茶树△12-脂肪酸去饱和酶基因FAD2和FAD6的克隆与表达分析

本研究在茶树转录组测序的基础上,以铁观音茶树的芽叶为材料,采用RT-PCR技术,克隆了茶树不饱和脂肪酸合成途径中的关键限速酶—△12-FAD(12-脂肪酸去饱和酶)基因的包含完整ORF的cDNA序列(CsFAD2和CsFAD6)。生物信息学分析结果表明,CsFAD2的全长为1 184 bp,其开放阅读框(ORF)长度1 149 bp,编码382个氨基酸,定位于内质网上,其氨基酸序列与油茶FAD2的同源性最高达97%;CsFAD6的全长为1 425 bp,其ORF长度为1 311 bp,编码436个氨基酸,定位于叶绿体上,其氨基酸序列与葡萄FAD6同源性达81%。荧光定量PCR结果表明,铁观音茶树幼苗在4℃低温胁迫处理72 h过程中,这两个基因的表达均受低温的诱导,其表达量随着处理时间的延长而升高,在处理48 h时,表达量水平最高;在100 g·L-1的PEG胁迫处理12 h过程中,这两个基因的表达均受PEG胁迫处理的诱导;在ABA(100μmol·L-1)胁迫处理72 h过程中,在处理6~24 h期间,CsFAD2的表达量显著升高,而CsFAD6的表达不受ABA处理的影响,CsFAD6的表达量在处理72 h时显著降低;在Na Cl(250 mmol·L-1)胁迫72 h过程中,CsFAD2的表达量全程降低,而CsFAD6在处理24~72 h期间表达量显著升高。

酶法纯化ω-6和ω-3多不饱和脂肪酸研究进展

多不饱和脂肪酸(PUFAs)具有重要的生理学活性,尤其是ω-6和ω-3系列与人体健康密切相关。因此,如何提取PUFAs非常重要,也是油脂领域的研究热点。利用酶法分离纯化PUFAs是一种环保、高效、具有广泛应用前景的方法。本文综述了酶法纯化ω-6和ω-3PUFAs的最新研究进展,并着重阐述了酶法催化水解、酶法选择性富集以及其它几种能和酶法有效结合、共同分离纯化PUFAs的物理化学方法,同时通过论述亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸等PUFAs的纯化进展证明了酶法在该领域内具有很大发展前景。

建鲤两种Δ6脂肪酸去饱和酶基因克隆与表达

利用逆转录PCR和RACE技术获得建鲤2种Δ6脂肪酸去饱和酶(FADs6-a,FADs6-b)的全长cDNA序列.FADs6-a基因的cDNA总长为1 966 bp,开放阅读框为1 335 bp,编码444个氨基酸;FADs6-b基因的cDNA总长为1 931 bp,开放阅读框为1 335 bp,编码444个氨基酸.FADs6-a和FADs6-b基因都包括N端细胞色素b5结构域、3个富含组氨酸的结构域和2个推测的跨膜区,具有典型的Δ6脂肪酸去饱和酶结构特点.氨基酸同源性分析显示,建鲤FADs6-a和FADs6-b与斑马鱼的相似性较高,而与海水鱼类的相似性较低,与人类FADs6的相似性高于与FADs5的相似性.通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测该基因在建鲤幼鱼不同组织中的表达量,发现2种Δ6脂肪酸去饱和酶基因在建鲤肝脏的表达量最高,其次是肠、脑、肌肉、心和肾,而前肠高于后肠,FADs6-a的表达量高于FADs6-b.得到的结论是,建鲤具有2种类型的合成高度不饱和脂肪酸(HUFA)的关键酶—Δ6脂肪酸去饱和酶,在肝脏和肠道中的含量较多,且FADs6-a和FADs6-b在结构和组织的表达方面都存在差异,这为进一步研究建鲤HUFA的合成途径及调控机理奠定了基础.

微小毛霉Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因的克隆与表达

微小毛霉(Mucor.pusillus)Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因的克隆与表达。以一株产γ-亚麻酸的微小毛霉为材料,通过PCR方法克隆得到的Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因,构建重组的酵母表达载体pYMpD6D,将重组载体通过醋酸锂方法导入酿酒酵母中,并利用酵母表达系统证实该基因能导致酵母合成γ-亚麻酸。通过GC分析,γ-亚麻酸占总脂肪酸量的6.53%,微小毛霉Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因在酵母中得到了正确的表达。此试验为进一步研究Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因家族和进一步利用该基因来改良作物奠定了一定的基础。

沙棘ω-6脂肪酸去饱和酶基因的分子进化

运用生物信息学分析手段和在线数据库,对沙棘ω-6脂肪酸去饱和酶基因进行综合分析。结果显示:该基因全长为1 562 bp,开放读码框为1 152 bp;编码383个氨基酸,分子量为44 010.5道尔顿;等电点为8.63,带正电荷侧链的氨基酸与带负电荷侧链的氨基酸比例为29∶34;氨基酸组成中亮氨酸占10.7%,缬氨酸占7.8%,丙氨酸占6.8%;不稳定指数为36.73,脂肪指数为89.58,总平均疏水指数为-0.016,为亲水蛋白;其二级结构以无规则卷曲与折叠为主,属膜蛋白,有3个酪氨酸激酶II磷酸化位点、2个N-肉豆蔻酰化位点、4个蛋白激酶C磷酸化位点、3个N-糖基化位点、1个酪氨酸激酶磷酸化位点和1个微体C-端定位信号;该蛋白为质膜-脂肪酸去饱和酶域超家族蛋白(Membrane-FADS-like superfamily)。功能预测分析结果显示与其他物种的该去饱和酶特性相一致。

沙棘ω-6脂肪酸去饱和酶基因的克隆

利用同源基因克隆技术克隆沙棘ω-6脂肪酸去饱和酶基因,聚合酶链式反应(PCR)扩增获得的目的基因序列,序列长度541 bp。经局部序列排比检索基本工具(BLAST)检索核酸同源序列,验证分析发现,该序列与大豆、菜豆、苜蓿ω-6脂肪酸去饱和酶基因同源性分别达到76%、75%和74%,说明其确为沙棘ω-6脂肪酸去饱和酶基因的部分片段。

△~6-脂肪酸脱饱和酶基因种子特异表达载体的构建

以napA基因序列设计引物,以甘蓝型油菜中油821基因组总DNA为模板,通过PCR扩增,克隆了种子特异表达napin启动子。序列分析表明,试验得到扩增片段长1148bp,含有其它napin启动子序列共有的高度保守序列。将扩增序列与真菌匍枝根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因RnD6D连接,构建了RnD6D的种子特异表达载体pCNR,为获得高产γ-亚麻酸的转基因油菜奠定了基础。

卷枝毛霉△6-脂肪酸脱饱和酶基因的敲除及功能研究

γ-亚麻酸(γ-Linolenic acid,GLA)是人体所必需且具有多种生理功能的一种重要多不饱和脂肪酸。研究表明,卷枝毛霉等GLA生产菌株中△6-脂肪酸脱饱和酶(△6-Fatty acid desaturase,FAD6)是合成γ-亚麻酸的关键和限速酶,然而GLA是否惟一通过△6-脂肪酸脱饱和酶途径合成则目前还没有报道。作者以卷枝毛霉Mucor circinelloides EIM10 sp.为研究对象,以其FAD6基因的5'端启动子和3'端终止子为同源臂,潮霉素B抗性基因为筛选标记,构建了M.circinelloides EIM10 sp.△6-脂肪酸脱饱和酶FAD6的敲除载体p UMCD6-Hm B,转化进入制备好的原生质体中成功地敲除了FAD6基因,发现FAD6基因缺陷菌株GLA质量浓度比野生型对照菌株降低了50%以上,但GLA并没有完全消失,说明卷枝毛霉生物体内还有其他代谢途径可以将碳源转化为GLA。

Δ~6-脂肪酸脱氢酶的分子生物学研究进展

包括γ_亚麻酸在内的多不饱和脂肪酸由于在人类健康中的重要作用而成为有价值的产品 ,目前市场上对γ_亚麻酸的需求持续增长 ,然而当前来源难以满足市场的需求 ,寻找合适的替代来源将有助于解决这一问题。Δ6 _脂肪酸脱氢酶是多不饱和脂肪酸合成途径中的限速酶 ,这里从Δ6 _脂肪酸脱氢酶的基因克隆、结构和功能的研究、系统进化和基因工程应用等方面探讨了Δ6 _脂肪酸脱氢酶的研究进展。

高山被孢霉ATCC16266Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中的表达

Δ6 脂肪酸脱氢酶是形成γ 亚麻酸的关键酶。从含有高山被孢霉Δ6 脂肪酸脱氢酶基因的重组质粒pT MACL6中 ,酶切出 1 4kb的目的片段 ,亚克隆到大肠杆菌和酿酒酵母的穿梭表达载体 pYES2 .0 ,在大肠杆菌中筛选到含有目的基因的重组质粒 pYMAD6 ,用醋酸锂方法转化到酿酒酵母的缺陷型菌株INCSc1中 ,在SC Ura合成培养基中 ,选择得到酿酒酵母工程株YMAD6。在合适的培养基及培养条件下 ,加入外源底物亚油酸 ,经半乳糖诱导后 ,收集菌体。通过GC MS对酵母工程株进行脂肪酸色谱分析 ,结果表明 ,产生了 31 6 %的γ 亚麻酸。这是迄今为止 ,国内外Δ6 脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中表达量最高的报道。

深黄被孢霉M_(6-22) Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中的表达

应用PCR技术 ,从含有深黄被孢霉Δ6 脂肪酸脱氢酶基因的重组质粒pTMICL6中 ,扩增出 1 38kb的目的片段 ,亚克隆到大肠杆菌和酿酒酵母的穿梭表达载体pYES2 .0 ,在大肠杆菌中筛选到含有目的基因的重组质粒pYMID6,用醋酸锂方法转化到酿酒酵母的缺陷型菌株INVSc1中 ,在SC Ura合成培养基中 ,选择到酵母工程株YMID6。在合适的培养基及培养条件下 ,加入外源底物亚油酸 ,经半乳糖诱导后 ,收集菌体。通过GC MS对酵母工程株所含的全部脂肪酸进行色谱分析 ,结果表明 ,γ 亚麻酸的含量占酵母总脂肪酸的 8 69%。

姬松茸ω-6多不饱和脂肪酸对高血脂鼠的降血脂作用

目的:观察姬松茸ω-6多不饱和脂肪酸(-ω6APFA)对高血脂鼠的降血脂作用。方法:大鼠60只,随机分为空白对照组、模型组、天然大豆磷脂胶囊(NSPC)0.70 g.kg-1剂量组和-ω6APFA 0.28、0.14、0.07 g.kg-13个剂量组(n=10)。除空白对照组外均连续给予高脂饲料14 d,于第14天起开始连续灌胃给药14 d,对照组和模型组给予等容积蒸馏水10 mL.kg-1。实验结束后麻醉大鼠,腹主动脉取血测血清总胆固醇(T-CHO)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)。同时测肝脏超氧化物歧化酶(SOD)活性、肝脏丙二醛(MDA)含量及腹腔脂肪蓄积系数。雄性小鼠72只,随机分为空白对照组、模型组、NSPC 1.0 g.kg-1剂量组、-ω6APFA 0.4、0.2、0.1 g.kg-13个剂量组(n=12),连续给药7 d,末次给药前16 h除空白对照组,均腹腔注射75%蛋黄生理盐水液0.5 mL,并开始饥饿,末次给药后1 h,于眼球采血,测血清T-CHO及TG含量。结果:与模型组比较,NSPC 0.70 g.kg-1和-ω6APFA 0.28 g.kg-1剂量组大鼠血清T-CHO、TG均明显降低,血清HDL-C升高(P<0.001);NSPC 0.70 g.kg-1和-ω6APFA 0.28、0.14 g.kg-1剂量组大鼠肝组织SOD活性升高(P<0.05、P<0.001及P<0.05),MDA降低(P<0.01、P<0.001及P<0.01),大鼠腹腔脂肪系数均降低(P<0.01)。与模型组比较,NSPC 1.0 g.kg-1、-ω6APFA0.4、0.2 g.kg-1组急性高血脂小鼠T-CHO和TG明显降低(P<0.05、P<0.01及P<0.05)。结论:ω-6APFA对高血脂鼠有明显的降血脂作用。

来源于线虫Caenorhabditis briggssae的ω-3脂肪酸去饱和酶基因的合成及其功能分析

ω-3多不饱和脂肪酸(ω-3PUFAs)是一类被广泛研究和关注的脂肪酸,对人类及其他哺乳动物的正常发育和保持良好的健康状况极其重要,并且对于人类的多种疾病的预防和治疗亦有着明显的作用。在人和哺乳动物体内,ω-3PUFAs的含量与ω-6PUFAs(其代谢方式和功能与前者不同,通常其作用也相反)相比很低。而对于人体,无论ω-3PUFAs的过低还是ω-6PUFAs的过高都会带来极为不利的影响。所以人们一直在努力寻求提高人体中ω-3PUFAs含量的途径或者大量生产ω-3PUFAs的方法。本研究经过密码子优化后,用化学合成的方法获得了C.briggsae的ω-3脂肪酸去饱和酶基因sFat-1,并构建了哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1-sFat1-EGFP,通过脂质体转染了CHO细胞系并对其进行抗性筛选获得稳定转染细胞株。对稳定转染sFat-1细胞株的RT-PCR分析及脂肪酸组成的GC-MS分析表明,sFat1基因完全能够在CHO细胞中表达和发挥其ω-3去饱和酶的作用,即促使ω-6系列不饱和脂肪酸转变为相应的ω-3系列不饱和脂肪酸(从十八碳到二十二碳)。ω-6不饱和脂肪酸总量从48.97%下降到35.29%,而ω-3不饱和脂肪酸总量则相应地从7.86%上升到24.02%。ω-6多不饱和脂肪酸和ω-3多不饱和脂肪酸的比值从正常细胞中的6.23下降到转染细胞中的1.47。这说明C.briggsae的ω-3脂肪酸去饱和酶基因sFat-1的合成是成功的,试验所获得的结果为今后的进一步的研究或应用其大量生产ω-3PUFAs奠定了基础。

深黄被孢霉△~6-脂肪酸脱氢酶基因的克隆及序列分析

γ－亚麻酸（ＧＬＡ，Ｃ１８：３△６，９，１２）是由△６－脂肪酸脱氢酶以亚油酸（ＬＡ，Ｃ１８：２△９，１２）为底物，在Ｃ６位脱氢形成的。由于在人体中，γ－亚麻酸是花生四烯酸、前列腺素类和白三烯类等生理活性物质的前体物，而深黄被孢霉是目前用于微生物发酵生产γ－亚麻酸的主要菌株。本文根据脂肪酸脱氢酶的保守区设计引物，利用反转录聚合酶链式反应从丝状真菌深黄被孢霉中克隆了编码△６－脂肪酸脱氢酶的ｃＤＮＡ，全长为１３７４个核苷酸，编码４５７ 个氨基酸，但与其他位点的脂肪酸脱氢酶不同的是， △６－脂肪酸脱氢酶在其序列的 Ｎ 端特有细胞色素 ｂ５（Ｃｙｔｂ５）区。这是国际上对深黄被孢霉△６－脂肪酸脱氢酶基因的首次报道。

深黄被孢霉Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因在大豆中的表达

为在传统的油料作物大豆中产生γ 亚麻酸 ,从深黄被孢霉中克隆的Δ6 脂肪酸脱氢酶基因与植物表达载体pBI12 1连接 ,构建了重组质粒pBMICL6 ,采用农杆菌介导的大豆子叶节转化系统成功的将该基因导入到栽培大豆吉林 35、吉林 4 3、吉林 4 7、绥农 10、绥农 14和黑农 37等品种中 ,获得一批转基因植株。经PCR检测和Southern杂交分析 ,证明外源基因已导入并整合到大豆的基因组中。Northern杂交结果表明该基因在转基因大豆的mRNA水平上获得表达。对转基因大豆种子进行脂肪酸成分分析 ,结果表明Δ6 脂肪酸脱氢酶基因获得表达 ,产生了γ 亚麻酸 ,其含量最高可达 2 7 0 6 7% ,这是国内外深黄被孢霉Δ6

花生Δ^(12)-脂肪酸去饱和酶基因RNAi表达载体的构建

利用RNAi原理构建花生Δ12-脂肪酸去饱和酶基因的hpRNA表达载体,以抑制该基因的表达,获得高油酸/亚油酸比值的花生种质。根据花生Δ12-脂肪酸去饱和酶基因序列(GenBank:AF248739)设计引物,以豫花4号花生品种DNA为模板,克隆了该基因的启动子及长度约500 bp的外显子片段,在此基础上构建完成由自身启动子引导的花生Δ12-脂肪酸去饱和酶基因的反向重复片段RNAi载体pCAMBIA1301-Afad12Ri。

少根根霉Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因在转基因油菜中的表达

【目的】验证少根根霉△6-脂肪酸脱氢酶基因在转基因油菜中的表达情况,为进一步基因工程化生产γ-亚麻酸打下基础。【方法】将少根根霉△6-脂肪酸脱氢酶基因和植物表达载体pCPN2301连接,构建重组表达质粒pCPNRAD6,采用农杆菌介导的油菜子叶节转化法,将该基因导入甘蓝型油菜H165,获得转基因植株,最后通过气相色谱检测基因的表达情况。【结果】PCR、GUS组织化学染色和Southern杂交分析结果表明,目的基因已经整合到油菜基因组中,Northern杂交分析进一步表明目的基因在RNA水平获得表达,气相色谱分析检测到转基因油菜叶片中γ-亚麻酸和十八碳四烯酸生成,证明目的基因获得功能表达。同样,用改变少根根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的转译起始密码子周边序列的基因RAD6-1所构建的转基因酵母中,也得到类似的结果,而且各种目的脂肪酸的含量均有提高。【结论】初步建立了少根根霉△6-脂肪酸脱氢酶基因在转基因油菜中的表达体系。

高山被孢霉Δ^6-脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中的胞内表达

γ 亚麻酸 (GLA)作为人体必需的不饱和脂肪酸 ,具有重要的营养和药用价值。Δ6 脂肪酸脱氢酶是γ 亚麻酸合成途径中的关键酶。为了在毕赤酵母中建立一种新的合成γ 亚麻酸的表达体系 ,将高山被孢霉Δ6 脂肪酸脱氢酶基因与胞内表达载体pPIC3 5K连接 ,SacⅠ线性化后电击法转化毕赤酵母SMD116 8,获得的转化子经PCR鉴定目的基因已整合到毕赤酵母的基因组中。用甲醇诱导表达 ,通过脂肪酸气相色谱和气相色谱 质谱 (GC MS)联用分析表明高山被孢霉Δ6 脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中获得表达 ,γ 亚麻酸含量占总脂肪酸的 16 2 6 %。

军曹鱼△6脂肪酸去饱和酶的cDNA序列克隆与基因表达

为了研究海水鱼合成高度不饱和脂肪酸(Highly unsaturated fatty acids,HUFAs)的关键酶,本研究克隆了军曹鱼(Rachycentron canadum)的△6脂肪酸去饱和酶的部分cDNA序列。根据GenBank已公布的其他鱼类的△6脂肪酸去饱和酶cDNA序列进行分析,设计了一对用于PCR扩增军曹鱼的△6脂肪酸去饱和酶基因保守序列的引物;然后以军曹鱼肝总RNA为模板,通过RT-PCR的方法扩增出一段长度为743bp的片段,该片段经纯化后,连接至pMD18-T载体上进行测序。结果显示,该片段与欧洲狼鲈(Dicentrarchus labrax)△6脂肪酸去饱和酶基因的覆盖区同源性为90.4%,该蛋白结构含有2个组氨酸保守区(HDFGH和HFQHH)和2个跨膜结构域,具有典型的△6脂肪酸去饱和酶结构特点。通过荧光定量PCR(Real-time quantityPCR,RTQ-PCR)检测该基因在军曹鱼幼鱼不同组织中的表达量,发现△6脂肪酸去饱和酶基因在军曹鱼脑的表达量最高;其次是肝;再其次是心、肠、脾、肾、鳃;而肌肉和皮肤的表达量相对较低,在脂肪组织中没有检测到△6去饱和酶基因的表达。结论为,军曹鱼具有合成HUFAs的关键酶—△6脂肪酸去饱和酶,在其所有组织中以脑之含量最多。

少根根霉Δ_-~6脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中的表达(英文)

Δ6- 脂肪酸脱氢酶是一种膜整合蛋白,也是多不饱和脂肪酸合成途径中的限速酶。在前期工作中,通过RT PCR和RACE技术,从少根根霉NK300037中克隆到一个潜在编码Δ6- 脂肪酸脱氢酶的序列,序列和功能分析结果表明该序列具有一个长度为1377bp、编码由458个氨基酸组成、大小为52kD的新的Δ6- 脂肪酸脱氢酶基因。把少根根霉Δ6- 脂肪酸脱氢酶基因(RAD6)亚克隆到表达载体pPIC3.5K,构建重组表达载体pPICRAD6,并转化到毕赤酵母菌株GS115进行表达。提取酵母细胞总脂肪酸和进行甲酯化,经气相色谱和气相色谱质谱连用分析表明,目的基因的编码产物能将C16∶1、C17∶1、C18∶1、亚油酸和α- 亚麻酸在Δ6和7位间特异性脱氢而引入一个新的双键,生成更高不饱和的脂肪酸,该催化反应没有链长特异性,只有键位特异性。此外,按Kozak序列特点,改变目的基因转译起始密码子周边序列结构,并把改变后序列导入毕赤酵母GS115中进行功能表达分析,结果表明在毕赤酵母中这种改变同样能提高目的基因的表达水平。综合所有分析结果表明,巴斯德毕赤酵母更适合用来综合分析Δ6 脂肪酸脱氢酶基因的功能。