β-actin和TNF-α基因,采用β-actin为内参的半定量方法检测TNF-αmRNA在鸡柔嫩艾美球虫免疫前后不同时间的表达情况,以探讨TNF-α基因的表达动态与柔嫩艾美球虫免疫的关系。结果显示,TNF-α基因在两次免疫期间的表达量整体上呈现双峰模式,首免后第9 d达到一个高峰,二免后第7d达到另一个高峰。结果表明,TNF-α在抗球虫感染中有一定的作用。