刀鲚Δ6脂肪酸去饱和酶cDNA的克隆与组织表达检测

利用RT-PCR和RACE技术获得刀鲚（Coilia nasus）Δ6脂肪酸去饱和酶（Δ6 fatty acyl desaturase,FAD6）的全长cDNA序列2 032 bp,开放阅读框（ORF）为1 338 bp,编码445个氨基酸。其具有3个保守的组氨酸簇（HDXGH、HXXHH和QXXHH）、2个跨膜区和含亚铁血红素结合基序（HPGG）的细胞色素b5结构域等典型的Δ6脂肪酸去饱和酶结构特点。氨基酸同源性分析显示,刀鲚FAD6与海鳗（Muraenesox cinereus）和军曹鱼（Rachycentron canadum）等海水鱼类的相似性达75%～79%,而与淡水鱼类的相似性较低。系统进化分析也显示,其与海水鱼类的亲缘关系较近。荧光定量PCR检测发现该基因在刀鲚脑和肠中高表达,肌肉和肝脏相对高表达,心脏、肾脏和鳃低表达。

建鲤两种Δ6脂肪酸去饱和酶基因克隆与表达

利用逆转录PCR和RACE技术获得建鲤2种Δ6脂肪酸去饱和酶(FADs6-a,FADs6-b)的全长cDNA序列.FADs6-a基因的cDNA总长为1 966 bp,开放阅读框为1 335 bp,编码444个氨基酸;FADs6-b基因的cDNA总长为1 931 bp,开放阅读框为1 335 bp,编码444个氨基酸.FADs6-a和FADs6-b基因都包括N端细胞色素b5结构域、3个富含组氨酸的结构域和2个推测的跨膜区,具有典型的Δ6脂肪酸去饱和酶结构特点.氨基酸同源性分析显示,建鲤FADs6-a和FADs6-b与斑马鱼的相似性较高,而与海水鱼类的相似性较低,与人类FADs6的相似性高于与FADs5的相似性.通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测该基因在建鲤幼鱼不同组织中的表达量,发现2种Δ6脂肪酸去饱和酶基因在建鲤肝脏的表达量最高,其次是肠、脑、肌肉、心和肾,而前肠高于后肠,FADs6-a的表达量高于FADs6-b.得到的结论是,建鲤具有2种类型的合成高度不饱和脂肪酸(HUFA)的关键酶—Δ6脂肪酸去饱和酶,在肝脏和肠道中的含量较多,且FADs6-a和FADs6-b在结构和组织的表达方面都存在差异,这为进一步研究建鲤HUFA的合成途径及调控机理奠定了基础.

饲料中高不饱和脂肪酸对刀鲚幼鱼不同组织中FAD基因表达的影响

选用初始体质量为(2.78±0.09)g的刀鲚幼鱼作为研究对象,随机分为2组(每组3个重复,每个重复500尾),分别投喂不添加鱼油(对照组)和添加4.76%精制鱼油(HUFA组)的2种配合饲料,饲养60 d后采样。通过荧光定量PCR检测Δ6脂肪酸去饱和酶基因基因在刀鲚幼鱼脑、肝脏、肌肉等不同组织中的表达量。结果显示:饲料中脂肪含量可以上调Δ6脂肪酸去饱和酶基因在组织中的表达。HUFA组刀鲚幼鱼Δ6脂肪酸去饱和酶基因在肝脏、心脏中的表达量极显著高于对照组(P<0.01),在鳃中的表达量显著高于对照组(P<0.05)。

中华绒螯蟹FAD6-b基因的全长克隆及原核表达分析

根据已登录的中华绒螯蟹一种Δ6去饱和酶基因(Accession Number:JX946434)及菁夜蛾去饱和酶基因(Accession Number:KJ622055.1)的保守区设计引物,通过逆转录PCR以及RACE技术克隆了中华绒螯蟹另一种Δ6去饱和酶基因FAD6-b的全长序列。经序列分析,中华绒螯蟹FAD6-b cDNA全长为2 310 bp,其中开放阅读框(ORF)为1 326 bp,共编码442个氨基酸(Accession Number:KP876058),理论分子量为50.86 ku,理论等电点为8.47,FAD6-b基因的氨基酸序列与已公布的一条中华绒螯蟹Δ6去饱和酶基因的一致性为76%。原核表达载体构建及其表达实验表明,中华绒螯蟹FAD6-b基因成功重组到原核表达载体pCold-TF DNA中,重组质粒pCold TF-fad6b在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中进行表达,经SDS-PAGE电泳分析表明,IPTG诱导后的重组菌出现了单一的蛋白条带,且大小与预期(105.86 ku)一致,可溶性分析显示目的蛋白主要存在于蛋白上清液中。对重组蛋白进行纯化,蛋白纯化液经电泳检测后显示出特异性单一条带,进一步证明了pCold TF-fad6b的成功构建和表达。目的蛋白经Western-blotting检测,结果表明获得的重组蛋白与6×His抗体进行了特异性结合,显示出良好的免疫学活性。