利用电穿孔法对狂犬病病毒SRV9 Ψ区缺失株病毒的拯救及鉴定

探讨电穿孔转染法对SRV9Ψ区缺失株重组病毒的拯救及鉴定。利用电穿孔细胞转染法,将纯化的Ψ区缺失株pcDNA-NPMG-L全长质粒和pcDNA-N、pcDNA-P、pcDNA-M、pcDNA-G和pcDNA-L辅助表达质粒共转染至BHK-21细胞中,并进行盲传,借助RT-PCR、间接免疫荧光试验、Western-blot及透射电子显微镜对重组病毒进行鉴定。结果显示,重组病毒能够产生绿色荧光,透射电子显微镜观察可见典型的弹状病毒,对重组毒株与亲本毒株G蛋白进行Western-blot验证,可获得相应目的条带。结果表明,通过电穿孔细胞转染法,能成功拯救出重组病毒SRV9Ψ区缺失株,为病毒的拯救提供新的转染方法,并能有效提高转染效率,为研发新型狂犬病疫苗提供参考。

狂犬病病毒修饰基因组的构建

【目的】利用反向遗传学技术在DNA水平上构建了狂犬病病毒修饰基因组。【方法】提取狂犬病病毒(Rabies Virus,RV)口服疫苗株SRV9基因组总RNA作为RT-PCR的扩增模板,并根据GenBank已发表的SRV9基因组序列设计引物,缺失狂犬病基因组Ψ区并在缺失位置插入人细胞色素C基因,再设计引物删除糖蛋白(G)胞质区(CD区)。缺失Ψ区及删除CD区时采用基因同源重组的方法进行。在缺失的Ψ区插入人细胞色素C基因时,利用引物引入酶切位点NheI和EcoRI,用PCR扩增出人细胞色素C基因并插入NheI和EcoRI位点。【结果】获得含预期的人细胞色素C基因,同时缺失了CD区与Ψ区的质粒pBSK-LA。【结论】全基因组测序结果表明已成功构建了狂犬病病毒修饰基因组。

狂犬病病毒SRV_9突变株的构建与拯救

为构建人工修饰的狂犬病病毒,首先用人细胞色素C基因替换狂犬病病毒SRV9株基因间隔区中的非必需区域Ψ区并缺失基因组全长cDNA的糖蛋白CD编码区,得到突变型SRV9cDNA质粒。然后,该质粒与表达野生型SRV9四种结构蛋白N、P、G和L的质粒共转染BHK-21细胞。免疫荧光试验显示转染细胞中有大量特异性荧光,电子显微镜观察可见大量典型的狂犬病病毒粒子。上述结果表明已成功地拯救出了人工修饰的狂犬病病毒。狂犬病病毒SRV9突变株的成功构建与拯救,为新型狂犬病减毒活疫苗的研究提供了重要的实验工具。