表达PCV2 ORF2的重组T7噬菌体在猪体内的存留分析

为了检测经颈部肌肉注射入猪体的、表达猪圆环病毒2型(PCV2)衣壳蛋白(ORF2)的重组T7噬菌体(T7-ORF2)在体内的存留情况,本试验将PCV2抗原和抗体均为阴性的20日龄仔猪随机分为试验组和对照组,每组5只;试验组猪只以1.5mL/只剂量颈部肌肉注射增殖收获的T7-ORF2,对照组猪只以相同途径注射等体积的洗脱液;于注射前1 d、注射后10 h、1~7 d测量体温,观察猪只的临床症状和死亡情况;分别于注射后1 h、3 h、5 h、10 h、1 d、3 d、5 d和7 d采集猪只的血液和粪便样品,注射后10 h、1 d、3 d、5 d和7 d采集肝脏、脾脏和腹股沟淋巴结样品;将收集的各样品处理上清与宿主菌(大肠埃希菌BLT5403株)混合培养,通过细菌裂解分析T7-ORF2的感染性;以细菌裂解液提取的基因组DNA为模板进行PCR,检测ORF2基因;通过免疫组织化学检测T7-ORF2在肝脏、脾脏和腹股沟淋巴结中的分布和存留时间。结果显示,试验组猪只在试验期体温、采食、饮水和精神状态正常,无不良症状和死亡发生;注射后5 d能从血清和粪便中检测到感染性的T7-ORF2;注射后3 d能从肝脏、脾脏和腹股沟淋巴结中检测到感染性的T7-ORF2;从细菌裂解液中可扩增检测到PCV2 ORF2基因片段;免疫组织化学切片观察结果显示,T7-ORF2在机体中逐渐被清除,在脾脏中存留至少5 d,在肝脏和腹股沟淋巴结中存留至少7 d。结果表明,T7-ORF2可进入猪只的血液循环、肝脏、脾脏和腹股沟淋巴结中,并随粪便排出体外。本试验为利用T7-ORF2深入开发PCV2新型疫苗提供数据支撑。

大肠杆菌O157:H7烈性噬菌体SF08的分离、表征及在食品中的应用

本研究通过双层平板法从湖水中分离、纯化出一株大肠杆菌O157:H7烈性噬菌体,并命名为SF08。对其生物学特性、基因组序列及在即食鸡爪中的抑菌效果进行分析。结果表明,SF08由长约124 nm的可收缩尾巴和直径约76 nm的多面体头部组成。最佳感染复数(Multiplicity of Infection,MOI)为0.01;潜伏期为20 min,裂解期为20~110 min,爆发量为66 PFU/cell;在pH 3~12和30~70℃条件下能保持较高的活性。基因组全长59704 bp,G+C含量为56.52%,共有72个开放阅读框(ORF)。SF08在4℃下可以极显著地抑制即食鸡爪中模拟污染的大肠杆菌O157:H7(P<0.01)。本研究表明SF08具有较好的生物学特性及安全性,为后续研发和制备天然杀菌剂提供理论基础和参考。

用T7噬菌体展示筛选系统筛选与p38相结合的蛋白

目的用T7噬菌体筛选系统筛选与重要信号分子p38 MAPK结合的蛋白。方法以p38 MAPK为靶蛋白,分别用不同的介质(ELISA平板和Ni-NTA亲和树脂)筛选T7人肝和人肺cDNA文库。结果选择86个第4轮筛选后的洗脱噬菌体单个噬斑克隆,经EDTA处理后利用特异性PCR引物扩增插入片断,回收PCR产物并进行测序,将所得到的序列用BLAST软件搜索GenBank中的同源序列,得到了46个编码蛋白的序列。结论T7噬菌体展示筛选系统筛选新的结合蛋白简单、快速、有效。

用T7噬菌体展示技术筛选乙型肝炎病毒PreS1相互作用蛋白

目的:用T7噬菌体筛选系统筛选乙型肝炎病毒PreS1的相互作用蛋白。方法:应用T7噬菌体展示技术,以通过原核表达的方式得到的乙型肝炎病毒PreS1作为靶分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行生物筛选,对筛选到的克隆进行DNA序列分析及同源性搜索。结果:经鉴定得到1个阳性克隆,确定了能与乙型肝炎病毒PreS1相互作用的蛋白可能为:细胞色素C氧化酶1(Cytochrome c Oxidase Subunit I,COX1)。结论:T7噬菌体展示筛选系统是筛选相互作用蛋白的一种简单、快速和有效的手段,筛选到的相互作用蛋白为进一步探讨PreS1的致病机制提供重要依据。

人源抗汉坦病毒核衣壳蛋白T7噬菌体抗体库的构建

构建人源T7噬菌体单链抗体(scFv)库筛选抗汉坦病毒核衣壳蛋白(NP)抗体。从肾综合征出血热恢复期患者外周血淋巴细胞中提取总RNA,反转录合成cDNA第一条链,PCR分别扩增抗体重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),经重叠延伸拼接(SOE)PCR组成scFv基因,并将其与T7噬菌体载体的2个臂相连接。体外包装后,在宿主菌BLT5403中,扩增重组噬菌体抗体库。以基因工程表达NP进行4轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选,酶免疫实验检测抗体活性。所建抗体库库容为1.35×107,扩增后初级库滴度为2.12×1010pfu/mL。以NP抗原筛选后抗体出现特异性富集,经酶免疫实验鉴定,得到2株与NP抗原特异结合的噬菌体抗体。结果表明,研究成功构建了人源抗NP蛋白T7噬菌体抗体库。

东方田鼠肺脏T7噬菌体展示cDNA文库的构建

目的构建东方田鼠肺脏T7噬菌体展示cDNA文库,为筛选东方田鼠抗血吸虫感染抗性相关基因奠定基础。方法用TRIzol试剂提取东方田鼠肺脏总RNA,分离纯化mRNA,经反转录合成双链cDNA。在双链cDNA末端加上定向EcoR Ⅰ/Hind Ⅲ接头并用EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ消化,使其两端分别带EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ黏性末端。用Mini Column纯化,收集300bp以上的双链cDNA片段,再连接于带有EcoR和Hind末端的T7 Select 10-3b载体,经体外包装后,以BLT5403为受体菌构建T7噬菌体展示cDNA文库。结果经测定,库容量为1.5×106pfu,扩增后文库滴度为1.1×1012pfu/ml。对从原始文库中随机挑取的100个噬菌斑进行PCR鉴定,重组率为91%,阳性克隆片段长度分布在200-1500bp,其中有90%的插入片段〉300bp。结论成功构建了东方田鼠肺脏T7噬菌体展示cDNA文库。

微小隐孢子虫T7噬菌体展示文库的构建

目的为筛选微小隐孢子虫保护性抗原基因,构建了微小隐孢子虫T7噬菌体展示文库。方法用Trizol试剂提取微小隐孢子虫总RNA,分离纯化mRNA,经反转录合成双链cDNA。在双链cDNA末端加上定向EcoRⅠ/HindⅢ接头,用EcoRⅠ和HindⅢ消化接头,使形成两端分别带有EcoRⅠ和HindⅢ粘性末端的双链cDNA。经Mini Column纯化,收集400bp以上的双链cDNA片段,将其连接于带有EcoRⅠ和HindⅢ末端的T7Select 10-3b载体,经体外包装后,以BLT5403为受体菌构建T7噬菌体展示文库。结果经测定,库容量为1.2×107pfu/mL,重组率为96.7%,扩增后文库滴度为2.4×1010pfu/mL。对随机挑取的100个噬菌斑进行PCR鉴定,92%的插入片段大于400bp。结论成功构建了微小隐孢子虫T7噬菌体展示文库。

用T7噬菌体展示技术筛选HCV核心蛋白的相互作用蛋白

目的用T7噬菌体筛选系统筛选HCV核心蛋白的相互作用蛋白。方法应用T7噬菌体展示技术,以通过原核表达的方式得到HCV的核心蛋白作为靶分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行筛选,对筛选到的克隆进行DNA序列分析及同源性搜索。结果经鉴定得到1个阳性克隆,确定了能与HCV核心蛋白相互作用的蛋白为:Smad interacting-protein 1(SIP1)。结论T7噬菌体展示筛选系统是筛选相互作用蛋白的一种简单、快速和有效的手段,筛选到的相互作用蛋白为进一步探讨核心蛋白的致病、致癌机制提供重要依据。

T7噬菌体DNA的提取及其反向遗传拯救方法的建立

从T7噬菌体培养液中粗提噬菌体颗粒,经热裂解后用苯酚、氯仿抽提进而获得纯净的T7噬菌体DNA。用PCR、酶切法鉴定T7噬菌体DNA的完整性。通过对不同感受态细菌浓度、T7噬菌体DNA用量、电转化电压条件的优化,建立了T7噬菌体反向遗传拯救方法。结果显示,提取的DNA结构完整,能够被特异性酶切割,多克隆位点序列正确。T7噬菌体的反向遗传拯救方法最优化条件为200 ng T7噬菌体DNA、1 ml 5×109感受态细菌、1.5 kV电转化电压,在此条件下获得的拯救效率为3.5×105 PFU/ng(DNA)。

新孢子虫cDNAT7噬菌体展示文库的构建及筛选

为筛选犬新孢子虫相关抗原,本研究利用T7噬菌体展示技术构建犬新孢子虫cDNA文库,并利用阳性血清筛选新型犬新孢子虫抗原蛋白。所构建的新孢子虫cDNA文库的原始文库重组克隆数为6×106pfu,扩增后文库滴度为3×1010pfu/mL。分别提取犬新孢子虫免疫小鼠血清和感染小鼠血清中的IgG,并利用纯化的IgG对构建的新孢子虫cDNA文库进行筛选。经过3轮筛选,共鉴定出14个不同的犬新孢子虫基因插入片段。经过分析,有7个基因编码的是功能未知蛋白,其它为蛋白质合成相关蛋白、核苷酸代谢相关蛋白、核糖体蛋白、微线体蛋白、棒状体蛋白和致密颗粒蛋白。对这些蛋白的进一步研究将有助于开发新孢子虫病的诊断试剂和疫苗。

抗乙型肝炎病毒表面抗原T7噬菌体抗体库的构建

构建T7噬菌体单链抗体(scFv)库筛选抗乙型肝炎病毒表面抗原抗体。从抗-HBs阳性患者外周血淋巴细胞中提取总RNA,反转录合成cDNA第1条链,PCR分别扩增抗体重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),经重叠延伸拼接(SOE)PCR组成scFv基因,并将其与T7噬菌体载体的2个臂相连接。体外包装后,在宿主菌BLT5403中,扩增重组噬菌体抗体库。以乙型肝炎病毒表面抗原进行4轮"吸附-洗脱-扩增"的筛选,酶免疫实验检测抗体活性。所建抗体库库容为1.53×107,扩增后初级库滴度为2.42×1010pfu/mL。以乙型肝炎病毒表面抗原筛选后抗体出现特异性富集,经酶免疫实验鉴定,得到2株与HBsAg抗原特异结合的噬菌体抗体,成功构建了抗HBsAg蛋白T7噬菌体抗体库。

家蚕中肠cDNA T7噬菌体展示文库的构建和免疫相关基因的淘选

中肠是昆虫重要的免疫防御器官之一。为探究家蚕中肠的分子免疫机制,尤其是针对不同病原体的模式识别分子或结合蛋白,以家蚕5龄第3天幼虫中肠为材料,构建家蚕中肠cDNA T7噬菌体展示文库,并分别以几丁质和脂多糖为配体,通过不同方法进行文库的生物淘选。结果共获得10个基因片段,其中在以脂多糖为配体的淘选中获得了β-1,3葡聚糖识别蛋白4,该分子是已知的模式识别受体。另外还获得了多个免疫相关候选基因,如分别编码几丁质结合蛋白、翻译控制的肿瘤蛋白、氨肽酶N、脂肪酰辅酶A结合蛋白等的几个基因。研究结果为深入开展家蚕中肠免疫功能的研究提供了重要线索。

携带16 kD抗原多肽的PP7噬菌体样颗粒的制备及其对结核病诊断的价值评估

目的获得表面展示有16kD抗原多肽(16kD91-110)的PP7噬菌体样颗粒(bacteriophage-like particle,BLPs),并评价其在结核病诊断中的价值。方法用普通PCR技术扩增出含16kD91-110多肽编码基因的PP7衣壳蛋白基因,将其插入到pETDuet-2PP7载体中,获得pETDuet-2PP7-16kD91-110质粒;将上述重组质粒转化大肠埃希菌,诱导表达产物用SDS-PAGE和western blot进行鉴定;将纯化的2PP7-16kD91-110作为刺激抗原,用ELISA间接法检测结核病患者血清中的16kD抗体水平。结果SDS-PAGE及电镜结果显示成功表达2PP7-16kD91-110BLPs,并且展示于PP7 BLPs表面的16kD91-110多肽表位能特异性与抗16kD抗体结合;对活动性肺结核和潜伏性肺结核患者,以2PP7-16kD91-110BLPs为刺激抗原的全血释放γ干扰素试验的敏感性分别为75%和82.9%,与北京万泰结核分枝杆菌相关γ干扰素释放试剂盒相比,差异无统计学意义。结论成功制备表面展示有16kD91-110多肽的PP7 BLPs,为应用γ干扰素释放试验检测结核分枝杆菌提供了一种安全性高、稳定性好、价格低廉的刺激抗原,为结核病的诊断提供一种新的思路。

O157∶H7原噬菌体消除菌株的鉴定与分析

目的 O15 7∶H7是一种重要的新发传染病病原 ,它主要引起出血性或非出血性腹泻 ,出血性结肠炎 (HC)或溶血性尿路综合征 (HUS)等。研究表明引起HC和HUS的主要毒力因子是由整合到O15 7基因组中的原噬菌体编码的志贺毒素(Stx) ,包括Stx1和Stx2 ,它们分别由原噬菌体 933v和 933w所编码。由于原噬菌体本身具有潜在的不稳定性 ,本研究以O15 7∶H786 - 2 4为始发菌株 ,将其进行传代培养 ,筛选原噬菌体消除菌株 ,对原噬菌体在O15 7基因组中的整合位点进行分析 ,并用Vero细胞对原噬菌体消除菌株的细胞毒性进行鉴定。结果筛选到了原噬菌体消除后的O15 7菌株 ,该菌株丧失了对Vero细胞的毒性作用。序列比较分析表明原噬菌体 933v的整合位点位于O15 7∶H7EDL933基因组中第 2 96 6 137位的相对位置 ,在整合位点两侧有一个 2 0bp的直接重复序列 ,原噬菌体 933w的整合位点位于基因组中第 1330 82 6位的相对位置 ,在整合位点两侧有一个 7bp的直接重复序列。该研究证实了编码Stx的原噬菌体具有不稳定性 ,原噬菌体对O15 7的致病性具有重要作用 ,也提示原噬菌体在致病菌的进化过程中也具有重要作用。

重组T7噬菌体生物学特性的研究

以大肠埃希菌BL21为宿主菌研究重组T7噬菌体生物学特性。将构建好的重组T7噬菌体扩增纯化，分析其对PH、温度及离子浓度的敏感性，并将重组噬菌体与宿主菌以不同比例混合测定最佳感染复数并绘制其一步生长曲线。结果表明，重组T7噬菌体的热稳定性较弱，在60℃时20min效价明显下降，在70℃时5min内即会全部失活；PH4～11的范围内重组T7噬菌体均可稳定存在；培养基中Mg件浓度为10mmol／L及Ca2＋浓度为5mmol／L时最有利于噬斑的形成，出斑率提高了约20％；重组噬菌体感染其宿主大肠埃希菌的最佳感染复数为10-5；其一步生长曲线的潜伏期约30min，裂解期约150min，裂解量为126pfu／cell。构建的重组T7噬菌体具有较强的裂解能力，潜伏期短，裂解量大，对理化因素稳定性好，为进一步大规模、高效率制造口蹄疫表位疫苗提供了理论基础。

表面展示GnRH重组T7噬菌体构建及其免疫效果

构建展示促性腺激素释放激素(GnRH)多肽的重组T7噬菌体,检测其对小鼠的免疫效果。人工合成GnRH多肽基因序列并用柔性Linker将其串联至3拷贝,然后克隆到T7 Select 415-1b噬菌体多克隆位点,构建重组噬菌体T7-3GnRH。经PCR鉴定并序列测定筛选阳性重组噬菌体,SDS-PAGE和Western-blot检测重组噬菌体表面GnRH多肽。重组噬菌体以每只1×1010PFU剂量免疫小鼠,免疫后不同时间段采血通过ELSIA检测血清中抗GnRH抗体,检测血清中睾酮含量,免疫后12周称体质量,剖检小鼠计算睾丸指数,进行睾丸的组织学观察。结果表明,成功构建了重组噬菌体T7-3GnRH,插入拷贝GnRH基因获得表面展示。噬菌体疫苗免疫后产生高水平抗GnRH抗体,其抗体发挥中和效应显著降低血清中睾酮含量。GnRH主动免疫抑制小鼠睾丸组织的发育,使睾丸萎缩,精子生成减少。获得了展示GnRH多肽的重组噬菌体,噬菌体疫苗免疫小鼠产生较高血清抗体并发挥良好的中和作用,为激素类小分子主动免疫做出有益探索。

KDR基因重组的T7噬菌体疫苗构建及其对小鼠Lewis肺癌抑制作用的研究

目的：构建KDR基因重组的T7噬菌体疫苗以及探讨其对小鼠Lewis肺癌的抗肿瘤作用。方法：克隆KDR的膜外Ⅱ区基因,构建KDR基因重组T7噬菌体疫苗,免疫小鼠,免疫四次后接种Lewis肺癌,观察肿瘤的生长情况,14 d后脱颈椎杀死小鼠,眼球取血、取出瘤体称重,计算抑瘤率,观察抗肿瘤效果。ELISA检测小鼠血清抗KDR抗体滴度。结果：实验组抑制程度明显,肿瘤生长速度最慢,肿瘤重量与生理盐水组和空白噬菌体组相比有统计学差异(P＜0．05),抑瘤率可达57．0%,远大于空白噬菌体组(16．0%)。小鼠血清稀释至1∶500,小鼠特异性抗人源KDR抗体仍呈阳性。结论：KDR基因重组的T7噬菌体疫苗对小鼠Lewis肺癌具有明显的抗肿瘤作用,用人源KDR作为免疫原免疫小鼠通过免疫交叉反应可以打破对自身抗原的免疫耐受,产生特异性的免疫反应。

鸡胚成纤维细胞cDNA T7噬菌体表达文库的构建和鉴定

构建鸡胚成纤维细胞(CEF)T7噬菌体表达型cDNA文库,为筛选和研究CEF上病毒受体分子奠定基础。提取纯化CEF的mRNA,反转录合成双链cDNA,补平末端,连接EcoRⅠ/HindⅢ接头,双酶切,凝胶过滤层析除去小于400bp的cDNA片段,合成双链cDNA定向与T7噬菌体左右臂连接,体外包装后建成cDNA表达文库。测定文库大小、重组率,并以PCR鉴定cDNA插入片段的大小。结果表明,构建的cDNA文库滴度为2.2×107pfu/mL、扩增后滴度为3.5×1010pfu/mL,重组效率达98%、插入片段多在0.4～3kb之间,平均插入片段长约1.3kb。表明所建文库具有很高的质量,从而为筛选目的cDNA克隆奠定了基础。

转运真核表达盒的重组T7噬菌体构建

为了构建转运真核表达盒的重组T7噬菌体,并分别在体外、体内条件下检测其标签蛋白质EGFP的表达。以T7噬菌体基因组左侧578 bp处为插入位点,取上游400 bp和下游200 bp片段作为左右同源臂,并在其中插入表达EGFP基因的真核表达盒(EEB),构建同源重组质粒p UC-L-EEB-R。将该质粒载体转化T7噬菌体宿主细菌BL21,在噬菌体繁殖过程中完成同源重组,PCR筛选重组T7-EEB噬菌体。提取该重组噬菌体基因组转染Vero细胞后体外检测EGFP蛋白质表达,纯化的噬菌体免疫小鼠后体内检测EGFP蛋白质表达。结果显示,通过同源重组方法成功构建了携带真核表达盒的重组T7噬菌体,PCR检测和酶切鉴定均证明表达盒已正确插入。T7-EEB基因组转染真核细胞可见明显的EGFP蛋白质表达,免疫小鼠后活体荧光检测到EGFP蛋白质信号,在小鼠肝脏、脾脏组织中RT-PCR检测到EGFP基因的mRNA转录。表明同源重组方法可以用于构建重组T7噬菌体,噬菌体能够转运真核表达盒并实现蛋白质表达。

东方田鼠肝脏T7噬菌体展示cDNA文库的构建

本项研究的目的是构建东方田鼠肝脏T7噬菌体展示cDNA文库,为筛选东方田鼠抗血吸虫病抗性相关基因奠定基础。用TRIzol试剂提取东方田鼠肝脏总RNA,分离纯化mRNA,经反转录合成双链cDNA。在双链cDNA末端加上EcoRⅠ/HindⅢ定向接头并用EcoRⅠ和HindⅢ酶切,使其两端分别带EcoRⅠ和HindⅢ粘性末端。用Mini Column纯化、收集300bp以上的双链cDNA片段,再连接于带有EcoRⅠ和HindⅢ末端的T7Select10-3b载体,经体外包装后,以BLT5403为受体菌构建T7噬菌体展示cDNA文库。经测定,库容量为1.3×107PFU/mL,扩增后文库滴度为1.8×1011PFU/mL。对从原始文库中随机挑取的100个噬菌斑进行PCR鉴定,重组率为91.7%,阳性克隆片段大小分布在200bp～1000bp,其中有95.5%的插入片段大于300bp。用日本血吸虫童虫可溶性抗原对文库进行了初筛,得到了21个ESTs,将这些阳性噬菌体克隆和血吸虫童虫共培养,其中大部分克隆诱导的童虫死亡率比阴性噬菌体对照高出2%～13%。